沈克飛，許國洋，胡瑞思，徐登峰，楊 睿，付利芝，張素輝*

(1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100)

化膿隱秘桿菌是革蘭陽性菌，主要寄生在動(dòng)物上呼吸道、消化道、生殖道等黏膜，是和化膿性感染相關(guān)聯(lián)的機(jī)會(huì)性病原體[1-3]?；撾[秘桿菌是山羊呼吸道疾病和體表淋巴結(jié)炎的重要病原之一，病羊表現(xiàn)漸進(jìn)性消瘦、流產(chǎn)等癥狀，病理組織學(xué)變化為化膿性炎癥[4-5]。

細(xì)菌定植于宿主組織是感染發(fā)生的關(guān)鍵一步。在感染過程中，許多病原菌產(chǎn)生蛋白質(zhì)以促進(jìn)細(xì)菌黏附。微生物表面識別黏附基質(zhì)分子成分(microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules，MSCRAMM)是一類與宿主細(xì)胞外基質(zhì)成分相互作用的蛋白質(zhì)家族，導(dǎo)致細(xì)菌黏附宿主[6]。MSCRAMM屬于一類具有類似結(jié)構(gòu)的細(xì)胞壁錨定蛋白質(zhì)，N端由信號序列、配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個(gè)或多套重復(fù)多肽組成，C端有細(xì)胞壁錨定結(jié)構(gòu)域?；撾[秘桿菌的膠原結(jié)合蛋白(collagen-binding protein，Cbp)CbpA是MSCRAMM中一員，具有MSCRAMM基本序列特征，能黏附多型膠原和多種細(xì)胞，在細(xì)菌黏附中發(fā)揮重要作用[7]。病原體常以真核細(xì)胞表面的氨基葡聚糖(glycosaminoglycan)(如肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素等多糖)作為黏附受體[8-11]。

山羊化膿隱秘桿菌重慶分離株2012CQ-ZSH(GenBank登錄號CP012649)已完成基因組測序[12]。序列比對顯示，其CbpA(CbpA-CQ)基因與已公布化膿隱秘桿菌的CbpA基因在5′端無明顯相似性。為了揭示其分子特性，本研究對CbpA-CQ進(jìn)行序列分析，并鑒定了其中2個(gè)潛在的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌HeLa細(xì)胞株、山羊化膿隱秘桿菌重慶分離株2012CQ-ZSH由重慶市畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存和提供；新生胎牛血清、Roswell Park Memoria Institute-1640(RPMI-1640)培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購自Hyclone公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；肝素、還原性谷胱甘肽購自GE Healthcare公司；GST小鼠單克隆抗體(GST2)、堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(完整分子)抗體購自Sigma公司，Gluthathione-Sepharose 4B購自Pharmacia公司；BCTP/NBT購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 序列分析 將CbpA-CQ基因在NCBI上作BLAST搜索以進(jìn)行同源性分析，使用在線軟件(http://web.expasy.org/translate/)翻譯基因，查找蛋白質(zhì)序列中的堿性氨基酸，預(yù)測CbpA-CQ的跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽(http://phobius.sbc.su.se)，進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)。采用MEGA 4軟件中的鄰接法(neighbor-joining method, NJ)構(gòu)建CbpA-CQ進(jìn)化樹。

1.2.2 基因克隆 為了分析功能，設(shè)計(jì)了2對引物分別擴(kuò)增CbpA-CQ的N端富含堿性氨基酸區(qū)域NRB和膠原結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域B1(圖1)的編碼序列。引物序列分別為CbpAF1：5′-GGATCCGTGAGCCCTGGGAAAAGTTA-3′，CbpAR1：5′-CTCGAGAGGCAATAGTTTACCCGAGA-3′；CbpAF2: 5′-GGATC-CGTTACCGTATCTGTTGAGAAGATG-3′，CbpAR2: 5′-CTCGAGGTAAGTGTTGACCACCGTAAA-3′。引物序列中斜體分別為BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。使用細(xì)菌 DNA 試劑盒提取化膿隱秘桿菌基因組DNA。PCR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer (含15 mmol·L-1Mg2+)2.5 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 0.5 μL，5 U·μL-1rTaq 0.10 μL，10 μmol·L-1上、下游引物各0.5 μL，cDNA 0.5 μL，用去離子水補(bǔ)足25 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸25 s，共進(jìn)行30循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min。目的片段經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒回收后克隆到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化入DH5α。經(jīng)序列測定的重組質(zhì)粒使用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，將酶切下的目的基因與經(jīng)同樣雙酶切pGEX-4T-1連接構(gòu)建表達(dá)載體pGEX-NRB和pGEX-B1，轉(zhuǎn)化入DH5α，篩選陽性克隆提取重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化入DE3用于誘導(dǎo)表達(dá)。預(yù)測GST融合蛋白GST-NRB和GST-B1的相對分子質(zhì)量為44 和33 ku。

1.2.3 誘導(dǎo)表達(dá) 37 ℃下振搖培養(yǎng)至菌體濃度達(dá)OD600 nm約為1時(shí)，加入終濃度0.1 mmol·L-1IPTG，37 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)3 h。培養(yǎng)物4 ℃下5 000 r·min-1離心30 min，沉淀用PBS洗滌3次。每100 mL培養(yǎng)液加20 mL PBS以懸浮菌體沉淀，冰水浴中超聲裂解菌懸液(超聲功率為300 W，工作4 s間歇5 s，超聲裂解15 min)。裂解物12 000 r·min-1離心10 min，采用免疫印跡(GST小鼠單克隆抗體)檢測上清中的GST融合蛋白。

1.2.4 蛋白質(zhì)純化 純化上清中的可溶性重組蛋白質(zhì)。向裂解物中加入終濃度1% Trition X-100，4 ℃振搖孵育30 min，5 000 r·min-1離心30 min，收集上清。每20 mL上清加入300 μL Gluthathione-Sepharose 4B，4 ℃攪動(dòng)孵育1 h。PBS洗滌3次后用10 mmol·L-1還原性谷胱甘肽洗脫，采用透析法去除其中的還原性谷胱甘肽。利用SDS-PAGE分析純化效果。

1.2.5 細(xì)菌黏附抑制試驗(yàn) 在6孔培養(yǎng)板內(nèi)放入細(xì)胞爬片進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察爬片上細(xì)胞生長至60%時(shí)停止培養(yǎng)，用RPMI-1640洗貼壁細(xì)胞3次。加入RPMI-1640洗滌的新鮮化膿隱秘桿菌(109·mL-1)，10 μL·孔-1；加入肝素溶液(RPMI-1640溶液配制)，使用RPMI-1640溶液將每孔溶液補(bǔ)足至1 mL，肝素終質(zhì)量濃度依次為13.8、3.6、1.2、0.4、0.13、0 mg·mL-1。37 ℃放置1 h。棄去懸浮液，加入RPMI-1640溶液振搖洗3次。甲醛固定10 min，PBS洗2次。取出爬片，在爬片上滴一滴結(jié)晶紫溶液染色1 min，用蒸餾水沖洗干凈，待爬片干燥后觀察。

1.2.6 融合蛋白黏附試驗(yàn) 用胰酶(0.05%胰酶，0.02% EDTA)消化長滿單層的HeLa細(xì)胞，用RPMI-1640洗3次，將細(xì)胞制備成1010·mL-1備用。將蛋白質(zhì)(GST、GST-NRB或GST-B1)的質(zhì)量濃度調(diào)整為1 mg·mL-1。按表1加入各組分，每組按蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度分為4個(gè)濃度梯度，依次為0、0.05、0.15和0.75 mg·mL-1。顛倒混勻各組分，4 ℃下緩慢搖動(dòng)孵育1 h。4 ℃下800 r·min-1離心10 min，沉淀用1 mL 預(yù)冷PBS洗3次。樣本經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗3次后與GST單克隆抗體(1∶5 000)孵育，TBST洗3次后與堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)孵育，最后置BCTP/NBT中顯色。

1.2.7 融合蛋白黏附抑制試驗(yàn) 按上述方法制備細(xì)胞和肝素溶液。按表2加入各組分，每組按肝素濃度分為4個(gè)質(zhì)量濃度梯度，依次為0、13.29、39.69、118.80 mg·mL-1?；靹?，4 ℃下緩慢搖動(dòng)孵育1 h，其間注意翻轉(zhuǎn)離心管以使細(xì)胞不沉降。4 ℃下800 r·min-1離心10 min保留沉淀。按上述方法進(jìn)行免疫印跡分析。

表1融合蛋白細(xì)胞黏附分析

Table 1 Cell adhesion assay of fusion proteins μL

表2肝素抑制融合蛋白黏附細(xì)胞分析

Table2Heparininhibitstheadhesionoffusionproteinstocells

μL

2 結(jié) 果

2.1 序列分析

CbpA-CQ基因全長3 456 bp，編碼1 151個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。BLAST結(jié)果顯示，CbpA-CQ在膠原結(jié)合蛋白重復(fù)B結(jié)構(gòu)域部分與化膿隱秘桿菌、鏈球菌屬等細(xì)菌有同源性，覆蓋率為55%，其編碼基因也僅在這部分與上述細(xì)菌有同源性。

在CbpA-CQ中，共有38 R、97 K和17 H，堿性氨基酸含量為13.2%(152/1151)(圖1)。保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，CbpA-CQ含有7個(gè)膠原結(jié)合蛋白B重復(fù)結(jié)構(gòu)域?？缒そY(jié)構(gòu)域和信號肽預(yù)測結(jié)果顯示，在CbpA-CQ的N端有信號肽，羧基端有跨膜結(jié)構(gòu)域(圖1)。分子系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，CbpA-CQ與化膿隱秘桿菌的CbpA在進(jìn)化樹中聚集成一個(gè)進(jìn)化支(圖2)。

2.2 融合蛋白質(zhì)的可溶性表達(dá)分析

免疫印跡分析顯示，重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在裂解物上清中可見相對分子質(zhì)量分別約44和33 ku的目的條帶，大小與預(yù)期相符，表明融合蛋白GST-NRB和GST-B1有可溶性表達(dá)(圖3)。

信號肽切割位點(diǎn)以箭頭標(biāo)注。用于表達(dá)的氨基酸序列為斜體和加粗字體，7個(gè)重復(fù)B結(jié)構(gòu)域用下劃線標(biāo)注，跨膜結(jié)構(gòu)域被加框The predicted signal peptide cleavage site is denoted by the vertical arrow. The amino acid sequence expressed is in italic and bold, seven repeat B domains are underlined, and the intervening membrane-spanning domain is boxed圖1 CbpA-CQ的序列分析Fig.1 Sequence analysis of CbpA-CQ

●. CbpA-CQ圖2 CbpA-CQ及其相似蛋白質(zhì)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of CbpA-CQ and similar proteins

M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. GST-NRB；2.GST-B1；3.GST-NRBM. Protein marker; 1. GST-NRB; 2.GST-B1; 3.GST-NRB圖3 菌體裂解物上清的融合蛋白質(zhì)Western blot鑒定(GST單克隆抗體)Fig.3 Detection of fusion proteins by Western blot (GST mAb) in the supernatant of the induced bacteria lysate

2.3 融合蛋白質(zhì)純化

SDS-PAGE分析顯示，采用Gluthathione-Sepharose 4B從裂解物上清中純化得到融合蛋白質(zhì)GST-NRB和GST-B1(圖4)。

2.4 肝素抑制化膿隱秘桿菌黏附細(xì)胞

結(jié)晶紫染色觀察顯示，共同孵育后，山羊化膿隱秘桿菌重慶株黏附到HeLa細(xì)胞表面；肝素、化膿隱秘桿菌、細(xì)胞共同孵育后，在肝素質(zhì)量濃度為0.13～13.8 mg·mL-1間，HeLa細(xì)胞表面的化膿隱秘桿菌數(shù)量隨肝素劑量遞增而遞減(圖5)。

M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. GST；2. GST-B1；3. GST-NRB M. Protein marker; 1. GST; 2. GST-B1; 3. GST-NRB圖4 融合蛋白質(zhì)的純化Fig.4 Purification of fusion proteins

2.5 融合蛋白質(zhì)黏附細(xì)胞及肝素抑制黏附

免疫印跡顯示，GST未與HeLa細(xì)胞發(fā)生黏附，GST-NRB、GST-B1與HeLa細(xì)胞孵育后，出現(xiàn)特異條帶，且條帶亮度隨GST-NRB、GST-B1劑量的增加而增加，表現(xiàn)出良好的劑量依賴關(guān)系(圖6)，

肝素劑量：13.8(A)、3.6(B)、1.2(C)、0.4(D)、0.13(E)、0(F)mg·mL-1Heparin dose: 13.8 (A), 3.6 (B), 1.2 (C), 0.4 (D), 0.13 (E) and 0 (F) mg·mL-1圖5 肝素抑制山羊化膿隱秘桿菌重慶株黏附HeLa細(xì)胞Fig.5 Heparin inhibits the adhesion of T. pyogenes Chongqing isolate from goat to HeLa cells

A. GST-NRB；B. GST-B1。1. GST；2～5. 0、0.05、0.15和0.75 mg·mL-1蛋白質(zhì)A. GST-NRB; B. GST-B1. 1. GST; 2-5. Protein concentration: 0, 0.05, 0.15 and 0.75 mg·mL-1, respectively圖6 GST-NRB和GST-B1黏附HeLa細(xì)胞分析Fig.6 Adhesion assay of GST-NRB and GST-B1 to HeLa cells

表明GST-NRB、GST-B1與HeLa細(xì)胞發(fā)生特異性黏附，且黏附與標(biāo)簽GST無關(guān)。肝素與HeLa細(xì)胞、GST-NRB或GST-B1孵育后，免疫印跡中的特異條帶亮度隨肝素質(zhì)量濃度降低而升高，表現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系(圖7)，表明肝素對GST-NRB、GST-B1黏附細(xì)胞的抑制作用是特異的。

A. GST-NRB；B. GST-B1。1～4. 0、13.29、39.69和118.80 mg·mL-1肝素A. GST-NRB; B. GST-B1. 1-4. Heparin concentration: 0, 13.29, 39.69 and 118.80 mg·mL-1, respectively圖7 肝素抑制GST-NRB 和GST-B1黏附HeLa細(xì)胞分析Fig.7 Heparin inhibits the adhesion of GST-NRB and GST-B1 to HeLa cells

3 討 論

序列分析結(jié)果顯示，CbpA-CQ基因及其編碼的蛋白質(zhì)盡管在前半部分有超過40%的序列與已知菌株無同源性，但Cbp-CQ具有MSCRAMM 家族典型的分子特征，即N端含有信號序列、配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、C端有細(xì)胞壁錨定結(jié)構(gòu)域等[6]，與化膿隱秘桿菌的同源性最高，在進(jìn)化樹中與化膿隱秘桿菌構(gòu)成一個(gè)獨(dú)立進(jìn)化分支。研究指出化膿隱秘桿菌的CbpA可黏附多種細(xì)胞，在黏附宿主細(xì)胞上發(fā)揮重要作用[7]。我們的結(jié)果證實(shí)CbpA-CQ的NRB和B1結(jié)構(gòu)域可黏附HeLa細(xì)胞，提示其在功能上可能與化膿隱秘桿菌其他菌株的CbpA一樣在黏附宿主細(xì)胞上發(fā)揮作用。

黏附宿主細(xì)胞是感染發(fā)生的關(guān)鍵階段。在過去的研究中，人們發(fā)現(xiàn)細(xì)菌、病毒、寄生蟲等病原體特異黏附真核細(xì)胞表面的氨基葡聚糖分子，是黏膜感染的主要機(jī)制之一[8-11]。本研究觀察到肝素可競爭性抑制山羊化膿隱秘桿菌重慶株黏附HeLa細(xì)胞，表明肝素分子介導(dǎo)細(xì)菌黏附HeLa細(xì)胞，提示化膿隱秘桿菌也利用這一一般策略以實(shí)現(xiàn)感染動(dòng)物。

氨基葡聚糖結(jié)合蛋白在細(xì)菌生長和培養(yǎng)過程中表達(dá)，微生物利用氨基葡聚糖結(jié)合蛋白黏附、入侵宿主[13]。蛋白質(zhì)與肝素類似物黏附的分子基礎(chǔ)，是配體蛋白分子上帶正電荷的氨基酸簇與肝素類似物的負(fù)電荷形成離子鍵，帶正電荷的氨基酸簇與疏水性氨基酸相靠近[14]，疏水性氨基酸側(cè)鏈和肝素類似物的非極性基團(tuán)間的相互作用穩(wěn)定了蛋白質(zhì)和聚糖的作用[15]。暴露在結(jié)構(gòu)域表面的富含賴氨酸基序在配體分子與肝素或硫酸乙酰肝素結(jié)合上起主要作用，而其他區(qū)域或結(jié)構(gòu)域?qū)Y(jié)合有穩(wěn)定或促進(jìn)作用[15-17]。這樣，盡管肝素結(jié)合蛋白的功能、空間構(gòu)象可能不同，但它們都具有肝素結(jié)合基序(motif)暴露在結(jié)構(gòu)域表面。因此，在蛋白質(zhì)序列中帶正電荷的區(qū)域尤其是含有賴氨酸簇區(qū)域是肝素分子的潛在結(jié)合位點(diǎn)。CbpA是堿性氨基酸含量高的蛋白質(zhì)，可能是肝素結(jié)合蛋白。為了鑒定肝素結(jié)合域，本研究選擇了CbpA-CQ中富含堿性氨基酸的NRB和B1區(qū)域，通過黏附試驗(yàn)和黏附抑制試驗(yàn)證實(shí)NRB和B1是肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其與HeLa細(xì)胞的黏附受肝素介導(dǎo)。

4 結(jié) 論

運(yùn)用生物信息學(xué)軟件分析山羊化膿隱秘桿菌重慶分離株的膠原結(jié)合蛋白(CbpA-CQ)基因及其編碼產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)重慶株CbpA有7個(gè)膠原結(jié)合蛋白B結(jié)構(gòu)域，約占全長的55%，此結(jié)構(gòu)域與化膿隱秘桿菌、鏈球菌屬等細(xì)菌有同源性，具有已知化膿隱秘桿菌CbpA的共同序列特征；CbpA-CQ的NRB和B1結(jié)構(gòu)域可黏附HeLa細(xì)胞，其NRB和B1區(qū)域?yàn)楦嗡亟Y(jié)合結(jié)構(gòu)域。

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