字向東，劉 霜，夏 威，熊顯榮，黃 林，張正帆，李志雄，李 鍵，鐘金城，王 利，朱江江

(1.西南民族大學生命科學與技術(shù)學院，成都 610041；2.西南民族大學青藏高原研究院，成都 610041)

牦牛(Bosgrunniens)是分布在海拔2 000～5 000 m以青藏高原為中心，及其毗鄰高山、亞高山地區(qū)的特有牛種。對高寒低氧的獨特適應能力決定了它在青藏高原畜牧業(yè)中不可替代的地位[1]。但是，相對于普通牛品種而言，牦牛生產(chǎn)生長速度慢，產(chǎn)肉性能和產(chǎn)奶性能都很低。利用普通牛(Bostaurus)優(yōu)良奶牛品種雜交改良牦牛繁殖的后代(犏牛)產(chǎn)奶性能成倍提高，深受牧民歡迎。但是，牦牛與普通牛種間雜交受胎率低[1-2]，體外受精(Invitrofertilization, IVF)的雜種胚胎發(fā)育率也不高[3-4]，其原因還不清楚。因此，研究犏牛胚胎發(fā)育調(diào)控機制，對提高牦牛種間雜交效率，完善犏牛胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)具有十分重要的意義。

胚胎發(fā)育是眾多基因表達在時間和空間上的聯(lián)系及配合共同作用的結(jié)果[5-8]，逐一研究每個候選基因的表達模式與胚胎發(fā)育的關(guān)系從效率上和可行性上都受到限制。目前，犏牛胚胎發(fā)育調(diào)控機制方面的研究尚屬空白。隨著RNA高通量測序技術(shù)的發(fā)展[9-10]和牦?；蚪M測序的完成[11]，為從組學水平研究犏牛胚胎發(fā)育的分子機制和保存提供了快速、有效的方法。因此，本研究擬用娟珊牛精子體外受精牦牛卵母細胞，通過體外培養(yǎng)獲得雜種胚胎，然后利用微量RNA高通量測序技術(shù)分析不同發(fā)育階段的犏牛胚胎轉(zhuǎn)錄組，揭示犏牛早期胚胎發(fā)育機制, 為提高犏牛胚胎體外生產(chǎn)效率提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 犏牛胚胎的生產(chǎn)

在屠宰場采集的牦牛卵巢放入盛有DPBS液(29～33 ℃)的保溫瓶中, 2 h內(nèi)運回到實驗室。參照X. Xiao等[4]的方法開展牦牛卵母細胞體外成熟(Invitromaturation, IVM)：將從直徑為2～8 mm的卵泡中抽取的卵丘-卵母細胞復合體(COC)放入含10% FCS、5 μg·mL-1FSH、50 IU·mL-1LH和1 μg·mL-117β-E2的TCM199液中，在38.5 ℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中成熟培養(yǎng)24 h。采用娟珊牛冷凍精液進行體外受精(IVF)。參照石仙等[12]的方法：用Vitrolife(瑞典)體外胚胎生產(chǎn)系列試劑在38.5 ℃、5% CO2、5% O2、90% N2、飽和濕度的三氣培養(yǎng)箱中進行精子體外獲能、IVF和胚胎的體外培養(yǎng)(Invitroculture, IVC)。在受精48 h的2-細胞、68～72 h的4-細胞、88～96 h的8-細胞，每個階段收集10枚發(fā)育良好的胚胎；受精第6 天的桑椹胚和第7天囊胚各收集1枚，提取RNA。

1.2 胚胎總RNA提取、cDNA文庫構(gòu)建及測序

采用RNeasy Micro Kit分別提取胚胎總RNA后，用Smart-Seq2方法[9]進行擴增：加入反應buffer、反轉(zhuǎn)錄酶、含公共序列的Oligo-dT引物和TSO引物，反應得到第一條cDNA鏈；不轉(zhuǎn)管，直接加入含共同序列的ISPCR引物和PCR擴增試劑，反應得到長度1～2 kb的第二條cDNA鏈。對富集擴增的cDNA采用Agilent 2100 High Sensitivity DNA Assay Kit檢測擴增產(chǎn)物cDNA樣品片段分布情況。峰圖顯示在1～2 kb片段長度存在明顯的目的產(chǎn)物主峰，表明原始樣本完整性較好，可以進行文庫構(gòu)建。每個樣本各選取20 ng擴增產(chǎn)物cDNA作為起始樣本構(gòu)建文庫。使用Bioruptor?Sonication System(Diagenode Inc.)進行樣本cDNA片段化，使之斷裂為200 bp左右的小片段。經(jīng)超聲打斷后，進行樣本cDNA末端修復、加 poly(A)并連接測序接頭，每步反應后使用Beckman Ampure XP磁珠進行純化。取接頭產(chǎn)物進行PCR擴增，樣本分別引入不同的Index標簽。最后用2%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物后,切取DNA片段的凝膠塊，使用CWBIO Gel Extraction Kit快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收DNA，再溶于EB緩沖液中，獲得測序文庫。用HiSeqTM2500進行高通量測序。

1.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

llumina HisSeqTM2500測序產(chǎn)生的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)Base calling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)(Raw Reads)，結(jié)果以FASTQ文件格式存儲，包含Reads的序列以及堿基的測序質(zhì)量。Raw Reads經(jīng)公共序列污染及酶切位點、Adapter污染、含N過多(>5%)、低質(zhì)量(Q≤19)以及比對到rRNA庫上的Reads過濾后，獲得純凈 Reads(Clean Reads)。采用TopHat v2.0.12軟件[13]將測序過濾后所得的Clean Reads與牦?；蚪M(http://me.lzu.edu.cn/yak)[11]進行比對分析，獲得唯一比對上參考基因的 Reads(Unique reads)。采用RPKM法(每百萬 Reads 中來自于某基因每千堿基長度的 Reads 數(shù)，Reads per kilobase transcriptome per million mapped Reads)計算基因表達量[14]，參照無生物學重復樣品的DEGseq法基因差異表達分析[15]，以|log2Ratio|≥1和Q<0.05為閾值, 篩選出不同發(fā)育階段間的差異表達基因(Differentially expressed genes, DEGs)。將DEGs與參考基因比較，得出DEGs顯著富集的Gene Ontology(GO)功能條目，并進一步挖掘出與DEGs顯著相關(guān)的生物學功能。然后將DEGs向GO數(shù)據(jù)庫(http://www.geneontology.org/)各個條目進行映射，計算其數(shù)目，用Y. Benjamini和Y. Hochberg方法[16]對P-value進行校正后，以Q-value<0.05為閾值定義DEGs中顯著富集的GO條目。通過與京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫(http://wego.genomics.org.cn)進行比對，對基因涉及的信號通路或代謝途徑(Pathway)進行分析。

1.4 差異表達基因熒光定量 PCR驗證

隨機選擇與發(fā)育相關(guān)的SKP1、CD63、ZAR1和H3等4個DEGs，采用Primer5.0軟件進行基因的定量引物設計(表1)，以1.2中反轉(zhuǎn)錄獲得的2-、4-、8-細胞、桑椹胚和囊胚的cDNA等體積混合，然后倍比稀釋，將稀釋的樣本作為模板，構(gòu)建其熒光定量標準曲線。qRT-PCR反應體系為10 μL：上下游引物各0.8 μL，Sso AdvancedTMSYBR?Green Super mix 5 μL，ddH2O 2.9 μL，cDNA模板0.5 μL。擴增條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃ 10 s、59.5 ℃ 20 s，35個循環(huán)。以H2A為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt計算基因的差異倍數(shù)。每個樣品設3次重復。

表1驗證RNA-Seq的qRT-PCR基因及其引物

Table1GenesandqPCRprimersusedforRNA-Seqvalidation

基因Gene正向引物(5'-3')Forwardprimer反向引物(5'-3')Reverseprimer產(chǎn)物長度/bpProductssizeH2AGCGTATTACCCCTCGTCACTCTTCTGTTGTCCTTTCTTTCC138SKP1ATCCAGTCCCCTTGCCAAATAGAGTGTCCCTTGGTCAACT173CD63AAGATTTTGAGTGCTGCGGGCCGCAATCTTCTCCACACAG164ZAR1GCTGGGAAAGTGCCTATGTGGAAGTTTCACTGGGCAGGAG158H3GCTCTGGAATGGGAGGTTCTTAGTACATCCCACGCCATCC219

2 結(jié) 果

2.1 體外受精效果與測序質(zhì)量分析

通過3個批次的重復試驗，IVF/IVC后雜種胚胎的平均卵裂率為78.4%，囊胚率為36.3%，說明采用的IVF/IVC體系效果好，測序結(jié)果能代表正常胚胎轉(zhuǎn)錄組水平。通過分析堿基的組成和質(zhì)量值分布可以控制原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量。本研究中2-、4-、8-細胞、桑椹胚和囊胚 5 個發(fā)育時期的犏牛胚胎 RNA 樣本測序所得原始數(shù)據(jù)的堿基質(zhì)量分布和堿基含量分布良好，且Q30>85%，說明測序質(zhì)量較好。原始數(shù)據(jù)經(jīng)過濾后獲得47 791 850(8-細胞)～63 332 216(4-細胞)條 Clean Reads。將 Clean Reads與牦?；蚪M比對，有80.00%(囊胚)～91.13%(2-細胞)的序列可被牦?；蚪M注釋，比對到基因組多位的Reads比例為3.86%～5.24%(表2)。

表2測序和比對結(jié)果概述

Table2TheresultsofRNA-seqandmappingtothereferencegenome

比對數(shù)據(jù)Mappeddata2-細胞2-cell4-細胞4-cell8-細胞8-cell桑椹胚Morula囊胚Blastocyst干凈數(shù)據(jù)序列數(shù)CleanReads6088044663332216477918505492401849296682比對上基因組的序列數(shù)MappedReads5547920556339924430873724899907139435615比對上基因組的Reads比例/%Mappingrate91.1388.9690.1689.2180.00未比對到基因組的Reads數(shù)UnmappedReads54012416992292470447859249479861067比對到基因組多位點的Reads數(shù)Multi-mapReads25187072643767221959321191722583620比對到基因組多位點的Reads比例/%Multi-maprate4.144.174.643.865.24

2.2 犏牛胚胎的基因表達的分析

采用RPKM法[14]計算基因表達量的結(jié)果表明，犏牛胚胎從2-細胞期發(fā)育到囊胚期每個階段有9 604(桑椹胚)～15 400(4-細胞)個表達基因；共有19 072個基因表達，其中7 785個為共表達基因，11 287個為階段特異表達基因。4-細胞開始表達的基因數(shù)目最多(1 606個)，而桑椹胚開始表達的基因數(shù)目最少(148個)。隨著胚胎發(fā)育的進行，BMP15、GDF9和ZP4等母源基因的表達量降低，而ATP5B、UBEA3和SNURF等胚胎基因的開始表達且表達量不斷增加(圖1)。以|log2Ratio|≥1和Q<0.05為篩選條件篩選不同發(fā)育階段間的DEGs，結(jié)果表明,桑椹胚～囊胚的DEGs最多(10 298個)，而2-～4-細胞胚的DEGs最少(3 690個)(表3)。

圖1 母源基因(A)和胚胎基因(B)的表達變化趨勢Fig.1 The expression tendency of maternal genes (A) and embryonic genes (B)

表3犏牛胚胎在不同發(fā)育階段的基因表達分析統(tǒng)計表

Table3Geneexpressionatthedifferentdevelopmentalstagesofcrossbredembryosoftheyak

項目Item2-細胞2-cell4-細胞4-cell8-細胞8-cell桑椹胚Morula囊胚Blastocyst表達的基因數(shù)Expressedgenes144911540013792960411860新轉(zhuǎn)錄本Noveltranscripts496564747441519首次表達的基因數(shù)1sttimeexpressedgenes-1606390148535差異表達基因數(shù)Diferetiallyexpressedgenes36906332896510298上調(diào)基因數(shù)Up-regulatedgenes2861205829085747下調(diào)基因數(shù)Down-regulatedgenes829427460574551

2.3 差異表達基因的 qRT-PCR驗證

為了進一步驗證轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果的可靠性，選出4個基因，采用qRT-PCR 技術(shù)進行表達驗證，結(jié)果表明，RNA-seq測序結(jié)果與qRT-PCR的結(jié)果基本一致(圖 2)。說明本研究利用RNA-seq技術(shù)分析基因的結(jié)果是可靠的。

圖2 差異表達基因的qRT-PCR與RNA-seq結(jié)果的對比Fig.2 Comparison of the differentially expressed genes between qRT-PCR and RNA-seq

2.4 差異表達基因的 GO 分類和顯著性富集分析

GO分析顯示(圖3)，從2-～4-細胞、4-～8-細胞、8-細胞～桑椹胚及桑椹胚～囊胚4個發(fā)育階段分別有3 461(占93.8%)、5 972(占94.3%)、8 438(占94.1%)和9 749(占94.7%)個DEGs得到歸類注釋，都涉及生物過程(Biological process，BP)、細胞組分(Cellular component，CC)和分子功能(Molecular function，MF)3大類67個二級條目。在BP分類中有23個二級條目，其中占比例最大的4個二級條目在4個發(fā)育階段相同，從高到低依次為細胞過程(Cellular process)、單有機體過程(Single-organism process)、生物調(diào)節(jié)(Biological regulation)和代謝過程(Metabolic process)。但是，各發(fā)育階段第5個二級條目開始出現(xiàn)差異。在CC分類中有22個二級條目，二級條目中細胞部分(Cell part)占比例最多，其次為細胞器 (Organelle)及細胞器部件(Organelle part)，前10個二級條目的排序在各發(fā)育階段相同，但從第11個二級條目開始排序在不同發(fā)育階段出現(xiàn)差異。在MF分類中有22個二級條目，占比例最大的2個二級條目在4個發(fā)育階段完全相同，依次是綁定分子(Binding)所占比例最多和催化活性(Catalytic activity)，但從第3個二級條目開始排序在不同發(fā)育階段出現(xiàn)差異。

2.5 差異表達基因的代謝路徑分析

犏牛胚胎發(fā)育過程中差異表達基因KEGG分析表明，2-～4-細胞涉及到300條通路(Pathways)，4-～8-細胞有302條通路，8-細胞～桑椹胚有314條通路，桑椹胚～囊胚有314條通路，各發(fā)育階段的富集前5條通路(Top 5 pathways)如表4所示，每個階段的通路種類及富集性都有差異。2-～4-細胞、4-～8-細胞、8-細胞～桑椹胚和桑椹胚～囊胚4個階段分別有15、0、18和1條通路顯著富集(Q<0.05)。

3 討 論

本研究利用RNA-seq技術(shù)從轉(zhuǎn)錄組學的角度揭示了犏牛早期胚胎發(fā)育機制, 為完善犏牛胚胎體外生產(chǎn)，提高犏牛胚胎體外生產(chǎn)效率具有重要價值。普通牛從2-細胞～囊胚，每個胚胎的總RNA只有200～2 000 pg[17]。犏牛胚胎應該與此相近，這樣微量RNA不能滿足轉(zhuǎn)錄組測序文庫的構(gòu)建及高通量測序的基本要求，因此，分別提取每個發(fā)育階段的犏牛早期胚胎總RNA后，使用Smart-Seq2擴增技術(shù)對樣本進行富集并構(gòu)建測序文庫[9]，再應用RNA高通量測序技術(shù)對其進行高通量測序分析。通過從擴增產(chǎn)物cDNA樣品片段分布、堿基的組成和質(zhì)量值分布、Q30、飽和量、qRT-PCR驗證等全面分析的結(jié)果表明，以犏牛胚胎微量RNA作為模板，采用Smart-Seq2擴增技術(shù)與RNA-seq技術(shù)相結(jié)合開展犏牛胚胎轉(zhuǎn)錄組高通量測序分析，結(jié)果可靠。

犏牛胚胎從2-細胞發(fā)育到囊胚每個階段有9 604(桑椹胚)～15 400(4-細胞胚)個表達基因。與普通牛[18-19]和牦牛的胚胎[20]比較，犏牛桑椹胚的轉(zhuǎn)錄本少。這可能是由于犏牛胚胎為種間雜種胚胎，胚胎的遺傳信息決定了在這一階段不可避免地出現(xiàn)“發(fā)育阻滯”現(xiàn)象，也有可能是胚胎體外培養(yǎng)條件的不完善引起“體外發(fā)育阻滯”[21]。可以通過對體內(nèi)發(fā)育的犏牛胚胎的轉(zhuǎn)錄組進一步深入研究，探明原因。如果確認為“體外發(fā)育阻滯”，則可以通過優(yōu)化胚胎培養(yǎng)條件得到改善。犏牛胚胎從2-細胞發(fā)育到囊胚共有19 072個基因表達，其中7 785個為共表達基因，11 287個為階段特異表達基因。4-細胞開始表達的基因數(shù)目最多(1 606個)，而桑椹胚開始表達的基因數(shù)目最少(148個)，顯示胚胎發(fā)育是眾多基因表達在時間和空間上的聯(lián)系和配合共同作用的結(jié)果，不是單個基因控制的。但是，有些基因在胚胎發(fā)育的特異階段發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用，例如，NANOG能調(diào)控合子基因組的激活, 缺乏NANOG的胚胎合子基因組激活率低，發(fā)育受阻[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，與普通牛[7,18-19]和牦牛胚胎[20]一樣，犏牛胚胎NANOG基因在8-細胞開始表達。CLDN4是Claudin蛋白家族的成員之一，婦女黃體期子宮內(nèi)膜CLDN4 mRNA的表達量與妊娠相關(guān)[23]，囊胚中基因的表達與囊胚的發(fā)育與附植相關(guān)[24]。推測CLDN4基因在犏牛囊胚中開始表達，可能在囊胚發(fā)育和妊娠的建立中發(fā)揮重要作用。早期胚胎的發(fā)育受到由來自卵母細胞發(fā)生及成熟期間合成的大量轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)的調(diào)控[7,18-19,25]，但隨著發(fā)育的進行，母源轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)降解，而胚胎基因組激活(Embryonic genome activation, EGA)，發(fā)育從母型調(diào)控向胚胎型調(diào)控的過渡(Maternal-to-embryonic transition, MET)。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著胚胎發(fā)育的進行，犏牛胚胎的BMP15、GDF9、ZP4和ZP3等母源基因表達量逐漸減少，而ATP5B、UBEA3和SNURF等胚胎基因的開始表達且表達量不斷增加(圖2)，這與在其它物種的研究結(jié)果一致[7,18-19,26]。

A.2-～4-細胞；B.4-～8-細胞；C.8-細胞～桑椹胚；D.桑椹胚～囊胚A.2-cell-4-cell; B.4-cell-8-cell; C.8-cell-morula; D.Morula-blastocyst圖3 犏牛早期胚胎發(fā)育過程中的差異表達基因GO分類注釋圖Fig.3 Gene Ontology classification of the DEGs of 4 developmental stages of crossbred embryos of the yak

表4牦牛胚胎發(fā)育過程中差異表達基因富集前5(Top5)KEGG通路

Table4Top5ofenrichedKEGGpathwaysofDEGsduringdevelopmentofcrossbredembryosoftheyak

發(fā)育階段DevelopmentstageKEGG通路KEGGpathway上調(diào)基因Up-regulatedgenes下調(diào)基因Down-regulatedgenesQ-值Q-value2-細胞～4-細胞2-cell-4-cell泛素介導調(diào)節(jié)Ubiquitinmediatedproteolysis1020.0005內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工蛋白Proteinprocessinginendoplasmicreticulum1920.0081細胞周期Cellcycle1410.0152剪切體Spliceosome1410.0176RNA轉(zhuǎn)運RNAtransport1630.02364-細胞～8-細胞4-cell-8-cell基底細胞癌Basalcellcarcinoma7190.0572RNA轉(zhuǎn)運RNAtransport10300.0572系統(tǒng)性紅斑狼瘡Systemiclupuserythematosus33220.0798神經(jīng)活性配體-受體互作Neuroactiveligand-receptorinteraction20480.0798剪切體Spliceosome15190.07988-細胞～桑椹胚8-cell-morula核糖體Ribosome13561.63E-13氧化磷酸化機制Oxidativephosphorylation21311.82E-06亨廷頓氏病Huntington'sdisease31531.88E-06RNA轉(zhuǎn)運RNAtransport18461.52E-05神經(jīng)活性配體-受體互作Neuroactiveligand-receptorinteraction18538.03E-05桑椹胚～囊胚Morula-blastocystRNA轉(zhuǎn)運RNAtransport61340.0387核糖體Ribosome17340.1013內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工蛋白Proteinprocessinginendoplasmicreticulum72390.1799核苷酸切除修復Nucleotideexcisionrepair17100.1799氨基酸合成Biosynthesisofaminoacids29100.1799

以|log2Ratio|≥1和Q<0.05為篩選條件篩選出桑椹胚～囊胚的DEGs最多(10 298個)，而2-～4-細胞胚的DEGs最少(3 690個)(表3)。GO分析顯示，從2-～4-細胞、4-～8-細胞、8-細胞～桑椹胚及桑椹胚～囊胚4個發(fā)育階段分別有3 461、5 972、8 438和9 749個DEGs(占DEGs數(shù)目的94%左右)得到歸類注釋，都涉及生物過程(BP)、細胞組分(CC)和分子功能(MF)3大類67個二級條目(圖3)。在BP分類中，比例最大的4個二級條目在4個發(fā)育階段都相同，但各發(fā)育階段第5個二級條目開始出現(xiàn)差異；在CC分類中前10個二級條目的排序在4個發(fā)育階段都相同，但從第11個二級條目開始在不同發(fā)育階段出現(xiàn)差異；在MF分類中，只有占比例最大的2個二級條目在4個發(fā)育階段都相同，但從第3個二級條目開始排序在不同發(fā)育階段出現(xiàn)差異。說明在犏牛胚胎發(fā)育過程中，胚胎細胞組分相對穩(wěn)定，但細胞內(nèi)分子過程和分子功能在不斷地發(fā)生變化。例如，分子功能調(diào)節(jié)器(Molecular function regulator)具有調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物活性的功能，它從2-～4-細胞和4-～8-細胞位列BF分類中的第5位上調(diào)到8-細胞～桑椹胚中的第4位和桑椹胚～囊胚中的第3位。

本研究發(fā)現(xiàn), 犏牛早期胚胎發(fā)育過程中DEGs富集的主要通路有剪接體(Spliceosome)、神經(jīng)活性配體-受體互作(Neuroactive ligand-receptor interaction)、細胞因子及其受體相互作用(Cytokine-cytokine receptor interactions)、泛素介導的蛋白水解(Ubiquitin mediated proteolysis)、RNA轉(zhuǎn)運(RNA transport)、核糖體(Ribosome)等(表4)，這與在其它動物的發(fā)現(xiàn)基本一致[22,27-28]，說明這些通路在犏牛胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

4 結(jié) 論

本研究首次利用RNA-Seq技術(shù)從轉(zhuǎn)錄組學揭示犏牛早期胚胎發(fā)育機制, 獲得了眾多差異基因和有關(guān)通路的富集，為完善犏牛胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。

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