姬改革，束婧婷，單艷菊，章 明，屠云潔，劉一帆，巨曉軍，鄒劍敏

(江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇省家禽遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225125)

我國居民對雞肉的傳統(tǒng)消費(fèi)一直是以活雞為主，具有良好肌肉品質(zhì)的地方品種雞在活雞市場占有絕對優(yōu)勢。然而，自2013年以來，H7N9(H5N6)病毒反復(fù)來襲，政府出于對公共衛(wèi)生安全的考慮，會(huì)暫時(shí)性的或者永久關(guān)閉活禽交易市場，提倡以冷鮮、冷凍的方式銷售禽類產(chǎn)品，給以活雞方式上市交易的優(yōu)質(zhì)肉雞產(chǎn)業(yè)帶來了毀滅性的打擊。在屠宰上市后，原本能代表地方品種優(yōu)勢的外觀性狀如羽色等將不復(fù)存在，胴體外觀的均一度、皮膚彈性和顏色、皮膚厚度以及毛囊直徑、密度的大小等會(huì)受到越來越多的關(guān)注。

毛囊是動(dòng)物皮膚重要而復(fù)雜的附屬器官，其發(fā)生發(fā)育依賴于上皮細(xì)胞和真皮間充質(zhì)細(xì)胞間的相互作用來實(shí)現(xiàn)[1]。關(guān)于其中存在的信號(hào)分子的研究，大多集中在哺乳動(dòng)物。已發(fā)現(xiàn)皮膚毛囊的發(fā)育受到多個(gè)信號(hào)分子及信號(hào)通路的協(xié)同調(diào)控，是一個(gè)復(fù)雜的分子調(diào)控過程。基因組表達(dá)譜芯片技術(shù)可用來在全基因組水平上比較不同生理過程同一組織或者不同組織中差異表達(dá)基因，進(jìn)一步挖掘和篩選出與性狀相關(guān)的信號(hào)通路和關(guān)鍵基因，應(yīng)用廣泛。在羊上，表達(dá)譜芯片技術(shù)被用來篩選影響羊毛纖維直徑性狀的差異表達(dá)基因[2]和不同毛囊發(fā)育階段的差異基因表達(dá)[3]。在禽類，陳興勇等[4]采用表達(dá)譜芯片技術(shù)檢測鵝換羽前后的差異表達(dá)基因，篩選與羽絨再生相關(guān)的重要基因。目前，在禽類皮膚毛囊方面的研究，主要集中在在膚色、羽色和產(chǎn)絨性能方面，如J. Q.Zhang等[5]采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)比較不同膚色雞(白色皮膚和黑色皮膚)個(gè)體皮膚組織基因表達(dá)差異，篩選出影響色素沉著的主要調(diào)控基因；高廣琦[6]]利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)檢測與雞羽毛色素沉著有關(guān)的基因；L. Zhang等[7]采用高通量測序技術(shù)檢測鴨不同羽區(qū)(正羽和絨羽)皮膚毛囊的miRNA表達(dá)譜等，但是關(guān)于雞皮膚厚度、毛囊密度和直徑方面的研究較少，利用表達(dá)譜芯片技術(shù)鑒別影響不同部位皮膚厚度、毛囊直徑和密度等差異候選基因的研究還未見報(bào)道。

本試驗(yàn)采用Agilent雞全基因組表達(dá)譜芯片對雞不同部位(背部和腿部)的皮膚毛囊進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選，通過對差異基因進(jìn)行GO、KEGG信號(hào)通路以及蛋白表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，研究影響雞不同部位皮膚毛囊性狀的主效基因和可能的分子機(jī)制，為篩選影響雞皮膚外觀胴體性狀的候選基因和冷鮮雞新品系選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物來源于江蘇省家禽科學(xué)研究所與常州立華公司聯(lián)合培育的處于上市日齡(63日齡)的冷鮮雞配套組合，隨機(jī)選擇處于上市日齡的4只雞(公母各半)進(jìn)行屠宰，屠宰后分別立即檢測背部和腿部2 cm×2 cm內(nèi)皮膚毛囊的數(shù)目，并分別采集約2 cm×2 cm大小的背部和腿部皮膚樣品，其中，背部皮膚樣品采集以背部正中線為軸，分左右兩側(cè)；腿部采集大腿部皮膚作為樣品。將左側(cè)背部皮膚樣品和大腿部皮膚樣品置于10%甲醛溶液中固定，用來檢測毛囊直徑和皮膚厚度，右側(cè)背部皮膚樣品和大腿部皮膚樣品迅速置于液氮速凍，然后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存，用于RNA抽提和芯片分析。

1.2 皮膚毛囊性狀測定

毛囊密度檢測：對背部左側(cè)和腿部皮膚2 cm×2 cm內(nèi)毛囊進(jìn)行計(jì)數(shù)(個(gè)·cm-2)。

皮膚厚度檢測：用游標(biāo)卡尺測定10%甲醛固定液中采集到的皮膚樣品的厚度(mm)，每個(gè)樣品測定3次，求平均值。

毛囊直徑檢測：對采集到的10%甲醛固定液中的皮膚毛囊樣品進(jìn)行測定，每個(gè)樣品隨機(jī)挑選3～4個(gè)完整毛囊，采用游標(biāo)卡尺測定毛囊直徑，每個(gè)毛囊測定3～4次，計(jì)算平均值(mm)。

1.3 RNA提取、質(zhì)量檢測及純化

采用RNA提取試劑盒提取皮膚組織總RNA(Applied Biosystems，AM1561)；利用NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific)定量并經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)檢測RNA完整性；質(zhì)檢合格后使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN，74106)純化總RNA。

1.4 芯片雜交

所用芯片為Agilent公司的雞全基因組4×44 K芯片(Design ID：026441)。參照Agilent公司表達(dá)譜芯片標(biāo)準(zhǔn)流程，將8個(gè)皮膚組織樣本(背部和腿部皮膚各4個(gè))的總RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA，進(jìn)一步合成用Cyanine-3-CTP(Cy3)標(biāo)記的cRNA，純化后在60 ℃溫浴30 min進(jìn)行片段化，加入2× GEx Hybridization Buffer混勻，上芯片雜交。洗脫后利用Agilent Scanner G2505C (Agilent Technologies)掃描，分辨率

為5 μm，掃描儀自動(dòng)以100%和10%PMT各掃描1次，2次結(jié)果Agilent軟件可自動(dòng)合并。采用Feature Extraction軟件(version10.7.1.1, Agilent Technologies)處理原始圖像提取原始數(shù)據(jù)。接著利用Genespring軟件(version13.1, Agilent Technologies)進(jìn)行quantile標(biāo)準(zhǔn)化和后續(xù)處理。標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，在用于比較的每組樣本中至少有1組100%標(biāo)記為Detected的探針留下進(jìn)行后續(xù)分析。

1.5 芯片數(shù)據(jù)分析

利用T檢驗(yàn)的P值和倍數(shù)變化值進(jìn)行差異基因篩選，篩選的標(biāo)準(zhǔn)為上調(diào)或者下調(diào)倍數(shù)變化值(Fold change)的絕對值≥2.0且P≤0.05。功能富集分析和調(diào)控通路分析以雞的注解信息為依據(jù)，采用GOEAST軟件，對上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)基因進(jìn)行基因功能分類(Gene ontology, GO)，得到差異表達(dá)基因參與的所有GO；基于KEGG數(shù)據(jù)庫(http://www.genome.jp/kegg/)，利用Fisher精確檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)對差異表達(dá)基因參與的Pathway進(jìn)行顯著性分析，計(jì)算各通路中基因富集的顯著程度，按照P<0.05進(jìn)行篩選，得到顯著性的GO和Pathway。STRING數(shù)據(jù)庫是一個(gè)搜尋已知蛋白質(zhì)之間和預(yù)測蛋白質(zhì)之間相互作用的數(shù)據(jù)庫，利用在線STRING軟件(http://string-db.org/)，基于雞的數(shù)據(jù)庫，對部分差異表達(dá)基因進(jìn)行蛋白網(wǎng)絡(luò)分析，查詢這些基因之間的相互作用關(guān)系，下載STRING網(wǎng)站的相互作用關(guān)系對，采用cytoscape3.3軟件繪制蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

1.6 熒光定量PCR

選取5個(gè)差異表達(dá)基因，以ACTB作為內(nèi)參基因，采用SYBR Green I法進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，以驗(yàn)證芯片結(jié)果的可靠性。根據(jù)GenBank中的基因序列設(shè)計(jì)引物，引物運(yùn)用Primer 5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)(引物序列見表1)，采用Trizol法提取背部和腿部皮膚總RNA(TIANGEN，DP424)，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TIANGEN，KR106-02)進(jìn)行cDNA合成，然后用SYBR Green 試劑盒(QIAGEN，208054)在Max3000P熒光定量PCR儀(愛普拜斯)上進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證試驗(yàn)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。相對定量的結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

表1熒光定量PCR引物

Table1Primersequencesusedforq-PCR

基因名稱Genename上游引物(5'-3')Forwardprimer下游引物(5'-3')Reverseprimer產(chǎn)物大小/bpProductlengthSHHTTGGTACTCACGGCTCCTCTAACACTCTGTCTCTGTCCC122BMP8BTACTCAGCCTACTACTGCGACACGTTGTTGTTGCTGTC186IGF1CCACAAGGGAATAGTGGATGACAGAGCGTGCAGATTTAGG101PPP1R3CGATACATGGAAGACTTACACGGGCAGGAGGCAAGTCAATAG104PTPRMCATTCGTCGATTTGTAGCTCTGCATAGTTCGATACTCCAACC111ACTBTGCTGTGTTCCCATCTATCGTTGGTGACAATACCGTGTTCA150

2 結(jié) 果

2.1 雞背部與腿部皮膚毛囊性狀比較

對雞的背部和腿部皮膚毛囊性狀進(jìn)行比較，結(jié)果見表2，背部和腿部皮膚在皮膚厚度、毛囊密度和直徑方面都表現(xiàn)出顯著差異。皮膚厚度方面是背部皮膚厚度極顯著高于腿部(P<0.01)，毛囊密度同樣是背部皮膚毛囊密度極顯著高于腿部(P<0.01)，而背部皮膚毛囊直徑則極顯著低于腿部(P<0.01)。

2.2 雞背部與腿部皮膚中的差異表達(dá)基因篩選及熒光定量PCR驗(yàn)證

采用Agilent雞全基因組表達(dá)譜芯片比較雞的背部和腿部皮膚組織基因表達(dá)譜差異，共發(fā)現(xiàn)差異倍數(shù)在2倍及以上的基因676個(gè)(|FC|≥2，P<0.05)，以腿部皮膚作為參照，背部皮膚中上調(diào)基因223個(gè)，下調(diào)基因453個(gè)。基于已發(fā)表的文獻(xiàn)報(bào)道，找到了一些與皮膚、毛囊生長發(fā)育相關(guān)的重要基因，詳見表3。以腿部皮膚為對照，背部皮膚中PTPRM、ROR2、S100B、DKK1、SOX18、IGF1、PPP1R3C等基因的表達(dá)是上調(diào)的，而KRTAP10-4、EREG、WNT3A、FGF1、FZD5、BMP8B、FOXN1、DLX3、PCDH7、SHH等基因的表達(dá)是下調(diào)的。

表2雞不同部位皮膚毛囊性狀比較

Table2Comparisonofskincharacteristicsatdifferentskinpositionsofchicken

性狀Trait背部皮膚Dorsalskin腿部皮膚LegskinP值Pvalue皮膚厚度/mmSkinthickness3.25±0.112.05±0.072.75E-03毛囊密度/(個(gè)·cm-2)Hairfollicledensity5.43±0.742.68±0.419.84E-05毛囊直徑/mmHairfolliclediameter2.85±0.043.78±0.052.48E-05

表3雞不同部位皮膚組織部分差異表達(dá)基因

Table3Partialdifferentiallyexpressedgenesatdifferentskinpositionsofchicken

基因名稱Genename基因描述GenedescriptionGenBank登錄號(hào)GenBankID差異倍數(shù)FoldchangePTPRMproteintyrosinephosphatase,receptortype,MBX9310814.94ROR2receptortyrosinekinase-likeorphanreceptor2CR3525254.49S100BS100calciumbindingproteinBBX9321464.31DKK1dickkopfWNTsignalingpathwayinhibitor1AY0490173.26SOX18SRY(sexdeterminingregionY)-box18NM_2043092.71IGF1insulin-likegrowthfactor1(somatomedinC)NM_0010043842.66PPP1R3Cproteinphosphatase1,regulatorysubunit3CXM_4231022.31KRTAP10-4keratinassociatedprotein10-4NM_001039969-54.86EREGepiregulinNM_001001203-43.66WNT3Awingless-typeMMTVintegrationsitefamily,member3ANM_001171601-19.9FZD5frizzledclassreceptor5NM_001305216-8.18BMP8Bbonemorphogeneticprotein8bBU422457-5.83FOXN1forkheadboxN1XM_415816-5.31DLX3distal-lesshomeobox3NM_204804-6.75PCDH7protocadherin7CR388971-6.28FGF1fibroblastgrowthfactor1S82824-2.99SHHsonichedgehogNM_204821-2.95

在篩選到的差異表達(dá)基因中，隨機(jī)挑選了5個(gè)進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，其中上調(diào)的3個(gè)(IGF1、PPP1R3C、PTPRM)，下調(diào)的2個(gè)(BMP8B、SHH)，結(jié)果見表4。5個(gè)差異表達(dá)基因在熒光定量PCR的檢測結(jié)果與芯片中檢測到的變化趨勢相同，說明芯片檢測結(jié)果是可信的。

2.3 雞不同部位皮膚差異表達(dá)基因的GO功能分類

對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO(Gene ontology)功能注釋，共發(fā)現(xiàn)51個(gè)顯著性GO(P<0.05)，主要分為生物學(xué)過程(32個(gè)顯著性GO)、細(xì)胞組分(13個(gè)顯著性GO)、分子功能(6個(gè)顯著性GO)3個(gè)方面。在生物學(xué)過程方面，如表5所示，上調(diào)的差異表達(dá)基因主要富集在凋亡過程的負(fù)調(diào)控，上皮細(xì)胞增殖的正調(diào)控作用、正調(diào)控血管生成、細(xì)胞增殖的正調(diào)控、神經(jīng)元凋亡過程的負(fù)調(diào)控等；下調(diào)的差異表達(dá)基因主要富集在Wnt信號(hào)通路、神經(jīng)元分化、細(xì)胞間黏附調(diào)節(jié)、細(xì)胞命運(yùn)的確定、軸突導(dǎo)向等。

表4芯片結(jié)果與熒光定量PCR結(jié)果的比較

Table4ComparisonofresultsatmRNAlevelsofeachgenebetweenmicroarrayandqRT-PCR

基因Gene芯片Microarray熒光定量qRT-PCR差異倍數(shù)(背皮/腿皮)Foldchange(Dorsalskin/Legskin)P值Pvalue差異倍數(shù)(背皮/腿皮)Foldchange(Dorsalskin/Legskin)P值Pvalue表達(dá)調(diào)節(jié)RegulationBMP8B-5.830.0361.050.051下調(diào)IGF12.660.0221.550.042上調(diào)PPP1R3C2.310.0384.120.025上調(diào)PTPRM4.940.0371.790.039上調(diào)SHH-2.950.0064.860.027下調(diào)

表5差異表達(dá)基因富集的GO生物學(xué)過程分析

Table5AnalysisofGObiologicalprocessofdifferentiallyexpressedgenesenrichment

GO編號(hào)GOIDGO生物學(xué)過程GObiologicalprocess基因數(shù)量NumberP值Pvalue上調(diào)基因Up-regulatedgenesGO:0043066negativeregulationofapoptoticprocess41.18E-02GO:0050679positiveregulationofepithelialcellproliferation22.66E-02GO:0045766positiveregulationofangiogenesis22.66E-02GO:0008284positiveregulationofcellproliferation33.41E-02GO:0042493responsetodrug23.84E-02GO:0043524negativeregulationofneuronapoptoticprocess24.72E-02下調(diào)基因Down-regulatedgenesGO:0016055Wntsignalingpathway75.75E-04GO:0030182neurondifferentiation41.20E-03GO:0022407regulationofcell-celladhesion31.79E-03GO:0045165cellfatecommitment33.66E-03GO:0007411axonguidance45.37E-03GO:0050829defenseresponsetoGram-negativebacterium36.40E-03GO:0042472innerearmorphogenesis36.40E-03GO:0045669positiveregulationofosteoblastdifferentiation31.01E-02GO:0050679positiveregulationofepithelialcellproliferation31.23E-02GO:0008152metabolicprocess81.97E-02

2.4 雞不同部位皮膚差異表達(dá)基因的信號(hào)通路分析

利用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)基因進(jìn)行信號(hào)通路分析，結(jié)果如表6所示。上調(diào)的差異表達(dá)基因主要參與細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)受體相互作用、黏著、細(xì)胞黏附分子(CAMs)、淀粉蔗糖代謝、血管平滑肌收縮、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和泛酸和輔酶A的生物合成等。下調(diào)的差異表達(dá)基因被富集到多條信號(hào)通路，包括黑色素生成、過氧化物酶體、咖啡因的代謝、Hedgehog信號(hào)通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、PPAR信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、脂肪酸代謝、MAPK信號(hào)通路、黏合連接以及背腹軸的形成、ErbB信號(hào)通路等。

表6差異表達(dá)基因富集的KEGG途徑分析

Table6KEGGpathwayanalysisofdifferentiallyexpressedgenesenrichment

KEGG編號(hào)KEGGID通路名稱Termdescription基因數(shù)目NumberP值Pvalue上調(diào)基因Up-regulatedgenesgga04512ECM-receptorinteraction71.30E-04gga04510Focaladhesion91.89E-03gga04514Celladhesionmolecules(CAMs)68.01E-03gga00500Starchandsucrosemetabolism31.87E-02gga04270Vascularsmoothmusclecontraction52.06E-02gga02010ABCtransporters32.14E-02gga00770PantothenateandCoAbiosynthesis22.60E-02下調(diào)基因Down-regulatedgenesgga04916Melanogenesis111.49E-04gga04146Peroxisome101.89E-04gga00232Caffeinemetabolism31.27E-03gga04340Hedgehogsignalingpathway63.59E-03gga04810Regulationofactincytoskeleton129.40E-03gga03320PPARsignalingpathway61.18E-02gga04310Wntsignalingpathway91.40E-02gga01212Fattyacidmetabolism51.40E-02gga04520Adherensjunction62.13E-02gga04010MAPKsignalingpathway123.27E-02gga04320Dorso-ventralaxisformation33.61E-02gga04012ErbBsignalingpathway63.68E-02

2.5 雞不同部位皮膚差異表達(dá)基因的蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

為了進(jìn)一步了解差異表達(dá)基因之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，我們從差異表達(dá)的基因中選擇了一些差異倍數(shù)比較大、GO和KEGG信號(hào)通路分析中發(fā)現(xiàn)的或已知的與皮膚毛囊生長發(fā)育相關(guān)的基因，通過STRING軟件查詢這些基因間的相互作用關(guān)系，下載相互作用關(guān)系對，并采用cytoscape3.3軟件繪制蛋白網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，將游離的分支網(wǎng)絡(luò)去掉，重點(diǎn)關(guān)注差異表達(dá)基因的主網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖(圖1)。從圖中可以看出，下調(diào)的差異表達(dá)基因(綠色)在關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖中占比例較高。Wnt信號(hào)通路中的WNT3A、WNT4、WNT6、FZD3、FZD5、FZD10等大都表現(xiàn)為下調(diào)，DKK1、IGF1、DRD4等表現(xiàn)為顯著上調(diào)。SHH、WNT3A、FGF1、DKK1、IGF1、WNT6等基因的色塊比較大，說明在網(wǎng)絡(luò)中這些基因與周邊的基因聯(lián)系較多，在網(wǎng)絡(luò)中的重要程度也大。SLC6A4、SLC1A3、SLC5A1、SLC13A1、SLC15A1等多個(gè)溶質(zhì)載體家族的成員也出現(xiàn)在網(wǎng)絡(luò)圖中。

紅色表示上調(diào)蛋白，綠色表示下調(diào)蛋白，色塊的大小表示在網(wǎng)絡(luò)中與周邊蛋白聯(lián)系程度的多少up-regulated proteins are showed in red, down-regulated proteins are showed in green. The color intensity indicate its degree of association with the surrounding proteins in the network圖1 部分差異表達(dá)基因構(gòu)建的蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Partial differentially expressed genes constructing a regulatory network of proteins

3 討 論

3.1 不同部位皮膚毛囊差異表達(dá)基因篩選

不同部位皮膚的毛囊因?yàn)橹拿l(fā)類型、發(fā)生的早晚、所處周期等的不同，形態(tài)和分布上可能會(huì)有所差別。本研究通過對處于上市日齡的商品代肉雞的背部和腿部皮膚厚度、毛囊密度和直徑進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)背部皮膚厚度顯著高于腿部，與烏仁套迪等[8]的研究結(jié)果基本一致，可能與背部皮下脂肪的沉積要明顯多于腿部皮膚有關(guān)。單位面積內(nèi)的毛囊密度同樣是背部皮膚顯著高于腿部，毛囊直徑則是腿部皮膚顯著高于背部。X. Y.Chen等[9]研究認(rèn)為，不同品種雞同一部位皮膚毛囊密度和直徑的差異，與耐熱性有關(guān)。生活在熱帶地區(qū)的雞背部皮膚毛囊密度顯著低于溫帶，而直徑則顯著高于溫帶地區(qū)的雞種。不同部位的皮膚毛囊密度和直徑的差異可能是為了平衡整體散熱，以應(yīng)對高溫天氣，是動(dòng)物為了適應(yīng)生活環(huán)境而長期進(jìn)化的結(jié)果。對于冷鮮上市的優(yōu)質(zhì)雞，皮膚毛囊密而細(xì)，更易受到消費(fèi)者的青睞。因此，利用雞全基因組表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選毛囊密度和直徑具有顯著差異的不同部位皮膚毛囊的差異表達(dá)基因，探索對毛囊密度等性狀具有重要影響的功能基因，為優(yōu)質(zhì)雞胴體外觀性狀遺傳改良提供參考。

課題組前期采用多因素方差分析發(fā)現(xiàn)，同一部位皮膚組織的皮膚厚度、毛囊密度和直徑在不同性別間差異均不顯著，因此將公母聯(lián)合在一起進(jìn)行分析。以腿部皮膚為對照，以組間2倍差異為標(biāo)準(zhǔn)，篩選到676個(gè)差異表達(dá)基因。隨機(jī)選取其中的5個(gè)基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，與芯片結(jié)果的變化趨勢基本一致，說明芯片得出的結(jié)果是可信的。部分差異表達(dá)基因如PTPRM[10]、EREG[11]、S100B[12]、IGF1[13]、SOX18[14]、FGF1[15]、DLX3[16]等已被報(bào)道分布在皮膚、毛囊組織中，在皮膚毛囊的發(fā)育和周期變化中具有重要作用。GO生物學(xué)過程分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)的差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞增殖的正調(diào)控作用、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、神經(jīng)元凋亡過程的負(fù)調(diào)控等。下調(diào)的差異表達(dá)基因主要富集在Wnt信號(hào)通路、神經(jīng)元分化、細(xì)胞間黏附調(diào)節(jié)、細(xì)胞命運(yùn)的確定、軸突導(dǎo)向等。不同部位皮膚毛囊的發(fā)育、分布等很大程度上都要受到神經(jīng)活動(dòng)的支配，發(fā)育過程中存在于真皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞之間大量的信號(hào)分子通過復(fù)雜的相互作用共同調(diào)節(jié)細(xì)胞群體的增殖和分化，因此與神經(jīng)活動(dòng)、黏附及調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡等生物學(xué)過程有關(guān)的基因都被富集到。

本研究中，KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果顯示，上調(diào)的基因主要參與ECM受體相互作用、黏著、細(xì)胞黏附分子(CAMs)、糖代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)等信號(hào)通路，推測不同部位皮膚毛囊性狀的差異，可能與所處的周圍環(huán)境有關(guān)，細(xì)胞與細(xì)胞之間及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間相互作用的信號(hào)分子表達(dá)的上調(diào)，增加了背部皮膚厚度和毛囊密度。T.X. Jiang等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，黏附分子是獨(dú)立調(diào)節(jié)，并在皮膚附屬物的形態(tài)發(fā)生不同階段做出貢獻(xiàn)。下調(diào)的差異表達(dá)基因參與的信號(hào)通路，常見的如Wnt信號(hào)通路、Hedgehog信號(hào)通路，MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路都被富集到，其中Wnt信號(hào)通路是目前研究最多的，被認(rèn)為在毛囊的發(fā)生發(fā)育和分化中起重要的作用[18]。Hedgehog信號(hào)通路[19]、MAPK信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路等在哺乳動(dòng)物上已有報(bào)道與毛囊的生長發(fā)育相關(guān)[2，20]。除了常見的通路外，咖啡因的代謝、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控等信號(hào)通路也被富集到，這些信號(hào)通路與皮膚毛囊發(fā)育之間的關(guān)系目前研究較少。

3.2 與皮膚毛囊生長發(fā)育相關(guān)的差異表達(dá)基因

本研究基于GO和KEGG分析中發(fā)現(xiàn)的或者已有文獻(xiàn)報(bào)道的與皮膚毛囊發(fā)育相關(guān)的基因，在STRING網(wǎng)站中的雞數(shù)據(jù)庫中查詢這些基因之間的相互作用關(guān)系，繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。通過網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，下調(diào)的基因占比例較高，背部皮膚厚度、毛囊密度的增加可能與這些基因表達(dá)的下調(diào)有關(guān)；線條大都集中在Wnt家族基因附近(圖1)，代表有較多的證據(jù)支持這些蛋白間存在相互關(guān)系。從色塊的大小來看，表達(dá)上調(diào)的DKK1、IGF1和表達(dá)下調(diào)的WNT3A、SHH等基因的色塊較大，線條匯集多，彼此相互聯(lián)系，說明這些基因與周邊基因相互作用較強(qiáng)，起到主要調(diào)控作用，能夠調(diào)控周邊基因的表達(dá)，可能在不同部位皮膚厚度、毛囊密度和直徑的表型性狀差異方面具有重要的作用。

WNT3A屬于Wnt基因家族，主要通過經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路起作用。經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路是通過與Frizzled、LRP等受體結(jié)合，調(diào)控β-catenin 磷酸化，使其在細(xì)胞內(nèi)富集，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，廣泛參與了毛囊發(fā)生的各個(gè)階段，尤其是起始階段，如毛基板、真皮凝集、毛胚芽的形成等。在鼠上，WNT3A被報(bào)道在色素細(xì)胞和表皮干細(xì)胞的增殖與分化中起重要的作用[21-22]。WNT3A能夠以劑量依賴的方式在毛囊不同的發(fā)育階段起作用[23]，在鼠生長期的毛囊能檢測到WNT3A的高表達(dá)，在退化期表達(dá)會(huì)逐漸下降，在靜止期的毛囊中，幾乎檢測不到WNT3A的表達(dá)。H. Shin等[24]用WNT3A處理在體外培養(yǎng)的人真皮乳頭細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Lef1、PTGER2的表達(dá)量都出現(xiàn)顯著升高，與本研究結(jié)果WNT3A表達(dá)量出現(xiàn)顯著下調(diào)，Lef1、PTGER2出現(xiàn)下調(diào)的結(jié)果是一致的；同時(shí)發(fā)現(xiàn)FGF信號(hào)通路、BMP信號(hào)通路、胞外基質(zhì)信號(hào)和受體的相關(guān)基因同樣受到WNT3A不同程度的表達(dá)調(diào)控，與本研究中相關(guān)信號(hào)通路基因表達(dá)出現(xiàn)顯著變化的結(jié)果是一致的。盡管WNT3A在Wnt信號(hào)通路中有重要的作用，但目前關(guān)于其對皮膚厚度、毛囊密度和直徑影響的研究還很少。

DKK能夠通過與Wnt信號(hào)通路受體LRP等的結(jié)合，抑制經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路的激活。鼠上的研究顯示，DKK1能夠通過對毛囊周期的調(diào)控，影響毛囊長度[25]。S. Sick等[26]研究發(fā)現(xiàn)，DKK和WNT通過反應(yīng)擴(kuò)散(Reaction-diffusion)機(jī)制決定毛囊之間的距離。M.X. Lei等[27]報(bào)道，在鼠毛囊再生過程中，注射DKK1會(huì)抑制毛囊的增大。提示，在本研究結(jié)果中，DKK1可能與Wnt信號(hào)通路的其他基因相互協(xié)調(diào)，在調(diào)節(jié)皮膚毛囊密度和直徑大小方面具有重要的作用。

SHH是脊椎動(dòng)物中編碼Hedgehog蛋白的基因之一，在細(xì)胞增殖和真皮乳頭的形成方面具有重要的作用[28]。在雞胚中，過表達(dá)SHH能夠使皮膚毛囊的極性發(fā)生改變[29]。在鼠上，WNT5A被認(rèn)為是SHH的一個(gè)調(diào)控目標(biāo)[30]，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，背部皮膚中SHH表達(dá)量顯著下調(diào)2.9倍，WNT5A的下游FOXN1表達(dá)顯著下調(diào)5.3倍，同時(shí)發(fā)現(xiàn)調(diào)控FOXN1基因表達(dá)的ROR2顯著上調(diào)4.5倍，這與鼠上敲除毛囊細(xì)胞中的ROR2，導(dǎo)致FOXN1基因表達(dá)顯著下調(diào)，功能被抑制是相矛盾的[31]。物種不同基因的調(diào)控途徑可能會(huì)存在差異。在禽類上，SHH可能存在于不同于哺乳動(dòng)物的作用方式，調(diào)控雞皮膚毛囊的生長發(fā)育。

胰島素樣生長因子1(Insulin-like growth factor-1，IGF1)是動(dòng)物生長軸上的重要基因，能夠通過影響毛囊細(xì)胞增殖和分化、組織重塑、調(diào)控毛囊的生長周期等，在毛囊的形態(tài)發(fā)生中具有重要的作用[13, 32]。敲除IGF1的受體IGF1R，皮膚的表皮厚度顯著下調(diào)，但不會(huì)影響分化或凋亡[33]。過表達(dá)IGF1能夠使新出生的小鼠皮膚異常變厚和毛囊發(fā)育提前[34]。與之相似，本研究中，IGF1在背部皮膚組織中的表達(dá)顯著升高，提示IGF1可能在調(diào)節(jié)不同部位皮膚厚度和毛囊發(fā)育方面具有重要的作用。

溶質(zhì)載體家族(Solute-carrier gene superfamily，SLC)是一個(gè)龐大的基因家族[35]，主要編碼膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，負(fù)責(zé)細(xì)胞膜上的幾種物質(zhì)如氨基酸、核酸、激素等的運(yùn)輸。本研究發(fā)現(xiàn)，篩選出的29個(gè)SLC家族基因，其中上調(diào)的有8個(gè)，下調(diào)的有21個(gè)。毛囊的發(fā)生發(fā)育離不開上皮和間充質(zhì)細(xì)胞間的信號(hào)傳遞，推測分布于膜上的SLC家族相關(guān)基因的差異表達(dá)可能在不同部位皮膚毛囊的表型差異中具有重要的作用，將這些基因作為影響皮膚厚度、毛囊密度和直徑等的候選基因進(jìn)行深入的研究具有一定的意義。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)采用表達(dá)譜芯片技術(shù)，篩選出雞不同部位(背部和腿部)皮膚組織中的差異表達(dá)基因676個(gè)，差異表達(dá)基因主要參與了細(xì)胞增殖和凋亡的正負(fù)調(diào)控、神經(jīng)元的分化、細(xì)胞間黏附分子等生物學(xué)過程和ECM受體相互作用、黏著、Hedgehog、Wnt等信號(hào)通路；DKK1、WNT3A、SHH、FGF1、IGF1等基因可能是影響不同部位皮膚厚度、毛囊密度和直徑出現(xiàn)顯著差異的重要候選基因。

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