常江，李暢，趙柯，關(guān)玉婷，孟憲梅，胡盼，孫宇，宿甲子，李巖松，柳增善

（1.吉林工商學(xué)院糧油食品深加工吉林省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春1305071；2.人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林大學(xué)人獸共患病研究所，吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，長春130062）

0 引 言

微生物污染導(dǎo)致的食源性疾病是食品安全中的最重要問題之一[1]。乳品營養(yǎng)豐富，微生物污染會(huì)導(dǎo)致短時(shí)間內(nèi)污染嚴(yán)重超標(biāo)，降低乳品品質(zhì)并引起變質(zhì)、脹袋等，其中酵母菌污染是引起發(fā)酵乳脹袋、變質(zhì)的主要原因[2]。乳品中常見酵母菌包括馬克斯克魯維酵母菌、庫德里阿茲威氏畢赤酵母、熱帶假絲酵母等[3]，其酵母總數(shù)是評(píng)定食品污染程度的標(biāo)志，具有重要的衛(wèi)生學(xué)意義。

1 酵母菌的國標(biāo)檢測方法

平板計(jì)數(shù)法是酵母菌計(jì)數(shù)的國標(biāo)檢測方法。GB4789.15-2016[4]規(guī)定，樣本均質(zhì)后經(jīng)10倍系列稀釋加入含有氯霉素的土豆-葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基或在孟加拉紅固體培養(yǎng)基中進(jìn)行平板培養(yǎng)，28℃培養(yǎng)5 d后菌落計(jì)數(shù)。傳統(tǒng)的微生物檢測方法雖操作容易、成本低廉，但檢測周期長、程序復(fù)雜，不利于企業(yè)篩查，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代檢測的需要[5]。因此，近年來國內(nèi)外對(duì)酵母菌的檢測方法進(jìn)行了新的探索。

2 酵母菌的分子診斷技術(shù)

分子生物學(xué)檢測方法是現(xiàn)代致病微生物檢測的核心技術(shù)[6]。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展和應(yīng)用，分子診斷技術(shù)成為酵母菌檢測最重要的組成部分[3]，主要包括核酸擴(kuò)增技術(shù)和分子免疫學(xué)技術(shù)兩類。

2.1 核酸擴(kuò)增技術(shù)

2.1.1 PCR方法

分子生物學(xué)檢測方法是現(xiàn)代致病微生物檢測的核心技術(shù),尤以PCR技術(shù)為代表[6]。PCR是一種用于放大擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，該方法具有快速、靈敏、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，且特異性擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過26S測序鑒定，在8 h內(nèi)診斷乳品中酵母菌種類[7]。常規(guī)PCR對(duì)酵母菌的檢測限為106CFU/m L，進(jìn)行DNA純化后檢測限提升至103CFU/m L[8]，但國標(biāo)法要求乳品中酵母菌的檢出率僅為102CFU/m L[4]。為了提升PCR擴(kuò)增靈敏度，很早就有人提出了用巢氏PCR代替普通PCR進(jìn)行檢測，該方法相比普通PCR大大提升檢測靈敏度[9]，但由于需要在第二輪PCR時(shí)進(jìn)行開蓋操作，巢氏PCR在提升檢測限的同時(shí)也增加了污染的機(jī)會(huì)，造成實(shí)際樣本中的假陽性增加。

2.1.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAM P）是一種新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)，近年來主要用于細(xì)菌和病毒檢測，對(duì)真菌的研究也有報(bào)道[10]。該方法對(duì)儀器設(shè)備要求低，僅需恒溫?cái)U(kuò)增，具有反應(yīng)速度快，靈敏度高，特異性好的優(yōu)點(diǎn)，酵母菌最低檢測限為103CFU/m L[11]。其結(jié)果可以通過瓊脂糖凝膠電泳反映，粗略時(shí)可眼觀觀測。但由于LAM P的封閉系統(tǒng)較差，開蓋后電泳檢測極易產(chǎn)生“氣溶膠”污染，因此造成假陽性是該方法的主要問題。LAM P-LFD方法在LAM P基礎(chǔ)上結(jié)合橫向流膠體金試紙條技術(shù)，對(duì)LAM P進(jìn)行了改進(jìn)。一方面省略了瓊脂糖凝膠電泳檢測步驟，另一方面減少樣本污染。該方法提高了檢測準(zhǔn)確性，檢測時(shí)長大約50min，靈敏度是普通PCR方法的100倍[12]，受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注和認(rèn)可。

2.1.3 熒光定量PCR

熒光定量PCR（Quantitative Real-tim e PCR）是一種通過熒光染料或特異性熒光探針對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)監(jiān)測反應(yīng)過程，并結(jié)合相應(yīng)軟件分析產(chǎn)物及模板的分子生物學(xué)技術(shù)[3]。與上世紀(jì)90年代的終點(diǎn)PCR法相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有特異性更好、靈敏度更高、線性關(guān)系好、定量準(zhǔn)確等的優(yōu)勢，成為酵母菌檢測的一大突破，是當(dāng)前酵母檢測中的最為普遍的檢測方法[3]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，盡管果汁等食品中的酵母菌以及常見腐敗細(xì)菌的檢測結(jié)果多會(huì)受食品成分及種類的影響而發(fā)生不穩(wěn)定改變[13]，但乳品中酵母菌的檢測并未受到乳品成分的影響[14]。因此，乳品中酵母菌檢測可以不依賴于DNA提取，這對(duì)用熒光定量PCR方法直接檢測乳品中酵母菌數(shù)的準(zhǔn)確性提供了重要依據(jù)。

人們根據(jù)酵母菌檢測目的對(duì)其引物進(jìn)行了深度分析與探索。目前主要包括真菌通用引物[13]、酵母菌通用引物[16]以及特定酵母菌引物[17]的PCR檢測。Kurtzm an和R obm ett等對(duì)所有已知酵母菌株測序分析發(fā)現(xiàn)，26S rDNA D 1/D 2區(qū)存在中間變異較大但種間變異小于1%的1 600 bp片段，這一片段經(jīng)分析驗(yàn)證最終被國際酵母分類學(xué)界所普遍接收[16]。因此，目前常用酵母菌檢測引物多以此片段為模板。其中存在26S rDNA D 1/D 2真菌通用引物N L1/N L4[18]可以進(jìn)行9種酵母菌及霉菌的通用檢測，靈敏度103～108CFU/m L，(但引物存在二聚體，不適用酵母菌的準(zhǔn)確定量；另酵母菌ITSI通用引物在26S rDNA D 1/D 2區(qū)設(shè)計(jì)，檢測線最低可達(dá)2～22 CFU/m L[19]。除此之外，酵母菌通用引物也包括18S rDNA[20]特異性引物及酵母肌動(dòng)蛋白基因[21]檢測等，能檢測101CFU/m L純酵母菌。熒光定量PCR在檢測過程中采用絕對(duì)定量方法，需要注意，操作過程容易出現(xiàn)質(zhì)粒擴(kuò)散而導(dǎo)致假陽性[22]，實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)保持通風(fēng)并及時(shí)關(guān)閉管蓋，最大程度降低假陽性。

2.1.4 PM A/EM A-qPCR

傳統(tǒng)熒光定量PCR受限于無法區(qū)分細(xì)胞死活[23]。因此，即使酵母菌死亡，裸露的DNA也可以持續(xù)存在于環(huán)境中，使得熒光定量PCR的檢測結(jié)果高估病原體濃度，導(dǎo)致實(shí)際樣本檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。

PM A/EM A是一種DNA嵌入染料，能夠穿透死細(xì)胞的受損細(xì)胞膜，可以通過曝光結(jié)合細(xì)胞外暴露DNA及非存活細(xì)胞的DNA，并阻止DNA在隨后的PCR反應(yīng)中被擴(kuò)增[24]。由于存在顆粒及抑制劑抑制PM A/EM A與DNA的交聯(lián)作用，因此只有少部分文獻(xiàn)[25]報(bào)道了使用PM A/EM A-qPCR進(jìn)行乳品中酵母菌的檢測。但實(shí)驗(yàn)研究表明，與qPCR相比，PM A/EM A-qPCR對(duì)酵母菌的檢測結(jié)果與國標(biāo)法結(jié)果相近且呈現(xiàn)高度的線性相關(guān)，檢測結(jié)果達(dá)到國標(biāo)法檢測要求[3]，說明該方法確實(shí)可以通過優(yōu)化達(dá)到篩選目的，是一種很有前景的酵母菌檢測方法。

2.1.5 RT-qPCR

酵母菌rRNA的RT-qPCR于2006年首次被提出。該方法檢測限為10 CFU/m L，檢測限低，具有實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）能夠快速檢測和定量酵母菌數(shù)而不需要培養(yǎng)的優(yōu)勢，且因?yàn)樗兰?xì)胞沒有被量化而使結(jié)果更加準(zhǔn)確[26]。因此該方法是一種對(duì)酵母進(jìn)行快速、準(zhǔn)確檢測的技術(shù)，可以更準(zhǔn)確的控制腐敗風(fēng)險(xiǎn)[27]。為評(píng)估熱致死處理的酵母菌RNA穩(wěn)定性的影響，N uria H ierro等人通過熱處理后肌動(dòng)蛋白R(shí)NA和DNA實(shí)驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，熱處理10 min后的12 h，經(jīng)熱致死處理的酵母m RNA穩(wěn)定性較差，可能導(dǎo)致樣品量化過程中酵母菌含量被低估。但rRNA和rDNA均穩(wěn)定存在，26S rRNA可能與細(xì)胞活力相關(guān)，從而產(chǎn)生限制其立即降解的能力。細(xì)胞生理狀態(tài)不同可能存在定量過程中基因表達(dá)差異問題，但經(jīng)實(shí)驗(yàn)分析，這種差異不顯著[26]。因此，RT-qPCR方法是檢測乳品中酵母菌數(shù)的可靠方法。

2.1.6 自動(dòng)化平臺(tái)

自動(dòng)化分子平臺(tái)的出現(xiàn)突破了PCR傳統(tǒng)空間限制，實(shí)現(xiàn)了樣本提取、擴(kuò)增、檢測一體式方案，有效避免PCR污染難題[28]。該技術(shù)具有超前的樣品制備系統(tǒng)、獨(dú)特的PCR反應(yīng)系統(tǒng)和封閉的內(nèi)部質(zhì)控。一方面，具有操作方法簡單、結(jié)果穩(wěn)定、花費(fèi)時(shí)間短，總時(shí)間僅需30min的優(yōu)點(diǎn)；另一方面，該技術(shù)確保安全性，技術(shù)一體化大大降低檢測人員與病原體的接觸幾率，保護(hù)檢測人員安全[29]。目前常見的自動(dòng)化平臺(tái)有GeneXpert快速檢測系統(tǒng)、Am pliPrepTM/COBAS?Taqm an系統(tǒng)等，主要用于流行疾病監(jiān)控和臨床檢測。盡管該技術(shù)存在成本較高、便攜性較差的短板，但隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和研究進(jìn)步，自動(dòng)化平臺(tái)的應(yīng)用將更為廣闊[30]。

2.2 分子免疫技術(shù)

2.2.1 流式細(xì)胞技術(shù)

流式細(xì)胞技術(shù)（FCM）是一種使用流式細(xì)胞儀對(duì)液相中懸浮細(xì)胞及微粒測量的自動(dòng)化檢測技術(shù)[31]。流式細(xì)胞術(shù)工作原理是在細(xì)胞分子水平上通過單克隆抗體對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)、快速的定量分析。通過熒光標(biāo)記、富集并將微生物細(xì)胞注入流式細(xì)胞儀的石英流式細(xì)胞柱，確保單個(gè)微生物細(xì)胞經(jīng)過激光激發(fā)柱，經(jīng)儀器分析及計(jì)算機(jī)計(jì)算得出樣本酵母菌數(shù)[32]。隨著分子免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及電子計(jì)算機(jī)技術(shù)的迅速發(fā)展，流式細(xì)胞技術(shù)成為一種對(duì)生物粒子進(jìn)行結(jié)構(gòu)、功能及作用檢測的重要儀器技術(shù)[33]。伴隨該方法對(duì)酵母菌檢測的使用，具有可檢測出單個(gè)活酵母細(xì)胞的巨大優(yōu)勢，相比其他方法檢測限不夠而引入的增菌等方法，減少了工作量并增加檢測準(zhǔn)確性[34]。該技術(shù)檢測需90～100min，已用于水、飲料、牛奶及其他液態(tài)加工食品等多個(gè)行業(yè)。為防止阻塞進(jìn)樣通道，流式細(xì)胞技術(shù)的所有樣本均需進(jìn)行前處理[35]，且由于流式細(xì)胞儀設(shè)備昂貴，該方法目前還未能在企業(yè)檢測中普及使用。

2.2.2 雙抗夾心ELISA方法

雙抗夾心ELISA方法是酵母檢測的分子免疫學(xué)方法。該方法特異性好、靈敏度高，在細(xì)菌檢測中廣泛使用[36-37]，但由于酵母菌相對(duì)細(xì)菌而言菌體很大，包被、捕獲及檢測過程中極易造成損失，致使實(shí)際檢測結(jié)果偏低，使用抗活酵母細(xì)胞的多克隆抗體的ELISA技術(shù)對(duì)乳制品中腐敗酵母物種的檢測和計(jì)數(shù)是有限的[20]。酵母菌的ELISA檢測方法主要用于檢測酵母菌體蛋白，建立方法穩(wěn)定性良好，精確度高，特異性強(qiáng)，最低檢測限可達(dá)到6.25 ng/m L，常用于大量樣本的酵母殘留檢測[38]。

2.2.3 膠體金免疫層析法

免疫膠體金技術(shù)(Imm une colloidal gold technique)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體中的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)[39]。酵母菌抗原在隨測試帶移動(dòng)時(shí)與膠粒的檢測物——抗酵母菌抗體復(fù)合物相互作用，形成的復(fù)合體持續(xù)流向檢測區(qū)域固定的特異性酵母菌抗體，形成一道藍(lán)線，該藍(lán)線反映了酵母菌檢測線（T線）的陽性結(jié)果，膠粒與其他特異性抗體反應(yīng)的質(zhì)控線（C線）反映檢測功能正常[40]。該方法與國標(biāo)培養(yǎng)法相比，敏感度為86%，特異度為94%，精確度為90%，檢測時(shí)間在20 min以內(nèi)，是臨床診斷中一個(gè)重大的進(jìn)步，對(duì)于特定分類酵母菌的檢測有重要的參考價(jià)值。

3 結(jié) 論

微生物污染是食品安全中最重要的問題之一，是評(píng)價(jià)食品安全性的重要指標(biāo)[41]。酵母菌污染是引起發(fā)酵乳脹袋、變質(zhì)的主要原因，酵母菌數(shù)是評(píng)定食品污染程度的標(biāo)志。國標(biāo)法對(duì)于乳品中酵母菌的檢測操作繁瑣、耗時(shí)長，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代檢測的需求。

分子診斷技術(shù)主要包括核酸擴(kuò)增技術(shù)和分子免疫學(xué)技術(shù)兩類。這些檢測方法與平板計(jì)數(shù)法相比，具備靈敏度強(qiáng)、準(zhǔn)確性高、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，可以為乳品中酵母菌檢測提供更及時(shí)、有效的檢測結(jié)果，是目前酵母菌檢測的核心技術(shù)。其中熒光定量PCR及其改進(jìn)技術(shù)具有高靈敏度、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性的優(yōu)勢，且乳品環(huán)境不會(huì)干擾擴(kuò)增結(jié)果，是企業(yè)首選的檢測方法。此外，對(duì)于酵母菌的檢測方法一方面傾向于方便、快捷、人性化，因此膠體金試紙條與各類檢測方法的聯(lián)合使用受到廣泛關(guān)注；另一方面，盡管以流式細(xì)胞技術(shù)為代表的新型檢測方法存在成本較高的問題有待進(jìn)一步解決，但隨著科技水平的進(jìn)步，這些新的分子生物診斷技術(shù)檢測結(jié)果更加精準(zhǔn)，功能更加多樣，將在食品行業(yè)、公共衛(wèi)生領(lǐng)域具有更為廣闊的應(yīng)用前景。