萬慧穎，徐敏燕

（四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院皮膚病性病研究所，成都610031）

皮膚惡性黑素瘤是一種起源于表皮正常黑素細胞的惡性腫瘤，其惡性程度高，發(fā)展迅速且預后較差。浸潤及轉(zhuǎn)移是其重要的生物學行為，腫瘤細胞向周圍組織浸潤，并遠處轉(zhuǎn)移，需具備降解細胞外基質(zhì)的能力。

基質(zhì)金屬蛋白酶家族（MMPs）是細胞外基質(zhì)降解必須的鋅離子依賴性內(nèi)源性蛋白酶，能夠特異性降解基底膜的成分[1]。MMPs中的明膠酶是唯一能夠降解基底膜和細胞外基質(zhì)中的Ⅵ型膠原成分的酶，其中的MMP-2和MMP-9發(fā)揮著重要的作用，可以使腫瘤細胞易于突破結(jié)構(gòu)屏障，與腫瘤內(nèi)血管生成、侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)[2]。上皮型鈣黏附蛋白（E-cadherin）是重要的上皮細胞黏附分子，E-cadherin黏附功能的喪失與腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展、侵襲過程密切相關(guān)[3]。目前也有研究表明，細胞膜表面的E-cadherin與MMPs在代謝方面有相關(guān)性[4]。因此本研究采用免疫組織化學方法檢測惡性黑素瘤及色素痣組織中MMP-2、MMP-9和E-cadherin的表達，探討與惡性黑素瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 32例標本均來自四川省人民醫(yī)院皮膚病性病研究所2008年—2014年確診為惡性黑素瘤患者的皮損組織（石蠟包埋組織塊），其中男18例，女14例，年齡36～78歲，平均57歲，所有標本均行病理組織學檢查并經(jīng)2位皮膚病理醫(yī)生明確診斷。按照有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為2組，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者18例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者14例。另設10例確診為色素痣的組織為對照組。

1.2 儀器及試劑 德國SHANDON組織包埋機由德國SHANDON公司生產(chǎn)，Yamato病理組織切片機由日本大和光機工業(yè)株式會社制造。兔抗人MMP-2和MMP-9多克隆抗體購自武漢博士德公司，鼠抗人E-cadherin單克隆抗體和SP試劑盒購自福州邁新公司。

1.3 實驗方法與步驟 采用免疫組化SP法染色和DAB顯色，用已知MMP-2、MMP-9和E-cadherin陽性的組織切片作實驗陽性對照，相同切片以PBS代替一抗作空白對照。實驗步驟：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，將其放進水浴鍋中（100℃）40 min進行抗原熱修復，加3%過氧化氫孵育20 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。分別滴加MMP-2、MMP-9和E-cadherin一抗工作液（工作濃度 1∶100），4℃冰箱中過夜，再按試劑盒說明書進行操作，DAB顯色，光鏡下控制，顯色充分后用自來水終止。蘇木精復染1 min，常規(guī)梯度脫水至封片。

1.4 結(jié)果判斷 MMP-2和MMP-9主要表達于細胞漿內(nèi)，部分胞膜也有表達，出現(xiàn)棕黃色或棕褐色反應物顆粒即為陽性。E-cadherin主要表達在細胞膜及部分胞漿上。顯微鏡下隨機檢測5個獨立高倍視野（×400倍），統(tǒng)計陽性細胞數(shù)并記錄陽性細胞率。根據(jù)陽性細胞染色程度及染色細胞所占百分率進行綜合評分。無任何細胞著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。陽性細胞數(shù)≤5%判定為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分。每張切片的平均著色程度與平均陽性細胞百分率得分相加，得分≤1分者為陰性（-），2～3分者為弱陽性（+），4～6分者為陽性（++），＞6分者為強陽性（+++）。所有的結(jié)果均由2位皮膚病理醫(yī)生進行雙盲讀片決定。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，各組樣本間的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MMP-2免疫組化染色結(jié)果 MMP-2陽性反應主要定位于細胞漿，部分胞膜也有表達，陽性著色呈淡黃色至棕褐色。MMP-2在惡性黑素瘤組織中陽性表達明顯高于色素痣對照組，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=26.98，P=0.001，P＜0.01），見表 1、圖 1。

表1MMP-2免疫組化染色結(jié)果 例

圖1 MMP-2在惡性黑素瘤中主要表達于細胞漿，部分胞膜也有表達（SP染色×400）

2.2 MMP-9免疫組化染色結(jié)果 MMP-9陽性反應主要定位于細胞漿，部分胞膜也有表達，陽性著色呈淡黃色至棕褐色。MMP-9在惡性黑素瘤組織中陽性表達明顯高于色素痣對照組，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=20.91，P=0.001，P＜0.01），見表 2、圖 2。

表2MMP-9免疫組化染色結(jié)果 例

2.3 E-cadherin免疫組化染色結(jié)果 E-cadherin陽性反應定位于細胞膜及部分胞漿，陽性著色呈淡黃色至棕褐色。E-cadherin在惡性黑素瘤組織中陽性表達明顯低于色素痣對照組，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=7.75，P=0.005，P＜0.01），見表 3 及圖 3、4。

圖2 MMP-9在惡性黑素瘤中主要表達于細胞漿，部分胞膜也有表達（SP染色×400）

表3 E-cadherin免疫組化染色結(jié)果 例

圖3 E-cadherin在惡性黑素瘤中主要表達于細胞膜及部分細胞漿（SP染色×400）

2.4 MMP-2、MMP-9和E-cadherin在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的惡性黑素瘤中的表達 MMP-2與MMP-9在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的惡性黑素瘤中陽性表達率均高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P＜0.05，P＜0.01）。E-cadherin在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中陽性表達率低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P＜0.05），見表 4。

表4MMP-2、MMP-9、E-cadherin在惡性黑素瘤中的表達 例

3 討論

皮膚惡性黑素瘤可以廣泛浸潤表皮、真皮及皮下組織，甚至浸潤相鄰器官或組織，并易于侵入血管和淋巴管向遠處轉(zhuǎn)移，其發(fā)展迅速，預后差，死亡率高。近年來隨著分子生物學和人類基因組學的發(fā)展，研究腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的機制，針對腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)蛋白的研究，對早期診斷與治療，判斷預后均具有重要臨床意義。

MMPs是一類能夠降解血管基底膜，水解細胞外基質(zhì)及其他基質(zhì)成分的重要蛋白酶，具有促進腫瘤侵襲及血管形成等關(guān)鍵作用。目前，已經(jīng)有20余種MMPs被發(fā)現(xiàn)，按照其作用底物不同可以分為4大類：膠原酶、明膠酶、基質(zhì)降解素和膜型MMPs[5]。多項研究證實，在上皮源性腫瘤組織中，如肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌及前列腺癌等惡性腫瘤等，均分別發(fā)現(xiàn)MMPs的高表達與腫瘤的轉(zhuǎn)移和預后不良有密切關(guān)系[6]。明膠酶的2個亞型，MMP-2和MMP-9，分子質(zhì)量分別為72 kD和92 kD。MMP-2不僅可以降解細胞外基質(zhì)中的Ⅳ型膠原，有利于腫瘤細胞擴散，還可以通過新生毛細血管促進腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移[7]。MMP-2的陽性率隨著TNM分期逐漸增加，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者陽性表達率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者[8]。MMP-9是MMPs中分子量最大的酶，它以酶原形式分泌，能水解細胞基底膜及細胞外基質(zhì)中Ⅳ型、Ⅴ型膠原和纖維連接蛋白成分，導致基底膜破壞，腫瘤細胞浸潤結(jié)締組織、小血管和淋巴管而發(fā)生轉(zhuǎn)移[9]。

本研究發(fā)現(xiàn)，惡性黑素瘤中MMP-2和MMP-9的表達均顯著高于色素痣，并且與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)性。國內(nèi)余忠平[10]研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9在轉(zhuǎn)移性黑素瘤中陽性表達率顯著高于原位黑素瘤與色素痣。張娟等[11]研究報道，MMP-9在皮膚惡性黑素瘤中的陽性表達率高于交界痣和正常皮膚組織，并隨腫瘤浸潤深度的增加而增高，且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽性表達率大于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。均與筆者的研究結(jié)果一致。

E-cadherin蛋白主要存在于人和動物的上皮細胞中，是鈣黏附蛋白分子家族中的一種跨膜糖蛋白。E-cadherin蛋白通過N端胞外區(qū)鈣離子依賴的同型黏附與鄰近細胞形成連接體，以維持細胞的極性，因此其在細胞的黏著連接處集中表達，可以有效地維持上皮細胞的形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)。E-cadherin蛋白在腫瘤早期浸潤中有調(diào)控作用，其表達下調(diào)或缺失會導致腫瘤細胞連接松散，表達較強的侵襲能力[12]。E-cadherin蛋白表達下調(diào)的患者，其生存率下降，可能就是由于腫瘤細胞脫離了原發(fā)灶，沿淋巴管、血管及組織間隙浸潤并轉(zhuǎn)移，導致死亡率增高[13]。有較多的研究顯示，E-cadherin蛋白表達強度與患者的年齡、性別及病理類型無關(guān)，但與不同TNM分期、腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有顯著相關(guān)性。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床TNM分期晚和腫瘤分化程度差的組織中，E-cadherin蛋白表達顯著下調(diào)或缺失，從而使腫瘤細胞之間的黏附力下降，導致惡性腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移[14]。這與筆者的研究結(jié)果也是完全一致的。

綜上所述，MMP-2和MMP-9在惡性黑素瘤中高表達，E-cadherin蛋白在惡性黑素瘤中低表達，可能與惡性黑素瘤的發(fā)生、發(fā)展、分化和轉(zhuǎn)移過程相關(guān)，聯(lián)合檢測可以作為評估腫瘤侵襲性的指標，但其參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的復雜作用及具體機制仍需要進一步的研究，這些機制的深入研究將對臨床治療與預后判定具有重要的意義。

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