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2018-01-25 07:12:10馬誠義賈金蓉喬禹欣陳國峰
東北農(nóng)業(yè)大學學報 2018年1期
馬 紅，馬誠義，賈金蓉，喬禹欣，陳國峰
（1.東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所，哈爾濱 150010）
野黍[Eriochloa villosa(Thunb.）Kunth.]為早春性禾本科雜草，在大豆、玉米、小麥等作物田間均可發(fā)生[1]。野黍種子依靠風力傳播，具有休眠特性，可抵御外界不良環(huán)境[2-4]，植株葉片密生白色柔毛且分蘗能力強，可減弱除草劑吸收[5]。野黍防治方法主要有物理和化學方法，物理防治利用機械設備或人工方式除草，操作簡單，但人力、物力消耗較大?；瘜W防治利用除草劑除草，具有見效快、除草徹底等優(yōu)點，但有雜草抗藥性問題，增大防治和生產(chǎn)管理難度。煙嘧磺?。∟icosulfuron）為日本石原產(chǎn)業(yè)公司研發(fā)的磺酰脲類內(nèi)吸傳導型除草劑，具有高效、低毒、廣譜、低用量、低殘留和強選擇性等特點[6-8]，常應用于玉米田防除禾本科雜草[9]，在我國除草劑市場占主導地位[10]。近年來由于種植結構調(diào)整，玉米連作現(xiàn)象普遍，連年施用乙酰乳酸合成酶（ALS）抑制劑類除草劑煙嘧磺隆，野黍?qū)熰谆锹】顾幮栽鰪姡纱我s草上升為主要雜草[11-12]。在長期、大量使用單一除草劑情況下，雜草產(chǎn)生抗藥性風險高，但機理及影響因素不同[13]。雜草抗藥性機理主要包括靶標抗性和非靶標抗性機制[14]。靶標基因功能位點發(fā)生氨基酸水平突變會導致靶標酶活性改變，是雜草產(chǎn)生靶標抗性主因[15-17]。薺菜抗性種群ALS第197位脯氨酸（CCT）突變?yōu)榻z氨酸（TCT）是抗性種群ALS對苯磺隆敏感性降低原因[15]。雜草ALS抑制劑被相關酶快速代謝解毒屬于非靶標抗性機制[19]。朱宇耀等發(fā)現(xiàn)煙嘧磺隆對雜草ALS酶活性有顯著抑制作用[20]。Ma等在抗性雜草生物型中，發(fā)現(xiàn)代謝解毒酶超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性增強[21-22]。Timmerman等發(fā)現(xiàn)GST活性和類型是植物抵抗除草劑能力重要指標[23-24]。
目前，針對黑龍江省玉米田野黍種群對煙嘧磺隆抗性研究較少。本研究通過測定噴施煙嘧磺隆后野黍葉片中葉綠素、靶標酶（ALS）、保護酶（SOD、POD）、解毒酶（GSH、GST）等含量和活性變化，為野黍防治提供理論基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
黑龍江省農(nóng)田野黍發(fā)生嚴重地塊采集成熟飽滿野黍種子，布袋干燥避光保存，備用（見表1）。10%煙嘧磺隆懸浮劑，購自佛山市盈輝作物科學有限公司。
1.2 方法
1.2.1 不同抗性水平野黍種群對煙嘧磺隆敏感性測定
在直徑為12 cm盆中裝入3/4無用藥史土壤，壓實并保持土面平整。采用浸盆澆水法，向托盤中注水，使土壤由下至上充分吸水達飽和狀態(tài)。每盆15粒野黍種子，覆1～2 cm細土輕壓。野黍長至3～5葉期時，用背負式4噴頭噴霧器噴施除草劑煙嘧磺隆，煙嘧磺隆用藥量分別為27、54、108、162、216、270、324、378、432、540 a.i.g·hm-2（以有效成分計算）。清水處理為對照組，每處理5次重復。噴藥后在自然條件下培養(yǎng)，觀察野黍變化情況，于施藥后14 d調(diào)查數(shù)據(jù)，計算煙嘧磺隆對野黍鮮重防效。鮮重防效計算公式如下：
根據(jù)鮮重防效計算不同抗性水平野黍種群對煙嘧磺隆抗性線性回歸方程Y=bx+a、地上干重減少50%劑量GR50以及相關系數(shù)R2。設無用藥史荒地野黍種群（M-3）抗性指數(shù)為1.00，以其GR50為標準，得出其他地區(qū)野黍種群抗性指數(shù)RI。RI值＜2為敏感性野黍種群，RI值2～3為中抗性野黍種群，RI值＞3為高抗性野黍種群。
1.2.2 不同抗性水平野黍種群對煙嘧磺隆抗藥性測定
根據(jù)野黍?qū)熰谆锹∶舾行苑磻囼灲Y果，篩選敏感性（S）、中抗性（M）和高抗性（R）3種抗性水平野黍種群，探討野黍?qū)熰谆锹】顾帣C制。于室外自然環(huán)境條件下種植敏感性、中抗性和高抗性3種抗性水平野黍種子，當野黍長至3～5葉期時，用背負式四噴頭噴霧器噴施除草劑煙嘧磺隆，用藥量為54 a.i.g·hm-2。設置空白對照組，每處理40次重復。于處理后2、3、5、7、12、14 d測定各項生理指標。
1.2.2.1 對葉綠素含量影響測定
施藥后觀察3種抗性水平野黍種群植株變化，葉綠素儀（CCM-300）測定其3～5葉期葉綠素含量。
1.2.2.2 對ALS活性影響測定
參照并改進文獻[25]方法，取野黍葉片0.5 g，加液氮研磨，再加1.5 mL酶液，25 000×g 20 min離心，取上清液0.6 mL，提取液定容至1.5 mL后緩慢加入0.45 g（NH4）2SO4粉末，振蕩，0 ℃沉降2 h后，25 000×g 20 min離心，沉降溶于1.2 mL酶溶解液中，即為酶提取液。
取0.4 mL酶提取液，加入緩沖液，再加0.5 mL酶反應液，35℃水浴黑暗條件下反應1 h后，加入0.1 mL 3 mol·L-1的H2SO4終止反應，60℃水浴脫羧15 min，依次加肌酸和甲萘酚，60℃水浴顯色15 min，冷卻后于525 nm波長下比色。
A525為對照管吸光值；ACK為照光管吸光度。
1.2.2.3 對SOD活性影響測定
參照并改進文獻[26]方法，稱取0.2 g野黍葉片放入研缽中，加入2 mL 10 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7），冰浴研磨后，倒入2 mL離心管中，10 000×g冷凍離心20 min，吸取上清液（即為待測酶液）放入試管中，0～4℃下保存待用。配制SOD反應液，以0.05 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.8）130 mmol·L-1、Met 750 μmol·L-1、NBT 100 μmol·L-1、EDTA-Na220 μmol·L-1、FD H2O 按 15∶3∶3∶3∶3∶2.5 配制，依次加入試管中。取10 mL試管，每支試管中先加入5.9 mL SOD反應液，以蒸餾水0.1 mL代替酶提取液，混勻后，其中對照管用雙層黑色硬紙?zhí)渍诠猓c其他試管同時置于26℃4 000 lx光照下反應15 min。反應結束后，以遮光對照管作為空白，在560 nm波長下測定各管吸光度。
ACK為照光對照管吸光值；At為照光管吸光度；V為酶液總體積；Vt為測定時酶液用量；0.5為將NBT還原抑制到對照一半時所需酶量。
1.2.2.4 對POD活性影響測定
參照并改進文獻[27]方法，取5 mL試管，加0.05 mL酶液，每試管加入2 mL 10 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7），加入0.6 mL 1%愈創(chuàng)木酚，37℃水浴5 min，加入0.15 mL 0.1 mol·L-1H2O2后反應開始，對照管加磷酸緩沖液代替酶液，其他與測定管相同，用對照管調(diào)零。在470 nm波長下每隔1 min計數(shù)1次，記錄3 min內(nèi)變化值，以吸光度變化0.01為1個過氧化物酶活性單位（U）表示酶活力。
ΔA470為反應時間內(nèi)吸光度變化；W為植物葉片鮮重（g）；VT為提取酶液總體積（mL）；Vs為測定時取用酶液體積（mL）；t為反應時間（min）。
1.2.2.5 對GSH含量影響測定
參照并改進文獻[28]方法。半胱氨酸可與二硫硝基苯甲酸（DTNB）試劑發(fā)生硫醇-2硫化物交換反應，反應中1分子的半胱氨酸引起1分子硫硝基苯甲基釋放。pH為8時，在412 nm波長下，有強光吸收，比色法定量測定-SH基。GSH含量用μg·mg-1FW表示。
標準曲線制作：用緩沖液配制500 μg·mL-1GSH母液，分別取0、5、10、25、50、75、100、150、250、500、1 000 μL放入試管中，用0℃5%TCA溶液定容至5 mL，取11支潔凈試管，分別加系列溶液0.2 mL，加0.02 mL DTNB顯色液及2.78 mL磷酸緩沖液，412 nm波長下測OD值。以OD值為橫坐標，GSH含量為縱坐標確定回歸方程。
谷胱甘肽含量測定：取野黍葉片0.2 g，加1.2 mL 5%TCA，0～4℃下研磨，再用0.8 mL TCA潤洗后倒入離心管中0～4℃下16 000×g離心15 min，取上清液備用。取0.2 mL提取物+2.78 mL緩沖液(pH 6.8）+0.02 mL DTNB比色。412 nm波長下測定OD值。根據(jù)標準曲線確定谷胱甘肽含量。
1.2.2.6 對GST活性影響測定
參照文獻[29]方法，GST提取：取野黍葉片0.2 g，加入液氮并用研缽研碎，加入0.1 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 6.8，內(nèi)含質(zhì)量分數(shù)為0.5%PVP和1 mmol·L-1PSMF）2 mL（0 ℃），快速研磨，攪拌均勻后，將混合液倒入2 mL離心管中0～4℃下20 000×g離心20 min。上清液即為待測酶液。
比色：1.99 mL緩沖液(pH 6.8）+0.9 mL 3.0 mmol·L-1GSH+10 μL上清液+0.1 mL 30 mol·L-1CDNB，自加入CDNB起開始計時，在340 nm波長下以分光光度計測90～120 s吸光值變化。以無酶提取液同樣反應混合物作空白。
ΔA340為反應時間內(nèi)吸光度變化；ε為產(chǎn)物在340 nm處摩爾吸光系數(shù)9.6×103mmol-1·cm-1；d 為比色皿直徑（cm）；VT為提取酶液總體積（mL）；Vs為測定時取用酶液體積（mL）；t為反應時間（min）。
1.2.3 數(shù)據(jù)處理方法
利用SPSS 17.0軟件作顯著性分析，Excel 2016處理數(shù)據(jù)得出不同抗性水平野黍種群對煙嘧磺隆抗性線性回歸方程Y=bx+a、地上干重減少50%的劑量GR50及相關系數(shù)R2。設GR50最低地區(qū)野黍種群抗性指數(shù)為1.00，得出其他不同抗性水平野黍種群抗性指數(shù)RI。Origin 8繪制折線圖。
2 結果與分析
2.1 不同抗性水平野黍種群對煙嘧磺隆敏感性測定結果
煙嘧磺隆施用后14 d，不同抗性水平野黍種群鮮重防效結果見表2。
以無藥史荒地野黍種群（M-3）為標準，計算其他野黍種群抗性指數(shù)，結果表明，施用煙嘧磺隆后，M-3 GR50值最低，對煙嘧磺隆最敏感，驗證野黍?qū)熰谆锹∶舾行?，以M-3GR50=10.8454為標準，設其抗性指數(shù)為1.00計算其他野黍種群抗性指數(shù)。M-3、M-9和M-5野黍種群抗性指數(shù)分別為1.00、1.19和1.57，為敏感性野黍種群；M-6、X-1和M-2野黍種群抗性指數(shù)分別為2.05、2.08和2.11，為中抗性野黍種群；M-16、M-1、X-3和X-2野黍種群抗性指數(shù)分別為3.23、4.51、6.48和8.30，為高抗性野黍種群。由此選定X-2野黍種群作為高抗性野黍種群（R），X-1野黍種群作為中抗性野黍種群（M），M-3野黍種群作為敏感性野黍種群（S）。以不同抗性群作為研究對象，進一步研究野黍?qū)熰谆锹】顾帣C制。
表2 不同抗性水平野黍種群對煙嘧磺隆抗性回歸方程及抗性指數(shù)Table2 Regression equation and resistance index of Eriochloa villosa in different levels to nicosulfuron
2.2 野黍?qū)熰谆锹】顾幮詼y定結果
2.2.1 對葉綠素含量影響結果
由圖1可知，高、中抗性和敏感性野黍種群在噴施煙嘧磺隆后，葉綠素含量隨施藥天數(shù)增加呈先降后升趨勢，表明煙嘧磺隆影響野黍葉片光合作用，葉綠素含量降低。
施藥后第2天，3種抗性水平野黍種群葉綠素含量對照值分別為：235.14、204.23、165.36 mg·m-2，處理后值為：222.15、182.47、145.79 mg·m-2，均低于各自對照，差異顯著（P＜0.05）。施藥后第5天，高、中抗性野黍種群葉綠素含量開始升高，敏感性野黍種群葉綠素含量無顯著變化。施藥后第14天，高抗性野黍種群葉綠素含量高于對照，中抗性野黍種群葉綠素含量接近對照，敏感性野黍種群葉綠素含量仍低于對照，且差異顯著（P＜0.05）。不同抗性水平野黍種群葉綠素含量變化不同，高抗性野黍種群（R）葉綠素含量受煙嘧磺隆脅迫前后均高于中抗性野黍種群（M）和敏感性野黍種群（S），葉綠素含量下降幅度較小，最終高于對照。
圖1 煙嘧磺隆對不同抗性水平野黍種群葉綠素含量影響Fig.1 Effects of nicosulfuron on chlorophyll content of different resistance levels Eriochloa villosa
2.2.2 對ALS活性影響結果
由圖2可知，高、中抗性野黍種群在噴施煙嘧磺隆后，ALS酶活性隨施藥天數(shù)增加呈先降后升趨勢，敏感性野黍種群ALS酶活性隨施藥天數(shù)增加逐漸降低。
施藥2 d后，3種抗性野黍種群ALS酶活性對照值為：87.57、80.26、69.93 nmol·mg-1·h-1，處理后值分別為：76.45、69.32、63.03 nmol·mg-1·h-1，均低于各自對照，差異性顯著（P＜0.05）；施藥后第5天，高、中抗性野黍種群ALS酶活性升高，敏感性野黍種群ALS酶活性降低；施藥后第14天，3種抗性野黍種群ALS酶活性分別為86.15、70.48、52.73 nmol·mg-1·h-1，高抗性野黍種群 ALS 酶活性與對照（88.57 nmol·mg-1·h-1）接近，中抗性與敏感性野黍種群ALS酶活性均低于對照（80.82、70.49 nmol·mg-1·h-1）。施藥后高抗性野黍種群ALS酶活性逐漸恢復，中抗性野黍種群ALS活性逐漸升高，但未達對照水平；敏感性野黍種群ALS活性呈下降趨勢，低于對照。
2.2.3 對SOD活性影響結果
由圖3可知，高、中抗性和敏感性野黍種群在噴施煙嘧磺隆后，SOD活性隨施藥天數(shù)增加呈先降后升趨勢。施藥后第2天，高、中抗性水平和敏感性野黍種群SOD活性分別為：160.72、158.35、156.91 U·mg-1FW，處理后為：155.26、150.37、144.74 U·mg-1FW，均低于各自對照，差異性顯著（P＜0.05）。施藥后第5天，高、中抗性水平野黍種群SOD活性升高，敏感性野黍種群SOD活性降低；施藥后第7天，3種抗性野黍種群SOD活性全部升高；施藥后第14天，高、中抗性水平野黍種群SOD活性均高于各自對照，而敏感性野黍種群SOD活性雖然增高但低于對照。
2.2.4 對POD活性影響結果
由圖4可知，高、中抗性和敏感性野黍種群在噴施煙嘧磺隆后，POD活性隨噴藥天數(shù)增加均呈先降后升趨勢。施藥后第2天，高、中抗性和敏感性野黍種群POD活性對照值為：232.26、201.57、180.18 U·g-1·min-1，處理后為：217.28、185.72、160.84 U·g-1·min-1，均低于對照且差異性顯著（P＜0.05）；施藥后第5天不同抗性水平野黍種群POD活性升高；施藥后第14天，3種抗性野黍種群POD活性，對照為：228.24、201.62、178.04 U·g-1·min-1，處理后為235.38、198.63、170.18 U·g-1·min-1，其中高抗性野黍種群POD活性高于對照，中抗性野黍種群POD活性接近對照，敏感性野黍種群POD活性低于對照，差異顯著（P＜0.05）。
圖2 煙嘧磺隆對不同抗性水平野黍種群ALS活性影響Fig.2 Effects of nicosulfuron on ALS activity of different resistance levels Eriochloa villosa
圖3 煙嘧磺隆對不同抗性水平野黍種群SOD活性影響Fig.3 Effects of nicosulfuron on SOD activity of different resistance levels Eriochloa villosa
圖4 煙嘧磺隆對不同抗性水平野黍種群POD活性影響Fig.4 Effects of nicosulfuron on POD activity of different resistance levels Eriochloa villosa
2.2.5 對GSH活性影響結果
由圖5可知，高、中抗性和敏感性野黍種群在噴施煙嘧磺隆后，GSH含量隨時間增加呈先降后升趨勢。
施藥后第2天，3種抗性野黍種群GSH含量對照為：23.15、20.26、16.17 μg·mg-1FW，處理后為：13.29、12.36、10.42 μg·mg-1FW，均低與各自對照，差異顯著（P＜0.05）；施藥后第5天，3種抗性水平野黍種群GSH含量開始增加，施藥后第14天，3種抗性水平野黍種群分別為：對照23.42、19.41、16.72 μg·mg-1FW，處理后 25.24、15.36、9.06 μg·mg-1FW，差異顯著（P＜0.05）。高抗性野黍種群GSH含量高于對照，中抗性野黍種群接近對照，敏感性野黍種群低于對照。
圖5 煙嘧磺隆對不同抗性水平野黍種群GSH含量影響Fig.5 Effects of nicosulfuron on GSH content of different resistance levels Eriochloa villosa
2.2.6 對GST活性影響結果
由圖6可知，高、中抗性野黍種群在噴施煙嘧磺隆后，GST含量隨施藥天數(shù)增加呈先降后升趨勢，敏感性野黍種群GST含量隨施藥天數(shù)增加而逐漸降低。施藥后第2天，高、中抗性和敏感性野黍種群GST含量對照為：638.52、555.82、500.49 U·min-1·mg-1protein，處理后為：480.72、460.47、420.28 U·min-1·mg-1protein，均低于對照，差異顯著（P＜0.05）。施藥后第5天，高、中抗性水平的野黍種群GST含量開始升高，而敏感性野黍種群GST含量持續(xù)降低；施藥后第14天，3種抗性水平野黍種群GST含量分別為650.62、535.19、355.26 U·min-1·mg-1protein，高抗性野黍種群 GST含量高于對照（630.36 U·min-1·mg-1protein），中抗性與敏感性野黍種群GST含量均低于對照（558.28、470.25 U·min-1·mg-1protein）。
圖6 煙嘧磺隆對不同抗性水平野黍種群GST活性影響Fig.6 Effects of nicosulfuron on GST activity of different resistance levels Eriochloa villosa
3 討論與結論
多數(shù)除草劑直接或間接影響雜草光合作用。葉綠素捕獲光能并開展光能轉(zhuǎn)換，其含量與植物捕獲光能能力呈正相關，可反映作物光合能力及同化產(chǎn)物積累能力[30]。張紅剛等利用煙嘧磺隆處理黃芩葉片研究表明，煙嘧磺隆破壞黃芩葉片脂膜系統(tǒng)影響光合作用，葉綠素含量下降[31]。本研究結果表明，煙嘧磺隆使野黍葉片中葉綠素含量下降，高、中抗性水平野黍種群葉片中葉綠素含量隨施藥天數(shù)增加呈先降后升趨勢，說明高、中抗性水平野黍種群受煙嘧磺隆作用后可恢復。敏感性野黍種群葉片中葉綠素含量隨施藥天數(shù)增加而降低，說明敏感性野黍種群受煙嘧磺隆作用后不可恢復。同時說明不同抗性野黍種群受煙嘧磺隆脅迫后，高抗性水平野黍種群葉綠素合成受抑制或破壞程度顯著低于低抗性水平野黍種群。
煙嘧磺隆是一種高效磺酰脲類除草劑，其作用靶標為乙酰乳酸合成酶（ALS）[21]，通過抑制ALS酶活力間接抑制支鏈氨基酸亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸生物合成，阻礙蛋白質(zhì)生物合成抑制植物細胞分裂，導致植株黃化退綠死亡[32]。本試驗研究結果表明，不同抗性野黍種群受到煙嘧磺隆脅迫后，高、中抗性野黍種群ALS酶活性隨施藥天數(shù)增加呈先降后升趨勢，均接近對照，敏感性野黍種群ALS酶活性隨施藥天數(shù)增加降低，不同抗性野黍種群ALS酶活性均受煙嘧磺隆影響，說明煙嘧磺隆作用于野黍種群靶標位點導致野黍ALS酶活性受抑制。抗性程度越高ALS活性越高，與孫秀榮等用煙嘧磺隆防除玉米田一年生禾本科雜草結果一致[33]。但本研究僅分析不同抗性野黍種群ALS酶活性，缺乏分子生物學上抗性野黍種群ALS酶基因序列研究，后續(xù)研究應明確其是否存在靶標抗性。
本研究中野黍受到煙嘧磺隆脅迫后，不同抗性水平野黍種群超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性均受抑制，之后3種抗性水平野黍種群SOD、POD活性均逐漸恢復，與姜孝玉等植物受除草劑脅迫時SOD、POD活性迅速增強對活性氧抵御能力研究結果一致[34]。3種抗性水平野黍種群SOD、POD均呈先降后升趨勢，高抗性野黍種群SOD、POD高于對照，中抗性野黍種群與對照接近，敏感性野黍種群低于對照，表明高、中抗藥性野黍種群SOD、POD活性較高且增速較快、活性強，敏感性野黍種群SOD、POD活性恢復較慢、活性弱。
谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）是一類胞質(zhì)酶，可催化谷胱甘肽（GSH）經(jīng)半胱氨酸硫原子與多種疏水性化合物親電子基團連接作用，是生物體脫毒和排毒重要方式[35]。本試驗中不同抗性野黍種群GSH、GST變化趨勢一致，表明GSH與GST酶活性密切相關[36-37]。郭玉蓮等研究表明，GST可促使植物GSH與氯乙酰胺類、三氮苯類、苯氧羧酸類、磺酰脲類及二苯醚類等除草劑產(chǎn)生軛合反應[38]。本文研究結果顯示，抗性野黍種群在煙嘧磺隆脅迫時，通過提高GST活性和GSH含量代謝解毒煙嘧磺隆。但不同抗性野黍種群GST含量變化幅度不同，其中高抗性野黍種群GST含量升幅高于中抗性與敏感性野黍種群。
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馬 紅，馬誠義，賈金蓉，喬禹欣，陳國峰
（1.東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所，哈爾濱 150010）
野黍[Eriochloa villosa(Thunb.）Kunth.]為早春性禾本科雜草，在大豆、玉米、小麥等作物田間均可發(fā)生[1]。野黍種子依靠風力傳播，具有休眠特性，可抵御外界不良環(huán)境[2-4]，植株葉片密生白色柔毛且分蘗能力強，可減弱除草劑吸收[5]。野黍防治方法主要有物理和化學方法，物理防治利用機械設備或人工方式除草，操作簡單，但人力、物力消耗較大?；瘜W防治利用除草劑除草，具有見效快、除草徹底等優(yōu)點，但有雜草抗藥性問題，增大防治和生產(chǎn)管理難度。煙嘧磺?。∟icosulfuron）為日本石原產(chǎn)業(yè)公司研發(fā)的磺酰脲類內(nèi)吸傳導型除草劑，具有高效、低毒、廣譜、低用量、低殘留和強選擇性等特點[6-8]，常應用于玉米田防除禾本科雜草[9]，在我國除草劑市場占主導地位[10]。近年來由于種植結構調(diào)整，玉米連作現(xiàn)象普遍，連年施用乙酰乳酸合成酶（ALS）抑制劑類除草劑煙嘧磺隆，野黍?qū)熰谆锹】顾幮栽鰪姡纱我s草上升為主要雜草[11-12]。在長期、大量使用單一除草劑情況下，雜草產(chǎn)生抗藥性風險高，但機理及影響因素不同[13]。雜草抗藥性機理主要包括靶標抗性和非靶標抗性機制[14]。靶標基因功能位點發(fā)生氨基酸水平突變會導致靶標酶活性改變，是雜草產(chǎn)生靶標抗性主因[15-17]。薺菜抗性種群ALS第197位脯氨酸（CCT）突變?yōu)榻z氨酸（TCT）是抗性種群ALS對苯磺隆敏感性降低原因[15]。雜草ALS抑制劑被相關酶快速代謝解毒屬于非靶標抗性機制[19]。朱宇耀等發(fā)現(xiàn)煙嘧磺隆對雜草ALS酶活性有顯著抑制作用[20]。Ma等在抗性雜草生物型中，發(fā)現(xiàn)代謝解毒酶超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性增強[21-22]。Timmerman等發(fā)現(xiàn)GST活性和類型是植物抵抗除草劑能力重要指標[23-24]。
目前，針對黑龍江省玉米田野黍種群對煙嘧磺隆抗性研究較少。本研究通過測定噴施煙嘧磺隆后野黍葉片中葉綠素、靶標酶（ALS）、保護酶（SOD、POD）、解毒酶（GSH、GST）等含量和活性變化，為野黍防治提供理論基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
黑龍江省農(nóng)田野黍發(fā)生嚴重地塊采集成熟飽滿野黍種子，布袋干燥避光保存，備用（見表1）。10%煙嘧磺隆懸浮劑，購自佛山市盈輝作物科學有限公司。
1.2 方法
1.2.1 不同抗性水平野黍種群對煙嘧磺隆敏感性測定
在直徑為12 cm盆中裝入3/4無用藥史土壤，壓實并保持土面平整。采用浸盆澆水法，向托盤中注水，使土壤由下至上充分吸水達飽和狀態(tài)。每盆15粒野黍種子，覆1～2 cm細土輕壓。野黍長至3～5葉期時，用背負式4噴頭噴霧器噴施除草劑煙嘧磺隆，煙嘧磺隆用藥量分別為27、54、108、162、216、270、324、378、432、540 a.i.g·hm-2（以有效成分計算）。清水處理為對照組，每處理5次重復。噴藥后在自然條件下培養(yǎng)，觀察野黍變化情況，于施藥后14 d調(diào)查數(shù)據(jù)，計算煙嘧磺隆對野黍鮮重防效。鮮重防效計算公式如下：
根據(jù)鮮重防效計算不同抗性水平野黍種群對煙嘧磺隆抗性線性回歸方程Y=bx+a、地上干重減少50%劑量GR50以及相關系數(shù)R2。設無用藥史荒地野黍種群（M-3）抗性指數(shù)為1.00，以其GR50為標準，得出其他地區(qū)野黍種群抗性指數(shù)RI。RI值＜2為敏感性野黍種群，RI值2～3為中抗性野黍種群，RI值＞3為高抗性野黍種群。
1.2.2 不同抗性水平野黍種群對煙嘧磺隆抗藥性測定
根據(jù)野黍?qū)熰谆锹∶舾行苑磻囼灲Y果，篩選敏感性（S）、中抗性（M）和高抗性（R）3種抗性水平野黍種群，探討野黍?qū)熰谆锹】顾帣C制。于室外自然環(huán)境條件下種植敏感性、中抗性和高抗性3種抗性水平野黍種子，當野黍長至3～5葉期時，用背負式四噴頭噴霧器噴施除草劑煙嘧磺隆，用藥量為54 a.i.g·hm-2。設置空白對照組，每處理40次重復。于處理后2、3、5、7、12、14 d測定各項生理指標。
1.2.2.1 對葉綠素含量影響測定
施藥后觀察3種抗性水平野黍種群植株變化，葉綠素儀（CCM-300）測定其3～5葉期葉綠素含量。
1.2.2.2 對ALS活性影響測定
參照并改進文獻[25]方法，取野黍葉片0.5 g，加液氮研磨，再加1.5 mL酶液，25 000×g 20 min離心，取上清液0.6 mL，提取液定容至1.5 mL后緩慢加入0.45 g（NH4）2SO4粉末，振蕩，0 ℃沉降2 h后，25 000×g 20 min離心，沉降溶于1.2 mL酶溶解液中，即為酶提取液。
取0.4 mL酶提取液，加入緩沖液，再加0.5 mL酶反應液，35℃水浴黑暗條件下反應1 h后，加入0.1 mL 3 mol·L-1的H2SO4終止反應，60℃水浴脫羧15 min，依次加肌酸和甲萘酚，60℃水浴顯色15 min，冷卻后于525 nm波長下比色。
A525為對照管吸光值；ACK為照光管吸光度。
1.2.2.3 對SOD活性影響測定
參照并改進文獻[26]方法，稱取0.2 g野黍葉片放入研缽中，加入2 mL 10 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7），冰浴研磨后，倒入2 mL離心管中，10 000×g冷凍離心20 min，吸取上清液（即為待測酶液）放入試管中，0～4℃下保存待用。配制SOD反應液，以0.05 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.8）130 mmol·L-1、Met 750 μmol·L-1、NBT 100 μmol·L-1、EDTA-Na220 μmol·L-1、FD H2O 按 15∶3∶3∶3∶3∶2.5 配制，依次加入試管中。取10 mL試管，每支試管中先加入5.9 mL SOD反應液，以蒸餾水0.1 mL代替酶提取液，混勻后，其中對照管用雙層黑色硬紙?zhí)渍诠猓c其他試管同時置于26℃4 000 lx光照下反應15 min。反應結束后，以遮光對照管作為空白，在560 nm波長下測定各管吸光度。
ACK為照光對照管吸光值；At為照光管吸光度；V為酶液總體積；Vt為測定時酶液用量；0.5為將NBT還原抑制到對照一半時所需酶量。
1.2.2.4 對POD活性影響測定
參照并改進文獻[27]方法，取5 mL試管，加0.05 mL酶液，每試管加入2 mL 10 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7），加入0.6 mL 1%愈創(chuàng)木酚，37℃水浴5 min，加入0.15 mL 0.1 mol·L-1H2O2后反應開始，對照管加磷酸緩沖液代替酶液，其他與測定管相同，用對照管調(diào)零。在470 nm波長下每隔1 min計數(shù)1次，記錄3 min內(nèi)變化值，以吸光度變化0.01為1個過氧化物酶活性單位（U）表示酶活力。
ΔA470為反應時間內(nèi)吸光度變化；W為植物葉片鮮重（g）；VT為提取酶液總體積（mL）；Vs為測定時取用酶液體積（mL）；t為反應時間（min）。
1.2.2.5 對GSH含量影響測定
參照并改進文獻[28]方法。半胱氨酸可與二硫硝基苯甲酸（DTNB）試劑發(fā)生硫醇-2硫化物交換反應，反應中1分子的半胱氨酸引起1分子硫硝基苯甲基釋放。pH為8時，在412 nm波長下，有強光吸收，比色法定量測定-SH基。GSH含量用μg·mg-1FW表示。
標準曲線制作：用緩沖液配制500 μg·mL-1GSH母液，分別取0、5、10、25、50、75、100、150、250、500、1 000 μL放入試管中，用0℃5%TCA溶液定容至5 mL，取11支潔凈試管，分別加系列溶液0.2 mL，加0.02 mL DTNB顯色液及2.78 mL磷酸緩沖液，412 nm波長下測OD值。以OD值為橫坐標，GSH含量為縱坐標確定回歸方程。
谷胱甘肽含量測定：取野黍葉片0.2 g，加1.2 mL 5%TCA，0～4℃下研磨，再用0.8 mL TCA潤洗后倒入離心管中0～4℃下16 000×g離心15 min，取上清液備用。取0.2 mL提取物+2.78 mL緩沖液(pH 6.8）+0.02 mL DTNB比色。412 nm波長下測定OD值。根據(jù)標準曲線確定谷胱甘肽含量。
1.2.2.6 對GST活性影響測定
參照文獻[29]方法，GST提取：取野黍葉片0.2 g，加入液氮并用研缽研碎，加入0.1 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 6.8，內(nèi)含質(zhì)量分數(shù)為0.5%PVP和1 mmol·L-1PSMF）2 mL（0 ℃），快速研磨，攪拌均勻后，將混合液倒入2 mL離心管中0～4℃下20 000×g離心20 min。上清液即為待測酶液。
比色：1.99 mL緩沖液(pH 6.8）+0.9 mL 3.0 mmol·L-1GSH+10 μL上清液+0.1 mL 30 mol·L-1CDNB，自加入CDNB起開始計時，在340 nm波長下以分光光度計測90～120 s吸光值變化。以無酶提取液同樣反應混合物作空白。
ΔA340為反應時間內(nèi)吸光度變化；ε為產(chǎn)物在340 nm處摩爾吸光系數(shù)9.6×103mmol-1·cm-1；d 為比色皿直徑（cm）；VT為提取酶液總體積（mL）；Vs為測定時取用酶液體積（mL）；t為反應時間（min）。
1.2.3 數(shù)據(jù)處理方法
利用SPSS 17.0軟件作顯著性分析，Excel 2016處理數(shù)據(jù)得出不同抗性水平野黍種群對煙嘧磺隆抗性線性回歸方程Y=bx+a、地上干重減少50%的劑量GR50及相關系數(shù)R2。設GR50最低地區(qū)野黍種群抗性指數(shù)為1.00，得出其他不同抗性水平野黍種群抗性指數(shù)RI。Origin 8繪制折線圖。
2 結果與分析
2.1 不同抗性水平野黍種群對煙嘧磺隆敏感性測定結果
煙嘧磺隆施用后14 d，不同抗性水平野黍種群鮮重防效結果見表2。
以無藥史荒地野黍種群（M-3）為標準，計算其他野黍種群抗性指數(shù)，結果表明，施用煙嘧磺隆后，M-3 GR50值最低，對煙嘧磺隆最敏感，驗證野黍?qū)熰谆锹∶舾行?，以M-3GR50=10.8454為標準，設其抗性指數(shù)為1.00計算其他野黍種群抗性指數(shù)。M-3、M-9和M-5野黍種群抗性指數(shù)分別為1.00、1.19和1.57，為敏感性野黍種群；M-6、X-1和M-2野黍種群抗性指數(shù)分別為2.05、2.08和2.11，為中抗性野黍種群；M-16、M-1、X-3和X-2野黍種群抗性指數(shù)分別為3.23、4.51、6.48和8.30，為高抗性野黍種群。由此選定X-2野黍種群作為高抗性野黍種群（R），X-1野黍種群作為中抗性野黍種群（M），M-3野黍種群作為敏感性野黍種群（S）。以不同抗性群作為研究對象，進一步研究野黍?qū)熰谆锹】顾帣C制。
表2 不同抗性水平野黍種群對煙嘧磺隆抗性回歸方程及抗性指數(shù)Table2 Regression equation and resistance index of Eriochloa villosa in different levels to nicosulfuron
2.2 野黍?qū)熰谆锹】顾幮詼y定結果
2.2.1 對葉綠素含量影響結果
由圖1可知，高、中抗性和敏感性野黍種群在噴施煙嘧磺隆后，葉綠素含量隨施藥天數(shù)增加呈先降后升趨勢，表明煙嘧磺隆影響野黍葉片光合作用，葉綠素含量降低。
施藥后第2天，3種抗性水平野黍種群葉綠素含量對照值分別為：235.14、204.23、165.36 mg·m-2，處理后值為：222.15、182.47、145.79 mg·m-2，均低于各自對照，差異顯著（P＜0.05）。施藥后第5天，高、中抗性野黍種群葉綠素含量開始升高，敏感性野黍種群葉綠素含量無顯著變化。施藥后第14天，高抗性野黍種群葉綠素含量高于對照，中抗性野黍種群葉綠素含量接近對照，敏感性野黍種群葉綠素含量仍低于對照，且差異顯著（P＜0.05）。不同抗性水平野黍種群葉綠素含量變化不同，高抗性野黍種群（R）葉綠素含量受煙嘧磺隆脅迫前后均高于中抗性野黍種群（M）和敏感性野黍種群（S），葉綠素含量下降幅度較小，最終高于對照。
圖1 煙嘧磺隆對不同抗性水平野黍種群葉綠素含量影響Fig.1 Effects of nicosulfuron on chlorophyll content of different resistance levels Eriochloa villosa
2.2.2 對ALS活性影響結果
由圖2可知，高、中抗性野黍種群在噴施煙嘧磺隆后，ALS酶活性隨施藥天數(shù)增加呈先降后升趨勢，敏感性野黍種群ALS酶活性隨施藥天數(shù)增加逐漸降低。
施藥2 d后，3種抗性野黍種群ALS酶活性對照值為：87.57、80.26、69.93 nmol·mg-1·h-1，處理后值分別為：76.45、69.32、63.03 nmol·mg-1·h-1，均低于各自對照，差異性顯著（P＜0.05）；施藥后第5天，高、中抗性野黍種群ALS酶活性升高，敏感性野黍種群ALS酶活性降低；施藥后第14天，3種抗性野黍種群ALS酶活性分別為86.15、70.48、52.73 nmol·mg-1·h-1，高抗性野黍種群 ALS 酶活性與對照（88.57 nmol·mg-1·h-1）接近，中抗性與敏感性野黍種群ALS酶活性均低于對照（80.82、70.49 nmol·mg-1·h-1）。施藥后高抗性野黍種群ALS酶活性逐漸恢復，中抗性野黍種群ALS活性逐漸升高，但未達對照水平；敏感性野黍種群ALS活性呈下降趨勢，低于對照。
2.2.3 對SOD活性影響結果
由圖3可知，高、中抗性和敏感性野黍種群在噴施煙嘧磺隆后，SOD活性隨施藥天數(shù)增加呈先降后升趨勢。施藥后第2天，高、中抗性水平和敏感性野黍種群SOD活性分別為：160.72、158.35、156.91 U·mg-1FW，處理后為：155.26、150.37、144.74 U·mg-1FW，均低于各自對照，差異性顯著（P＜0.05）。施藥后第5天，高、中抗性水平野黍種群SOD活性升高，敏感性野黍種群SOD活性降低；施藥后第7天，3種抗性野黍種群SOD活性全部升高；施藥后第14天，高、中抗性水平野黍種群SOD活性均高于各自對照，而敏感性野黍種群SOD活性雖然增高但低于對照。
2.2.4 對POD活性影響結果
由圖4可知，高、中抗性和敏感性野黍種群在噴施煙嘧磺隆后，POD活性隨噴藥天數(shù)增加均呈先降后升趨勢。施藥后第2天，高、中抗性和敏感性野黍種群POD活性對照值為：232.26、201.57、180.18 U·g-1·min-1，處理后為：217.28、185.72、160.84 U·g-1·min-1，均低于對照且差異性顯著（P＜0.05）；施藥后第5天不同抗性水平野黍種群POD活性升高；施藥后第14天，3種抗性野黍種群POD活性，對照為：228.24、201.62、178.04 U·g-1·min-1，處理后為235.38、198.63、170.18 U·g-1·min-1，其中高抗性野黍種群POD活性高于對照，中抗性野黍種群POD活性接近對照，敏感性野黍種群POD活性低于對照，差異顯著（P＜0.05）。
圖2 煙嘧磺隆對不同抗性水平野黍種群ALS活性影響Fig.2 Effects of nicosulfuron on ALS activity of different resistance levels Eriochloa villosa
圖3 煙嘧磺隆對不同抗性水平野黍種群SOD活性影響Fig.3 Effects of nicosulfuron on SOD activity of different resistance levels Eriochloa villosa
圖4 煙嘧磺隆對不同抗性水平野黍種群POD活性影響Fig.4 Effects of nicosulfuron on POD activity of different resistance levels Eriochloa villosa
2.2.5 對GSH活性影響結果
由圖5可知，高、中抗性和敏感性野黍種群在噴施煙嘧磺隆后，GSH含量隨時間增加呈先降后升趨勢。
施藥后第2天，3種抗性野黍種群GSH含量對照為：23.15、20.26、16.17 μg·mg-1FW，處理后為：13.29、12.36、10.42 μg·mg-1FW，均低與各自對照，差異顯著（P＜0.05）；施藥后第5天，3種抗性水平野黍種群GSH含量開始增加，施藥后第14天，3種抗性水平野黍種群分別為：對照23.42、19.41、16.72 μg·mg-1FW，處理后 25.24、15.36、9.06 μg·mg-1FW，差異顯著（P＜0.05）。高抗性野黍種群GSH含量高于對照，中抗性野黍種群接近對照，敏感性野黍種群低于對照。
圖5 煙嘧磺隆對不同抗性水平野黍種群GSH含量影響Fig.5 Effects of nicosulfuron on GSH content of different resistance levels Eriochloa villosa
2.2.6 對GST活性影響結果
由圖6可知，高、中抗性野黍種群在噴施煙嘧磺隆后，GST含量隨施藥天數(shù)增加呈先降后升趨勢，敏感性野黍種群GST含量隨施藥天數(shù)增加而逐漸降低。施藥后第2天，高、中抗性和敏感性野黍種群GST含量對照為：638.52、555.82、500.49 U·min-1·mg-1protein，處理后為：480.72、460.47、420.28 U·min-1·mg-1protein，均低于對照，差異顯著（P＜0.05）。施藥后第5天，高、中抗性水平的野黍種群GST含量開始升高，而敏感性野黍種群GST含量持續(xù)降低；施藥后第14天，3種抗性水平野黍種群GST含量分別為650.62、535.19、355.26 U·min-1·mg-1protein，高抗性野黍種群 GST含量高于對照（630.36 U·min-1·mg-1protein），中抗性與敏感性野黍種群GST含量均低于對照（558.28、470.25 U·min-1·mg-1protein）。
圖6 煙嘧磺隆對不同抗性水平野黍種群GST活性影響Fig.6 Effects of nicosulfuron on GST activity of different resistance levels Eriochloa villosa
3 討論與結論
多數(shù)除草劑直接或間接影響雜草光合作用。葉綠素捕獲光能并開展光能轉(zhuǎn)換，其含量與植物捕獲光能能力呈正相關，可反映作物光合能力及同化產(chǎn)物積累能力[30]。張紅剛等利用煙嘧磺隆處理黃芩葉片研究表明，煙嘧磺隆破壞黃芩葉片脂膜系統(tǒng)影響光合作用，葉綠素含量下降[31]。本研究結果表明，煙嘧磺隆使野黍葉片中葉綠素含量下降，高、中抗性水平野黍種群葉片中葉綠素含量隨施藥天數(shù)增加呈先降后升趨勢，說明高、中抗性水平野黍種群受煙嘧磺隆作用后可恢復。敏感性野黍種群葉片中葉綠素含量隨施藥天數(shù)增加而降低，說明敏感性野黍種群受煙嘧磺隆作用后不可恢復。同時說明不同抗性野黍種群受煙嘧磺隆脅迫后，高抗性水平野黍種群葉綠素合成受抑制或破壞程度顯著低于低抗性水平野黍種群。
煙嘧磺隆是一種高效磺酰脲類除草劑，其作用靶標為乙酰乳酸合成酶（ALS）[21]，通過抑制ALS酶活力間接抑制支鏈氨基酸亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸生物合成，阻礙蛋白質(zhì)生物合成抑制植物細胞分裂，導致植株黃化退綠死亡[32]。本試驗研究結果表明，不同抗性野黍種群受到煙嘧磺隆脅迫后，高、中抗性野黍種群ALS酶活性隨施藥天數(shù)增加呈先降后升趨勢，均接近對照，敏感性野黍種群ALS酶活性隨施藥天數(shù)增加降低，不同抗性野黍種群ALS酶活性均受煙嘧磺隆影響，說明煙嘧磺隆作用于野黍種群靶標位點導致野黍ALS酶活性受抑制。抗性程度越高ALS活性越高，與孫秀榮等用煙嘧磺隆防除玉米田一年生禾本科雜草結果一致[33]。但本研究僅分析不同抗性野黍種群ALS酶活性，缺乏分子生物學上抗性野黍種群ALS酶基因序列研究，后續(xù)研究應明確其是否存在靶標抗性。
本研究中野黍受到煙嘧磺隆脅迫后，不同抗性水平野黍種群超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性均受抑制，之后3種抗性水平野黍種群SOD、POD活性均逐漸恢復，與姜孝玉等植物受除草劑脅迫時SOD、POD活性迅速增強對活性氧抵御能力研究結果一致[34]。3種抗性水平野黍種群SOD、POD均呈先降后升趨勢，高抗性野黍種群SOD、POD高于對照，中抗性野黍種群與對照接近，敏感性野黍種群低于對照，表明高、中抗藥性野黍種群SOD、POD活性較高且增速較快、活性強，敏感性野黍種群SOD、POD活性恢復較慢、活性弱。
谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）是一類胞質(zhì)酶，可催化谷胱甘肽（GSH）經(jīng)半胱氨酸硫原子與多種疏水性化合物親電子基團連接作用，是生物體脫毒和排毒重要方式[35]。本試驗中不同抗性野黍種群GSH、GST變化趨勢一致，表明GSH與GST酶活性密切相關[36-37]。郭玉蓮等研究表明，GST可促使植物GSH與氯乙酰胺類、三氮苯類、苯氧羧酸類、磺酰脲類及二苯醚類等除草劑產(chǎn)生軛合反應[38]。本文研究結果顯示，抗性野黍種群在煙嘧磺隆脅迫時，通過提高GST活性和GSH含量代謝解毒煙嘧磺隆。但不同抗性野黍種群GST含量變化幅度不同，其中高抗性野黍種群GST含量升幅高于中抗性與敏感性野黍種群。
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