魏毅東，羅曦，吳方喜，林悅龍，何煒，連玲，謝華安*，張建福*

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，福建福州350019；2.農(nóng)業(yè)部華南雜交水稻種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福州（國家）水稻改良分中心/福建省作物種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地/雜交水稻國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室華南研究基地/福建省作物分子育種工程實(shí)驗(yàn)室/福建省水稻分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350003）

植物轉(zhuǎn)化已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物功能基因研究與作物品種改良。目前常用的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法，由于片段是隨機(jī)插入到基因組中，當(dāng)多個(gè)片段重組到基因組中將影響外源基因的表達(dá)，甚至?xí)斐赏庠椿虺聊?］，且不利于后續(xù)的遺傳分析。為了獲得單一插入片段的轉(zhuǎn)基因植株，早期的研究人員不得不依賴于費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且需要大量基因組DNA的Southern 雜交法進(jìn)行拷貝數(shù)鑒定。隨著實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（Real Time Fluorescence Quantitative PCR，qPCR）技術(shù)的不斷發(fā)展，其已經(jīng)成為快速、靈敏、高效的拷貝數(shù)鑒定方法。目前，qPCR技術(shù)已經(jīng)被用于轉(zhuǎn)基因棉花，小麥，玉米等作物的拷貝數(shù)鑒定［2-4］。本研究選取保守的單拷貝基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH2作為內(nèi)參基因［5,6］，利用基于2-ΔCT相對(duì)定量法的熒光定量PCR技術(shù)，建立了快速，高效的不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線的水稻除草劑草銨膦抗性基因的拷貝數(shù)分析體系，從而簡化了轉(zhuǎn)基因水稻拷貝數(shù)鑒定的流程并提高了檢測(cè)通量。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒模版：pOE-PIMT1（含有草銨膦抗性基因bar），GAPDH2基因PCR產(chǎn)物和UBQ5基因PCR產(chǎn)物。

水稻材料：秈稻航2號(hào)對(duì)照，含有bar基因的OsPIMT1轉(zhuǎn)基因克隆，依次命名為AL1～AL9。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

水稻內(nèi)參基因UBQ5，GAPDH2和抗性基因bar的引物使用Primer premier5軟件設(shè)計(jì)，由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成。

bar基因：

上游引物：GCACCATCGTCAACCACTAC，

下游引物GTCGTCCGTCCACTCCTG;

GAPDH2基因：

上游引物：AAGCCAGCATCCTATGATCAGATT,

下游引物：

CGTAACCCAGAATACCCTTGAGTTT；

UBQ5基因：

上游引物：ACCACTTCGACCGCCACTACT；

下游引物：ACGCCTAAGCCTGCTGGTT。

1.3 基因組DNA提取

采用CTAB法提取水稻葉片DNA［7］，對(duì)提取的DNA進(jìn)行瓊脂糖電泳以及紫外分光法檢測(cè)，保證DNA未降解且無雜質(zhì)污染。

1.4 熒光定量PCR 擴(kuò)增

實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)在96孔板中進(jìn)行，50 μL反應(yīng)體系包含以下成分：25μL 2× FastStart Universal SYBR Green Master （ROX），上下游引物終濃度各為0.3μM，5μL稀釋的DNA（50 ng/μL）。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火延伸60 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)ABI7500儀器標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行溶解曲線分析。

1.5 內(nèi)參基因ubc5和外源基因bar標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

以含有草銨膦抗性基因bar的質(zhì)粒pOE-PIMT1作為標(biāo)準(zhǔn)品，將其進(jìn)行5×梯度稀釋，濃度分別為10 pg/μL，2 pg/μL，0.4 pg/μL, 80 fg/μL，16 fg/μL。同時(shí)以GAPDH2和UBQ5基因的PCR產(chǎn)物為標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋終濃度為0.5 pg/μL，0.1 pg/μL，20 f/μL，4 pg/μL，0.8 fg/μL。

反應(yīng)擴(kuò)增程序按1.3進(jìn)行，最后分別制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 轉(zhuǎn)基因水稻中內(nèi)參基因和外源基因的定量分析

利用已驗(yàn)證的含bar基因的純合單拷貝株系的gDNA用作參比模版，9個(gè)PCR陽性的OsPIMT1轉(zhuǎn)基因克隆植株以及親本航2號(hào)的gDNA為待測(cè)樣品模板，以內(nèi)參基因與抗性基因的檢測(cè)引物進(jìn)行qPCR 檢測(cè)，所得CT值利用2-△△CT法進(jìn)行定量分析。

1.7 轉(zhuǎn)基因植株的Southern雜交分析

將提取的水稻gDNA利用PstI（Takara）進(jìn)行酶切（時(shí)間6 h，溫度37℃，體積250 μL，gDNA 150 μg）。待酶切結(jié)束后，在酶切體系中加入2.5倍體積冰乙醇和100 μL體積3M NaCl溶液混合后-20℃放置30 min，于16 000 g低溫離心10 min。吸棄去上清后，加入55 μL ddH2O溶解DNA，將溶解的DNA與6μL 10× DNA loading buffer混合后上樣電泳。電泳參數(shù)為：0.7%瓊脂糖，2.5 V/cm電泳8 h左右，直至溴酚藍(lán)指示帶跑至底部位置。參照分子克隆第三版［8］，采用毛細(xì)管向上轉(zhuǎn)膜法進(jìn)行DNA印跡，雜交、探針制備和顯色使用AlkPhos Direct Labeling and Detection System （Amersham）進(jìn)行，操作步驟參照廠家說明書。

1.8 轉(zhuǎn)基因后代的分離比分析

秈稻航2號(hào)種子和T1代轉(zhuǎn)基因種子經(jīng)過1 d浸種后，用濕布包裹于37℃催芽。將發(fā)芽的種子播種到盆土中，待第2片葉完全展開后噴施500 mg/mL草銨膦，5 d后將幼苗取出，統(tǒng)計(jì)死亡和存活的幼苗數(shù)量，所得數(shù)據(jù)用SPSS19進(jìn)行卡方統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光定量擴(kuò)增曲線與溶解曲線

3個(gè)基因bar，UBQ5和GAPDH2的擴(kuò)增曲線如圖1所示，結(jié)果表明擴(kuò)增曲線平滑，擴(kuò)增穩(wěn)定。同時(shí)我們對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行溶解曲線測(cè)定，bar、UBQ5和GAPDH2基因的Tm值分別為81.8℃，80.5℃，和78.3℃，溶解曲線均為單一峰，說明引物的特異性較強(qiáng)，在反應(yīng)中無引物二聚體等非特異性擴(kuò)增，適合用于qPCR分析。

圖1 bar, UBQ5, GAPDH2 基因擴(kuò)增曲線與溶解曲線

2.2 熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

以起始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，CT值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別獲得bar，UBQ5和GAPDH2的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。由于2-ΔΔCT對(duì)兩個(gè)基因的擴(kuò)增效率要求很高，需要擴(kuò)增效率一致，而bar基因引物和GAPDH2引物擴(kuò)增效率相近，約95%，符合實(shí)驗(yàn)要求，因此選取GAPDH2這個(gè)內(nèi)參基因用于后續(xù)的拷貝數(shù)分析。

圖2 內(nèi)參基因UBQ5和GAPDH2與外源抗性基因bar的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 基于2-ΔΔCT鑒定T0代轉(zhuǎn)基因水稻的拷貝數(shù)

將所提DNA用于熒光定量PCR分析，由于待測(cè)樣品為T0代植株，因此其插入位點(diǎn)為雜合型，純合單拷貝對(duì)照樣品的RQ值應(yīng)為T0代單拷貝植株RQ值的2倍，而與雙拷貝植株的RQ值相等。通過2-△△CT法將所有樣品與純合單拷貝的參比對(duì)照進(jìn)行比較，結(jié)果表明L1，L2，L4，L5，L6，L8為單拷貝植株，而L3，L7，L9為雙拷貝植株，其余植株為單拷貝轉(zhuǎn)基因植株（圖3）。

圖3 熒光定量鑒定轉(zhuǎn)基因材料拷貝數(shù)

2.4 轉(zhuǎn)基因水稻southern雜交驗(yàn)證與分離比分析

從9個(gè)轉(zhuǎn)基因克隆中選取5個(gè)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行Southern雜交拷貝數(shù)驗(yàn)證，結(jié)果表明L1，L2，L4和L5為單拷貝植株，而L3為雙拷貝植株（圖4），這與qPCR結(jié)果完全一致。為了進(jìn)一步驗(yàn)證qPCR所得的拷貝數(shù)結(jié)果，對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因進(jìn)行草銨膦篩選，陰性與陽性植株數(shù)量進(jìn)行卡方分析，單拷貝植株符合1/3分離比，雙拷貝植株符合1/15分離比（表1）。

圖4 轉(zhuǎn)基因植株的Southern雜交檢測(cè)

表1 轉(zhuǎn)基因水稻后代分離比分析

3 討論與結(jié)論

早期的水稻轉(zhuǎn)化過程中，由于當(dāng)時(shí)基因組測(cè)序尚未完成且水稻組培轉(zhuǎn)化的難度較大，需要Southern雜交鑒定轉(zhuǎn)化事件和拷貝數(shù)分析。隨著基因組測(cè)序的技術(shù)的快速發(fā)展，許多植物，包含水稻的全基因組序列都已測(cè)序完成，內(nèi)源基因的拷貝數(shù)以及序列結(jié)構(gòu)都已十分明確。利用熒光定量PCR技術(shù)，借助于基因組數(shù)據(jù)選取合適的內(nèi)參基因能夠準(zhǔn)確確定轉(zhuǎn)基因作物對(duì)的拷貝數(shù)。近年的研究結(jié)果表明，Southern雜交所得的拷貝數(shù)并不準(zhǔn)確［9-11］。排除Southern雜交實(shí)驗(yàn)誤差，如Southern雜交中酶切不完全，不同片段轉(zhuǎn)膜效率不同等因素；農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化本身存在不確定性，會(huì)發(fā)生大量的基因重排或片段重組［12］，可能導(dǎo)致插入位置附近區(qū)域大片段的復(fù)制或部分重組的發(fā)生，因此需要其他方法進(jìn)一步驗(yàn)證Southern blot拷貝數(shù)［13］。

此外，由于本研究采用2-△△CT法而不依賴于非標(biāo)準(zhǔn)曲線法，提高了檢測(cè)效率和通量，但應(yīng)盡可能排除樣品方面的影響，需要樣品純度較高，擴(kuò)增體系要相對(duì)穩(wěn)定，重復(fù)性好。經(jīng)過2-△△CT法計(jì)算，單拷貝，雙拷貝和三拷貝的RQ值應(yīng)該分別為0.5，1.0以及1.5。實(shí)際定量過程中，一般單拷貝RQ值在0.25～0.75，雙拷貝RQ值在0.75～1.25，三拷貝為1.25～1.75。因此，對(duì)于每個(gè)樣品的CT值誤差應(yīng)當(dāng)控制在0.25以內(nèi)，否則結(jié)果難以確定。雖然本研究選用了bar基因進(jìn)行檢測(cè)，但只要更換外源基因引物即可檢測(cè)潮霉素抗性基因HPTII，新霉素抗性基因NPTII等多種抗性基因。

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