★ 魏春華曾金祥 史亞夫 羅光明 高燕萍 鐘國躍 朱繼孝*

(1.江西中醫(yī)藥大學中藥資源與民族藥研究中心 南昌 330004； 2.江西中醫(yī)藥大學藥學院 南昌 330004)

矮紫堇(CorydalishendersoniiHemsl)也稱尼泊爾黃堇，藏藥名桑格絲哇，是罌粟科紫堇屬植物矮紫堇和扁柄黃堇的干燥全草，作為傳統(tǒng)藏藥“日棍”，具有活血散瘀、利氣止痛功效，藏醫(yī)用于治療胃潰瘍、胃炎、跌打損傷、坐骨神經(jīng)痛、疥癖瘡毒、毒蛇咬傷、刀傷等[1]。紫堇屬植物含有多種生物堿成分，藥理學研究發(fā)現(xiàn)其具有抗菌、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗心律失常、保肝等活性，并且對心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、平滑肌等有藥理作用[2]。在藏區(qū)廣泛地應用于臨床。本課題組前期研究采用經(jīng)典的解熱鎮(zhèn)痛抗炎動物模型，綜合評價了矮紫堇在解熱鎮(zhèn)痛抗炎方面的藥理活性及作用機制，但矮紫堇化學成分方面的報道較少，其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究仍然欠缺。近年來隨著分析技術(shù)的發(fā)展，UHPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)由于其分離速度快、靈敏度高、測定準確性強而被廣泛運用于中藥及復方的分析中[3-4]。本實驗采用 UHPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)對矮紫堇進行了分析研究，定性鑒定出10個生物堿類成分、2個黃酮類成分，為矮紫堇的質(zhì)量控制與研究應用提供了可靠的方法，為藏藥進一步的開發(fā)與應用提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-30A超高效液相色譜儀，PDA紫外檢測器；Triple-TOF 5600+高分辨質(zhì)譜儀，配備 ESI 離子源及 Analyst 1.6 數(shù)據(jù)處理軟件、PeakView數(shù)據(jù)處理軟件(A美國B SCIEX 公司)；KQ-5200DB 型超聲清洗機(昆山市超聲波儀器公司)；AL204 型電子分析天平(Mettler Toledo 儀器(上海)有限公司)； Millipore-Simplicity 超純水處理系統(tǒng)(德國默克密理博公司)。

1.2 試藥 原阿片堿對照品(純度≥98%，批號：MUST-16012408)、槲皮素對照品(純度≥98%，批號：MUST-16031804)均購自成都曼思特生物科技公司；甲醇(HPLC 級，美國天地有限公司)；甲酸(HPLC 級，山西西亞化工有限公司)；水為Milli-Q 系統(tǒng)純化水(美國Millipore 公司)。矮紫堇購自成都荷花池中藥材市場，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學中藥資源與民族藥研究中心鐘國躍研究員鑒定為罌粟科植物矮紫堇(C.hendersoniiHemsl)的干燥全草。

2 方法

2.1 供試品溶液制備 矮紫堇粉碎，稱取約2.0 g置于50 mL錐形瓶，加入25 mL 75% 甲醇超聲提取45min，抽濾、旋干、定容至5mL容量瓶中，取定容后藥液過0.22μm 微孔濾膜過濾，供UHPLC-Q-TOF-MS/MS分析。

2.2 標準品溶液的制備 分別精密稱取2mg對照品(原阿片堿、槲皮素)于5 mL容量瓶中，用75%甲醇溶解稀釋至刻度，過0.22 μm微孔濾膜，待分析。

2.3 LC-MS 條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱：YMC-ULtraHT Pro C18色譜柱(100 mm×3 mm，2μm)；流動相：0.5%甲酸水溶液(A)，甲醇(B)，梯度洗脫：0～5min，10% ～ 18% B；5～35 min，18% ～50% B；35～55 min，50～ 95% B；55～57min，95%～10% B；57～62min，10%～10% B；流速：0.4 mL/min；柱溫：32℃；進樣量：4μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子化源(ESI)，負離子模式；質(zhì)量掃描范圍 m/z 100～1000；噴霧電壓：-4500 V，霧化氣溫度：500 ℃，氣簾氣：140.745kPa，輔助氣：344.74 kPa；去簇電壓(DP)：100V；采用TOF-MS-IDA-MS/MS 方法采集數(shù)據(jù)，TOF/MS 一級預掃描和觸發(fā)的二級掃描TOF/MS/MS 離子累積時間分別為200、100 ms，CE 碰撞能量為40eV，CES碰撞能量疊加為(40±10)eV。

2.4 數(shù)據(jù)處理 采用AB Sciex公司 Peak View 1.6軟件，對UHPLC-Q-TOF-MS/MS采集的數(shù)據(jù)進行處理。

3 結(jié)果

3.1 矮紫堇化學成分分析 采用 UHPLC-Q-TOF-MS/MS 對75%甲醇提取矮紫堇藥材成分進行定性分析，(+) ESI-MS 的質(zhì)譜總離子流圖(TIC)(圖1)。(-) ESI-MS 的質(zhì)譜總離子流圖(TIC)(圖2)。應用Peak View 1.6軟件分析75% 甲醇提取無尾果中各化學成分的保留時間及其質(zhì)譜信息，并結(jié)合分子離子峰與對照品、相關(guān)文獻報道數(shù)據(jù)進行對比，對其中的化學成分進行推斷，初步推斷出矮紫堇提取物中生物堿類化合物10個，黃酮類成分2個。

圖1 矮紫堇提取物在正離子模式下總離子流圖

圖2 矮紫堇提取物在負離子模式下總離子流圖

3.2 化合物的質(zhì)譜裂解特征 化合物1 tR為10.99min，正離子模式下，高分辨ESI-MS準分子離子峰為m/z356.1856[M+H]+，其分子式為C21H25NO4，分子離子發(fā)生RDA裂解與B環(huán)開裂得到碎片離子m/z191.0854、165.0709，與文獻裂解規(guī)律一致，推測此化合物為四氫巴馬汀[5]。

化合物2 tR為11.20min，正離子模式下，高分辨ESI-MS準分子離子峰為m/z342.1699[M+H]+，其分子式為C20H23NO4，分子離子發(fā)生RDA裂解得到碎片離子m/z178.0849、165.0717，B環(huán)開裂得到碎片離子m/z192.1017、151.0601，分子離子分別失去CH4、CH3OH得到碎片離子m/z326.1393、310.1436，與文獻裂解規(guī)律一致，推測此化合物為四氫非洲防己堿[5]。

化合物3 tR為11.39min，正離子模式下，高分辨ESI-MS準分子離子峰為m/z328.1543[M+H]+，其分子式為C19H21NO4，分子離子發(fā)生RDA裂解與B環(huán)開裂得到碎片離子m/z178.0863、151.0760，分子離子失去CH3OH得到碎片離子m/z296.1292，與文獻裂解規(guī)律一致，推測此化合物為金黃紫堇堿[5]。

化合物4 tR為12.55min，正離子模式下，高分辨ESI-MS準分子離子峰為m/z340.1542[M+H]+，其分子式為C20H21NO4，分子離子發(fā)生RDA裂解得到碎片離子m/z177.0612、165.0817，B環(huán)開裂得到碎片離子m/z192.1015、148.0763，分子離子失去CH2O得到碎片離子m/z309.1119，與文獻裂解規(guī)律一致，推測此化合物為四氫小檗堿[5]。

表1 矮紫堇提取物的化學成分鑒定結(jié)果

化合物 5 tR為12.60min，正離子模式下，高分辨ESI-MS準分子離子峰為m/z370.1649[M+H]+，其分子式為C21H23NO5，分子離子發(fā)生RDA裂解得到碎片離子m/z205.0648、163.0744，α裂解得到碎片離子m/z190.0861、181.0865，分子離子失去CH4及H2O得到碎片離子m/z337.1310，碎片離子m/z205.0648分別失去OH和H2O得到碎片離子m/z190.0861、188.0704，與文獻裂解規(guī)律一致，推測此化合物為別隱品堿[5]。

化合物6 tR為13.81min，正離子模式下，高分辨ESI-MS準分子離子峰為m/z354.1334[M+H]+，其分子式為C20H19NO5，分子離子發(fā)生RDA裂解得到碎片離子m/z206.0816、149.0600，α裂解得到碎片離子m/z189.0767、165.0558，碎片離子m/z206.0816分別失去OH和H2O得到碎片離子m/z189.0767、188.0703，與文獻裂解規(guī)律一致，推測此化合物為原阿片堿[6]。

化合物7 tR為17.04min，正離子模式下，高分辨ESI-MS準分子離子峰為m/z321.0987[M+H]+，其分子式為C19H14NO4，分子離子失去2個氫而形成穩(wěn)定的大π共軛系統(tǒng)得到碎片離子m/z319.0800，分子離子失去CO和2個氫得到碎片離子m/z291.0847，碎片離子m/z291.0847失去CO得到碎片離子m/z263.0894，與文獻裂解規(guī)律一致，推測此化合物為黃連堿[5]。

化合物8 tR為17.90min，正離子模式下，高分辨ESI-MS準分子離子峰為m/z337.1268[M+H]+，其分子式為C20H18NO4，分子離子失去CH3得到碎片離子m/z322.1031，分子離子失去CO和2個氫得到碎片離子m/z307.0781，碎片離子m/z307.0781失去CO得到碎片離子m/z278.0763，與文獻裂解規(guī)律一致，推測此化合物為小檗堿[5]。

化合物9 tR為18.12min，正離子模式下，高分辨ESI-MS準分子離子峰為m/z334.1077[M+H]+，其分子式為C20H15NO4，分子離子失去CH3得到碎片離子m/z318.0762，分子離子失去1個氫得到碎片離子m/z332.0923，碎片離子m/z332.0923失去CO得到碎片離子m/z304.0974，與文獻裂解規(guī)律一致，推測此化合物為二氫血根堿[5]。

化合物10 tR為33.78min，負離子模式下，高分辨ESI-MS準分子離子峰為m/z301.0361[M-H]+，其分子式為C15H10O7，分子離子峰m/z301.0361分別失去CO、C7H6O2得到碎片離子m/z273.0427、178.9833，碎片離子m/z178.9833失去CO得到碎片離子m/z151.0057，推測此化合物為槲皮素，裂解規(guī)律與文獻一致[7]。

化合物11 tR為38.73min，負離子模式下，高分辨ESI-MS準分子離子峰為m/z301.0361[M-H]+，其分子式為C15H10O6，分子離子峰失去CO得到碎片離子m/z257.0466，碎片離子m/z257.0466失去CO得到碎片離子m/z229.0509。碎片離子m/z285.0421發(fā)生RDA裂解得到碎片離子m/z151.0052、133.0291，推測此化合物為木犀草素，裂解規(guī)律與文獻一致[8]。

化合物12 tR為50.39min，正離子模式下，高分辨ESI-MS準分子離子峰為m/z390.1338[M+H]+，其分子式為C23H19NO5，分子離子失去8位的丙酮基形成相對較穩(wěn)定的苯并菲啶類生物堿,得到碎片離子m/z332.0914，碎片離子m/z332.0914分別失去CH3和CO得到碎片離子m/z317.0676,304.0963，碎片離子m/z304.0963失去CO和2個氫得到碎片離子m/z274.0862，與文獻裂解規(guī)律一致，推測此化合物為8-丙酮基二氫血根堿[5]。

圖3 金黃紫堇堿(A)、小檗堿(B)和槲皮素(C)的質(zhì)譜圖譜

4 討論

藏藥資源豐富，但基礎(chǔ)研究薄弱，很多單味藏藥品種多停留在品種整理、資源調(diào)查或生藥學鑒定階段，紫堇屬藏藥的情況亦是如此。UHPLC-Q-TOF/MS 聯(lián)用儀的優(yōu)勢在于: 一次進樣，同時獲得高質(zhì)量的 TOF-MS和 TOF-MS/MS，通過精確相對分子質(zhì)量，進行目標化合物的篩查和確證[9]。本試驗采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，通過色譜分離、質(zhì)譜鑒定共鑒別矮紫堇復雜提取物中的10種生物堿類成分，2個黃酮類成分，并初步了解了其質(zhì)譜裂解規(guī)律。金黃紫堇堿、四氫非洲防己堿、四氫小檗堿、四氫巴馬汀等屬于四氫原小檗堿型生物堿，通過RDA裂解與B環(huán)開裂進行裂解；別隱品堿與原阿片堿屬于普羅托品類生物堿，RDA裂解與α裂解反應以及由母核失去1分子H2O形成[M+H-18]+的碎片峰是這類生物堿顯著的質(zhì)譜裂解規(guī)律；8-丙酮基二氫血根堿與二氫血根堿屬于二氫苯并菲啶類生物堿，這類生物堿會先失去8位或者7位的取代基形成相對較穩(wěn)定的苯并菲啶類生物堿。黃連堿與小檗堿屬于原小檗堿型生物堿，這類生物堿母核一般不會發(fā)生裂解，僅有小分子取代基的裂解與丟失在母核上如果存在鄰二甲氧基，則此鄰二甲氧基會先失去 1 分子甲基后再失去 1 個氫從而形成亞甲二氧基，亞甲二氧基會繼續(xù)丟失1分子一氧化碳從而形成1個穩(wěn)定的三元氧環(huán)。

本實驗中鑒別出的矮紫堇化學成分與本實驗室前期文獻報道基本一致[10-11]，說明應用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)同樣可快速、準確鑒別中藥復雜成分。但同時可以看出，也有部分成分前期未見報道。如現(xiàn)代化學研究表明，異喹啉類生物堿是紫堇屬植物其的要特征性成分[12]，但矮紫堇中暫未推斷出該類成分。但從總離子流圖可以發(fā)現(xiàn)矮紫中還有大量成分結(jié)構(gòu)尚未解析。因此，不能據(jù)此推測矮紫堇中不存在異喹啉類生物堿成分，仍需繼續(xù)進行研究以進一步闡明其它成分。

[1]舒花,馬學燕,李鑫,等. 矮紫堇總生物堿的含量測定及其抗炎活性研究[J].西北藥學雜志,2015,30(5):602-604.

[2]尚偉慶,陳月梅,高小力,等. 紫堇屬藏藥的化學與藥理學研究進展[J].中國中藥雜志,2014,13(7):1 190-1 198.

[3]許文,傅志勤,林婧,等. UPLC-MS/MS法同時測定三葉青中10種黃酮類成分[J].藥學學報,2014,49(12):1 711-1 717.

[4]宋建平,許虎,陳菲,等. 羅布麻葉黃酮類成分的UPLC-Q-TOF-MS分析[J].中藥材,2014,37(7):1 199-1 204.

[5]卿志星,程辟,曾建國. 博落回中生物堿質(zhì)譜裂解規(guī)律研究進展[J].中草藥,2013,44(20):2 929-2 939.

[6]丁波. 延胡索物質(zhì)基礎(chǔ)及其主要活性單體體內(nèi)代謝的LC-DAD-MS/MS研究[D].上海：第二軍醫(yī)大學,2007.

[7]李宇航,戴海學,汪明明,等. 槲皮素的電噴霧離子阱質(zhì)譜分析[J].質(zhì)譜學報,2009,30(6):374-378.

[8]李軍茂,何明珍,歐陽輝,等. 超高效液相色譜與飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用快速鑒別木芙蓉葉的化學成分[J].中國藥學雜志,2016,51(14):1 162-1 168.

[9]蘇靖,戴榮繼. 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在中藥研究中的應用[J].生命科學儀器,2014,12(Z1):38-42.

[10]高燕萍,吳強,梁健,等.矮紫堇生物堿成分[J].中國實驗方劑學雜志,2016,22(17):67-70.

[11]高燕萍,吳強,梁健,等.藏族藥矮紫堇化學成分分離鑒定[J].中國實驗方劑學雜志,2016, 22(18): 60-63.

[12]劉璐,吳立軍,楊春娟. 紫堇屬植物中異喹啉類生物堿的化學結(jié)構(gòu)和生物活性的研究進展[J].實用藥物與臨床, 2016, 19(3): 371-380.