吳 霄，李 果，敖 政，石俊松，蔡更元，劉德武，吳珍芳，李紫聰

（1.華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院/國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642；2.廣東溫氏種豬科技有限公司育種部，廣東 新興 527439）

豬克隆技術(shù)已成功應用于優(yōu)良種畜擴繁、轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)等領(lǐng)域，但目前豬克隆胚胎發(fā)育至出生的效率只有0.3%～1%，導致豬克隆技術(shù)的效率仍然很低，這嚴重限制了豬克隆技術(shù)的發(fā)展及推廣［1］。大量研究表明，克隆效率低下的主要原因是體細胞核的表觀重編程錯誤或不完全［2］。重編程涉及大量復雜的表觀遺傳修飾，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、X染色體失活、基因組印跡等。

組蛋白甲基化是一種重要的組蛋白修飾，其主要發(fā)生在賴氨酸和精氨酸側(cè)鏈，例如H3K4me3、H3K9me3、H3K27me3這些修飾影響著基因表達的轉(zhuǎn)錄抑制或轉(zhuǎn)錄起始。目前，H3K9me3已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)是誘導多能干細胞（induced Pluripotent Stem Cells，iPSC）重編程的主要障礙。Soufi等［3］研究發(fā)現(xiàn)，許多重編程失敗的區(qū)域往往是H3K9me3的富集區(qū)域，并且通過敲除相關(guān)的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SUV39H1/2來阻斷H3K9me3，可以“顯著加速”重編程過程。在小鼠的體細胞克隆中，H3K9me3被確定是供體細胞基因組重編程的一個主要障礙，其在克隆胚胎發(fā)育早期沉默，導致克隆胚胎難以正常發(fā)育［4-5］。Matoba 等［6］通過異位表達H3K9me3去甲基化酶KDM4D去除了H3K9me3修飾，不僅可以重激活大多數(shù)的重編程抵抗區(qū)（reprogramming resistant regions，RRRs）的表達，還將小鼠克隆胚胎的囊胚率提高到84.9%。此外，Chung等［7］向小鼠克隆胚胎顯微注射人源KDM4A的mRNA，仍然可以大幅度提高（90.3%）克隆小鼠的囊胚率。

由上可知，供體細胞來源的H3K9me3是導致克隆胚胎基因沉默的一種重要表觀遺傳標記［8］。已有研究表明，豬的體細胞存在高水平的H3K9me3修飾［9］，這也可能是阻礙豬克隆胚胎發(fā)育的一個因素。目前，通過在豬克隆胚胎中去除H3K9me3修飾提高其發(fā)育效率的相關(guān)研究未見報道。鑒于豬H3K9me3去甲基化酶基因的全長序列仍未確定，本研究在豬克隆胚胎中通過異位表達鼠源KDM4B/KDM4D mRNA的方法去除H3K9me3修飾，以期提高豬克隆胚胎的發(fā)育效率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 質(zhì)粒、細胞株和豬克隆胚胎 小鼠KDM4B/KDM4D-pcDNA3.1（+）真核表達載體由蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司合成；豬胎兒成纖維細胞采自廣東溫氏食品集團華農(nóng)溫氏股份有限公司水臺原種豬場；豬克隆胚胎由廣東溫氏食品集團股份有限公司研究院現(xiàn)代育種技術(shù)中心克隆實驗室負責提供。

1.1.2 主要試劑 細胞與胚胎免疫熒光檢測蛋白表達試劑盒購自Life Technologies公司；組蛋白H3K9me3免疫熒光所用抗體購自Abcam生物公司；體外轉(zhuǎn)錄試劑盒mMESSAGE mMACHINE?T7 Kit購自 Life Technologies公司；PrimeSTAR HS DNA Polymerase購自Clontech公司；普通質(zhì)粒DNA小提試劑盒（E.Z.N.A?Mini Plasmid Kit）、DNA 純化試劑盒（E.Z.N.A?DNA Cycle Pure Kit）；胚胎注射級水購自Sigma公司；限制性內(nèi)切酶HindIII、XhoI、BamHI購自廣州昂科生物技術(shù)有限公司；溴化乙錠（Ethidium Bromide，EB）購自廣州康龍生物科技有限公司；蛋白胨（Tryptone）、酵母浸出物（Yeast Extract）、瓊脂糖（Agar）均購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 小鼠KDM4B/KDM4D基因克隆 從NCBI獲悉小鼠KDM4B（NM_172132.2）、KDM4D（NM_173433.2）基因序列，序列大小分別是3279、1 551 bp。利用質(zhì)粒分析軟件，找到合適的酶切位點，將2條基因序列的編碼區(qū)序列構(gòu)建至pcDNA3.1（+）雙核表達載體（圖1）。交由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，共構(gòu)建了2個基因表達載體。

1.2.2 酶切鑒定 將基因合成所得的穿刺菌接種于氨芐抗性平板中，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h。挑取數(shù)個單克隆進行培養(yǎng)，進行菌液PCR鑒定，鑒定出的單克隆利用DNA小提試劑盒進行質(zhì)粒抽提。抽提的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶HindIII/XhoI進行酶切鑒定。

1.2.3 KDMB/D基因體外轉(zhuǎn)錄及加poly（A）尾 利用XhoI限制性內(nèi)切酶線性化表達載體KDM4B/KDM4D，再利用DNA 純化試劑盒純化回收線性化載體。然后根據(jù)轉(zhuǎn)錄試劑盒進行體外轉(zhuǎn)錄，用E. coliPoly（A） Polymerase （NEB）對產(chǎn)物進行加poly A反應，獲取穩(wěn)定的mRNA用于后期豬克隆胚胎胞漿顯微注射。

圖1 pcDNA3.1（+）載體圖譜

1.2.4 胞漿顯微注射小鼠KDM4B/KDM4DmRNA 通過胞漿顯微注射的方法將KDM4B/KDM4DmRNA注射入克隆胚胎中，mRNA 終濃度為2 000 ng/μL，每枚胚胎注射量為10 pL，對照組為不做處理的克隆胚胎。其中KDM4B/KDM4DmRNA注射組各注射了200個克隆胚胎。對注射組和對照組胚胎進行體外培養(yǎng)，統(tǒng)計24 h的胚胎卵裂率、72 h至8細胞期的胚胎數(shù)、168 h的囊胚數(shù)及發(fā)育至囊胚期的胚胎數(shù)。同時在胚胎發(fā)育至24 h時，在注射組和對照組中分別收集10個胚胎用于胚胎的組蛋白H3K9me3甲基化表達水平檢測，KDM4B/KDM4D引物信息見表1。

表1 KDM4B/KDM4D引物序列

1.2.5 免疫熒光法檢測克隆胚胎中組蛋白H3K9me3表達水平 將收集的胚胎放入預熱的0.5%鏈酶蛋白酶中作用1 min去透明帶，然后用洗卵液洗滌3次；加入固定劑室溫孵育15 min后用洗卵液洗滌3次；加入穿孔液室溫孵育30 min后用洗卵液洗滌3次；加入封閉液4℃過夜；加入一抗稀釋液孵育1 h后用洗卵液洗滌12次；在避光條件下加入二抗稀釋液，37℃孵育1 h后用洗卵液洗滌12次；最后加入1μg/mL碘化丙啶（Propidium iodide，PI），室溫孵育10 min后用洗卵液洗滌數(shù)次。將上述染色處理的胚胎轉(zhuǎn)移到干凈的載玻片上，以胚胎所在處為中心，在蓋玻片大小范圍內(nèi)的四角做4個由凡士林/石蠟油組成的柱，蓋上蓋玻片，用指甲油封片，然后在熒光顯微鏡下觀察，拍照記錄。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析 基因相對表達數(shù)據(jù)分析采用2-△△CT方法計算相對表達量。體細胞克隆胚胎的體外發(fā)育數(shù)據(jù)（分裂率、囊胚率和囊胚細胞總數(shù)）用卡方檢驗進行分析，P＜0.05表示差異顯著。采用SPSS20軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 KDM4B/KDM4D基因過表達載體構(gòu)建

根據(jù)小鼠KDM4B（NM_172132.2）和KDM4D（NM_173433.2）基因序列，利用質(zhì)粒分析軟件查找合適的克隆位點，將KDM4B/KDM4D基因CDs序列克隆到商業(yè)化的克隆載體pcDNA3.1（+），共構(gòu)建了pcDNA3.1（+）-KDM4B（8 695 bp，限制性內(nèi)切酶位點為HindIII和XhoI）和 pcDNA3.1（+）-KDM4D（6 967 bp，限制性內(nèi)切酶位點為HindIII和XhoI ）兩個克隆表達載體。

用限制性內(nèi)切酶HindIII單酶切pcDNA3.1（+） -KDM4B 和 pcDNA3.1（+） -KDM4D 表達載體；HindIII和XhoI雙酶切pcDNA3.1（+）-KDM4B質(zhì)和pcDNA3.1（+） -KDM4D表達載體，酶切鑒定顯示載體構(gòu)建成功。將過表達載體進行測序，測序結(jié)果顯示載體序列正確。

2.2 KDM4B/KDM4D基因過表達載體體外轉(zhuǎn)錄

利用XhoI酶將抽提好的KDM4B/KDM4D質(zhì)粒進行線性化處理，純化回收線性化載體，測定濃度，利用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得KDM4B/KDM4DmRNA并進行加尾處理，對體外轉(zhuǎn)錄獲得的mRNA進行凝膠電泳，結(jié)果（圖2）顯示KDM4B/KDM4DmRNA已成功轉(zhuǎn)錄。

圖2 KDM4B/KDM4D體外轉(zhuǎn)錄結(jié)果

2.3 胞漿顯微注射KDM4B/KDM4D mRNA對豬克隆胚胎體外發(fā)育效率的影響

2.3.1 胞漿顯微注射KDM4B/KDM4DmRNA 將24 h收集的克隆胚胎抽提RNA進行q-PCR檢測KDM4B/KDM4D表達水平，結(jié)果（圖3）顯示注射組KDM4B/KDM4D基因相對表達量遠高于對照組。

在1-cell期克隆胚胎中注射去甲基化酶KDM4BmRNA ，體外培養(yǎng)24 h后收集胚胎，檢測組蛋白H3K9me3的表達水平，將KDM4BmRNA注射組與空白對照組克隆胚胎免疫熒光處理后，在紫外處理（Ultraviolet，UV）、生物染色處理（Biological stain，BS）下觀察處理結(jié)果。免疫熒光實驗結(jié)果（圖4，彩插三）顯示，實驗組與對照組胚胎的H3K9me3的表達水平一致，并沒有顯著差異，說明通過克隆胚胎胞漿顯微注射去人源和鼠源去甲基化酶基因mRNA的方式并不能有效去除組蛋白H3K9me3甲基化標記。

圖3 注射后24 h KDM4B/KDM4D相對表達量

2.3.2 胞漿顯微注射KDM4B/KDM4DmRNA豬克隆胚胎體外發(fā)育效率的變化 在1-cell期，對已激活的胚胎胞漿中顯微注射KDM4B/KDM4DmRNA后，培養(yǎng)觀察克隆胚胎的體外發(fā)育情況。統(tǒng)計克隆胚胎體外發(fā)育的卵裂率、囊胚率、囊胚細胞數(shù)等體外發(fā)育效率。結(jié)果（表2）表明，在1-cell期激活的胚胎胞漿中顯微注射KDM4B/KDM4DmRNA的實驗組與空白對照組比較，卵裂率、囊胚率沒有顯著變化；囊胚細胞數(shù)：KDM4B實驗組與對照組相比顯著提高，KDM4D實驗組與對照組相比沒有明顯變化。對168 h的囊胚進行hocesst33342細胞染色，統(tǒng)計其囊胚細胞數(shù)，染色結(jié)果見圖5（彩插三）。

表2 豬克隆胚胎體外發(fā)育效率結(jié)果

3 討論與結(jié)論

通過向體外轉(zhuǎn)錄的KDM4 mRNA顯微注射入克隆胚胎來提高克隆效率的研究方法已經(jīng)在小鼠上獲得了成功［6-7］。Fukuda 等［10］也成功利用了KDM4B有效去除小鼠克隆胚胎的H3K9me3修飾，激活其所結(jié)合的RNF12基因和Xm-Xist的表達，使克隆胚胎發(fā)育效率得到提高。但該研究方法對豬克隆胚胎發(fā)育的影響鮮有報道，因此本研究向豬克隆胚胎顯微注射KDM4B/KDM4DmRNA來進行去除豬克隆胚胎H3K9me3修飾的探索。在本研究中，雖然KDM4B/KDM4DmRNA的相對定量PCR結(jié)果顯示KDM4B/KDM4DmRNA在克隆胚胎內(nèi)成功表達，但是免疫熒光的結(jié)果顯示H3K9me3修飾依然大量存在，而且注射組的體外發(fā)育效率與對照組相比沒有顯著差異，這說明向豬克隆胚胎顯微注射鼠源的KDM4B/KDM4DmRNA沒能有效去除H3K9me3修飾。這可能是由于注射的是鼠源KDM4B/KDM4D的mRNA，可能無法對豬克隆胚胎中的H3K9me3修飾起作用，雖然Chung等［7］將人源的KDM4AmRNA注射入小鼠克隆胚胎的研究表明了KDM4基因存在保守性，而在本研究中，異源mRNA對豬克隆胚胎發(fā)育效率的影響沒有小鼠克隆胚胎那樣有效。

獲取豬源KDM4基因家族的完整序列，轉(zhuǎn)錄mRNA來進行顯微注射，這對豬克隆效率的提高可能是一種更加具有針對性的研究策略。本研究中的KDM4BmRNA注射組的囊胚細胞數(shù)相比對照組有顯著提高，這說明本研究仍具有進一步研究的潛力。同時，除了已報道的KDM4A/B/D，KDM4家族還包括了KDM4C、KDM4E及KDM4F等成員，這些基因在克隆效率上的運用尚未見報［11-12］。往后的研究可以對KDM4家族進行系統(tǒng)探索，尋找能在豬克隆胚胎發(fā)育中有效去除H3K9me3的一種或幾種去甲基化酶。

人為去除H3K9me3修飾來提高胚胎克隆效率，除了增加組蛋白去甲基化酶的表達，還可以考慮抑制H3K9me3修飾的甲基化轉(zhuǎn)移酶基因Suv39h1/h2和Setdb1的表達。Matoba等［6］通過向小鼠克隆胚胎轉(zhuǎn)染siRNA來抑制其Suv39h1/h2的表達，將囊胚率從6.7%提高到49.9%。而Chen等［13］則在研究iPSC的過程發(fā)現(xiàn)Setdb1在H3K9me3修飾建立中的作用大于Suv39h1/h2。除了H3K9me3，還有許多其他的組蛋白修飾在影響著克隆胚胎發(fā)育。Cervera等［14］利用曲古抑菌素A提高H4K8的乙?；癄顟B(tài)，并提高了豬克隆胚胎的囊胚率（48.1%）。Huang等［15］發(fā)現(xiàn)H3K4me3在4-cell期和囊胚期的克隆胚胎中異常表達增加，這破壞了囊胚期H3K4me3-H3K27me3修飾的平衡，其認為這可能就是損害胚胎發(fā)育的原因之一。

克隆技術(shù)在豬的研究工作中具有重大的應用意義，如果能夠克服克隆效率低下的難題，克隆技術(shù)才能更好地應用于豬的理論研究及生產(chǎn)實踐中。利用高通量測序、免疫共沉淀、CRISPR/Ca9等前沿技術(shù)來揭示豬克隆胚胎中的表觀遺傳修飾圖譜，尋找供體細胞重編程中的關(guān)鍵障礙，對異常表觀遺傳修飾進行修復或糾正，仍是今后研究的重點［16-17］。本研究通過向胚胎注射體外轉(zhuǎn)錄的mRNA，過表達去甲基化酶KDM4B/KDM4D，嘗試去除豬克隆胚胎中的H3K9me3修飾，希望為今后的豬克隆技術(shù)研究應用提供理論依據(jù)。

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