董倩倩，吳瑋瑋，張錫友，陳峰，2△，李丹丹

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種克隆性漿細胞異常增殖的血液惡性腫瘤，其發(fā)病率位居血液系統(tǒng)惡性疾病的第二位，多發(fā)生于中老年，我國MM發(fā)病率約為1/10萬［1］，并有逐年增加的趨勢。常規(guī)化療的有效率為40%～60%，完全緩解率低于5%，中位生存期不超過3年，約25%的患者能存活5年以上，存活10年的不到5%［2］。近年來，隨著新藥（如沙利度胺、硼替佐米等）的廣泛應(yīng)用和自體干細胞移植（autologous stem cell transplantation，ASCT）的開展，MM的預(yù)后得到了極大地改善，但MM仍不可治愈。隨著嵌合抗原受體T細胞（chimeric antigen receptor T cell，Car-T）技術(shù)在復(fù)發(fā)/難治性急性淋巴細胞白血病領(lǐng)域的治療進展［3］，越來越多的學(xué)者開始關(guān)注該技術(shù)在MM及實體腫瘤中的應(yīng)用。本文對Car-T技術(shù)在多發(fā)性骨髓瘤治療中的研究進展做一綜述。

1 Car-T技術(shù)的工作原理

1.1 Car-T的結(jié)構(gòu) Car是一種由胞內(nèi)信號傳導(dǎo)區(qū)、跨膜區(qū)和胞外抗原結(jié)合區(qū)三部分組成的人工融合蛋白，胞外抗原結(jié)合區(qū)即識別腫瘤相關(guān)抗原（tumor associated antigen，TAA）的抗體單鏈可變區(qū)（single chain fragment variable，scFv），將Car基因在體外進行基因重組，生成重組質(zhì)粒，在體外通過轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染到患者的T細胞，經(jīng)過純化和大規(guī)模擴增的T細胞即為Car-T［4］，其既可特異性識別TAA，又能通過非主要組織相容性復(fù)合體（MHC）限制性途徑殺傷腫瘤。目前Car-T技術(shù)已發(fā)展至五代［5］。第一代Car-T胞內(nèi)信號傳導(dǎo)區(qū)僅含CD3ζ鏈或FcRγ鏈［6］。第二代Car-T胞內(nèi)信號傳導(dǎo)區(qū)在一代的基礎(chǔ)上添加一個共刺激分子（costimulatory molecule，CM），主要為CD28，另有CD134（OX40）、CD137（41BB）及ICOS等，以增強Car-T細胞毒性作用［7］。第三代Car-T胞內(nèi)信號傳導(dǎo)區(qū)共添加兩個CM（CM1和CM2），主要為CD28 聯(lián)合 CD134 或 CD137［8］。第四代 Car-T 又稱TRUCK細胞，激活時可以釋放細胞因子，招募免疫系統(tǒng)的其他成分放大抗腫瘤免疫效應(yīng)［9］。第五代Car-T即通用型Car-T，主要通過基因編輯技術(shù)“關(guān)閉”導(dǎo)致人體排異反應(yīng)的基因，可以對異體T細胞進行提前制備，隨時提供給患者。近日，超級Car-T技術(shù)問世，該技術(shù)又稱為“7x19Car-T細胞”，主要是在以往Car-T基礎(chǔ)上將添加了白細胞介素（IL）-7和趨化因子（CCL）19，以此招募更多的T細胞以及DC細胞殺傷腫瘤細胞［10］。

1.2 Car-T的抗腫瘤機制 細胞毒性T細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）是經(jīng)抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC）激活的CD8+T淋巴細胞，其活化需要雙信號途徑。第一信號途徑為APC上的MHC分子-抗原肽復(fù)合體與T細胞上的T細胞受體（T cell receptor，TCR）結(jié)合，第二信號為APC上的共刺激分子B7與T細胞上的CD28結(jié)合，在這兩種信號的共同作用下，T細胞會活化增殖為CTL細胞。當(dāng)CTL細胞再次遇到攜帶有相同MHC分子-抗原肽復(fù)合體的腫瘤細胞時，就會通過同樣的機制與之結(jié)合［11］。CTL細胞可通過兩種途徑殺死腫瘤細胞，一是通過釋放穿孔素/顆粒酶等細胞毒素介導(dǎo)靶細胞凋亡，二是效應(yīng)CTL細胞可表達膜型FasL以及可溶型FasL（sFasL），同時分泌腫瘤壞死因子（TNF）-α、淋巴毒素（LT）α等效應(yīng)分子，誘導(dǎo)靶細胞凋亡［12］。

第一代Car-T的信號通過CD3ζ或FcRγ的免疫受體酪氨酸激酶活化基序（immunoreceptor tyrosinebased activation motif，ITAM）傳導(dǎo)，缺乏CTL細胞活化需要的第二信號，抗腫瘤作用較弱［13］。第二代Car-T由于加入一個CM，Car-T細胞的存活時間延長，腫瘤定位的Car-T增多，在殺死腫瘤細胞的同時還能完成自身的擴增，抗腫瘤能力有所提高，故臨床研究應(yīng)用最為廣泛［14-15］。第三代Car-T細胞含有兩個CM，體內(nèi)擴增和產(chǎn)生細胞因子的能力更強，但具有相當(dāng)?shù)募毎芙庾饔茫?6］。前三代Car-T細胞在回輸前均需對患者進行預(yù)處理（全身照射或大劑量化療），預(yù)處理方案的毒性限制了其臨床應(yīng)用［17］。第四代Car-T的出現(xiàn)使患者免受預(yù)處理的毒副反應(yīng)，拓寬了Car-T的臨床應(yīng)用范圍。研究者們采用改造后的超級Car-T治療小鼠肥大細胞癌，幾乎所有小鼠能夠存活，而常規(guī)Car-T療法的小鼠存活率只有30%左右［10］。

2 Car-T在MM治療中的臨床應(yīng)用

2.1 抗CD19的Car-T 研究表明在MM中，除腫瘤細胞外，還存在一種免疫表型類似于B細胞的細胞，具有CD19、CD20以及CD45等B細胞的免疫表型，其作用類似于干細胞［1］。MM細胞的增殖分化能力有限，而腫瘤干細胞具有強大的增殖分化以及自我更新的能力，目前，針對CD19的Car-T細胞在血液惡性腫瘤治療中已表現(xiàn)出了巨大的潛力，如急、慢性淋巴細胞白血病和B細胞淋巴瘤［18-19］。

Garfall等［20-21］的研究共納入12例多發(fā)性骨髓瘤患者，其中10例患者在接受高劑量馬法蘭和ASCT后12～14 d接受CTL019（5×107個Car-T細胞）輸注，10例患者的中位生存期為185 d（42～479 d），6例有很好的部分反應(yīng)（very good partial response，VGPR），2例為短暫的部分緩解（partial response，PR），2例疾病進展（progressive disease，PD）；不良反應(yīng)總體比較輕微，包括輕微的細胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome CRS）；此外，經(jīng)測定患者體內(nèi)僅有0.5%～1.5%的MM細胞CD19陽性，推測抗CD19的Car-T主要攻擊對象為CD19陽性的“腫瘤干細胞”，而非MM細胞。

2.2 抗CD138的Car-T CD138（Syndecan-1）是硫酸乙酸肝素蛋白聚糖家族的成員，參與細胞黏附，廣泛表達于漿細胞和MM細胞。復(fù)發(fā)和晚期MM其CD138表達水平高于新發(fā)的MM，某些器官如唾液腺、肝臟、皮膚的上皮細胞中也有CD138表達，因此將其作為靶抗原行Car-T治療存在轉(zhuǎn)氨酶升高、手足皮膚紅腫等潛在不良反應(yīng)［22-23］。Guo等［24］應(yīng)用抗CD138的Car-T治療5例復(fù)發(fā)難治性MM或漿細胞白血病患者，在第2次注射Car-T后4例患者出現(xiàn)了輕微發(fā)熱；治療后4例患者評價為疾病穩(wěn)定（stable disease，SD），1例患者并發(fā)帕金森病，并開始接受姑息治療，評價為PD；經(jīng)測定，回輸?shù)腃ar-T細胞中31%表達抗CD138。由于該靶抗原潛在的不良反應(yīng)，未來針對CD138的Car-T技術(shù)應(yīng)注重減輕其毒副反應(yīng)。

2.3 抗BCMA的Car-T 最近，B細胞成熟抗原（BCMA）作為一種CAR靶抗原在MM的治療中逐漸引起關(guān)注。BCMA（CD269）是腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）受體超家族的成員，高度表達于某些B細胞、漿細胞以及MM細胞，造血干細胞以及血液外組織不表達BCMA。Ali等［25］應(yīng)用抗BCMA的Car-T治療12例BCMA陽性的MM患者，所有受試者在輸注Car-T前均接受化療預(yù)處理（具體方案：環(huán)磷酰胺300 mg/m2+氟達拉濱30 mg/m2，連續(xù)輸注3 d），以減少調(diào)節(jié)性T細胞水平并增加IL-15和IL-7等細胞因子水平；10例接受小劑量Car-T的患者中，8例患者獲得持續(xù)2～12周不等的SD，1例獲得PR，1例獲得持續(xù)8周的VGPR；2例接受大劑量Car-T治療的患者中，1例獲得持續(xù)66周的PR，1例獲得持續(xù)17周的完全緩解（complete response，CR）。Cohen等［26］應(yīng)用抗BCMA的Car-T細胞治療6例復(fù)發(fā)難治性MM患者，1例獲得長達7個月的CR，1例在胸腔積液和腦脊液中均發(fā)現(xiàn)MM細胞的多發(fā)轉(zhuǎn)移患者獲得持續(xù)5個月的VGPR，其余4例Car-T細胞治療無效。Berdeja等［27］在2016年12月發(fā)表的一篇報道中指出：9例復(fù)發(fā)/難治性MM患者在接受環(huán)磷酰胺/氟達拉濱預(yù)處理后接受了不同劑量的BB2121注射（5×107個，15×107個，或45×107個Car-T），接受15×107個Car-T治療組反應(yīng)較好，2例患者獲得CR，1例VGPR；在5×107劑量組中，3例患者分別獲得PR、SD和PD，該組的所有患者都經(jīng)歷了8～11周的疾病進展。Fan等［28］報道了一項正在進行中的Ⅰ期臨床試驗，19例復(fù)發(fā)難治性MM患者接受抗BCMA的Car-T治療，其中18例達到VGPR或CR。

總的來說，BCMA作為Car-T的免疫治療的抗原靶點，在不同的CAR結(jié)構(gòu)設(shè)計、不同劑量的臨床研究中都展示出希望，需要進一步研究以確定最佳的BCMA-CAR設(shè)計治療MM。

2.4 抗免疫球蛋白κ輕鏈的Car-T 考慮到成熟的B淋巴細胞表達的是κ或λ輕鏈，而不是兩者都有，Ramos等［29］開發(fā)了一種特定于κ輕鏈的CAR結(jié)構(gòu)，可以識別并殺傷受限于κ輕鏈的細胞，保留受限于λ輕鏈的細胞，達到維持部分體液免疫的目的；在他們的Ⅰ期臨床試驗中，7例MM患者接受了抗κ輕鏈的二代Car-T技術(shù)治療，在接受1～2次治療后，在治療前2周內(nèi)循環(huán)B細胞數(shù)量減少了約50%；7例患者在接受Car-T回輸時均處于MM活動期，均曾接受1次或多次化療，6例患者曾接受ASCT治療。3例患者在回輸Car-T細胞前4周內(nèi)接受補救性化療，沒有接受補救性化療或者淋巴細胞不小于500個/μL的患者在回輸Car-T細胞前予以12.5 mg/kg劑量的環(huán)磷酰胺，治療后4例患者SD時間持續(xù)6周至2年不等，其余3例患者Car-T細胞治療無效。在CLL和NHL患者中，由于κ輕鏈表達程度更高，應(yīng)答也更明顯。此Car-T技術(shù)耐受性良好，沒有患者表現(xiàn)出嚴重的CRS。

2.5 抗CD38的Car-T細胞 CD38是一種參與細胞黏附、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及鈣濃度調(diào)節(jié)的跨膜糖蛋白，廣泛表達于漿細胞、前體B細胞、T細胞、NK細胞以及髓系前體細胞，在胃腸道、前列腺等器官中也有表達。Drent等［30］證實抗CD38的Car-T可有效殺滅CD38陽性的MM細胞，但同時CD38陽性的正常造血干細胞也被Car-T攻擊，引起嚴重的骨髓抑制。此后Drent等［31］通過改變輕鏈的結(jié)構(gòu)，優(yōu)化scFv的親和力，實現(xiàn)了Car-T細胞特異性攻擊CD38陽性的MM細胞。

2.6 抗CD44v6的Car-T細胞 43%的晚期MM可表達CD44v6，相關(guān)的Car-T臨床試驗正在進行中［32］，其缺點在于活化的T細胞、單核細胞及角質(zhì)細胞也可表達CD44v6抗原。

2.7 抗CD56的Car-T細胞 CD56是一種表達于惡性漿細胞腫瘤的糖蛋白，參與介導(dǎo)細胞間以及細胞和細胞外基質(zhì)間相互作用，相關(guān)的Car-T臨床試驗正在進行中，但是CD56被證實同樣表達于NK細胞、部分T細胞以及神經(jīng)元細胞，因此這種Car-T治療存在潛在的神經(jīng)毒性。

2.8 抗CD70的Car-T CD70是一種僅表達于淋巴組織的糖蛋白，但是絕大多數(shù)的MM不表達CD70，相關(guān)的Car-T臨床試驗正在進行中［33-34］，將CD70作為靶抗原是否合適有待驗證。

2.9 抗細胞表面蛋白SLAMF7的Car-T 細胞表面蛋白SLAMF7（CD319/CS1）廣泛表達于漿細胞、NK細胞、CD8陽性T細胞、活化B細胞、活化單核細胞以及樹突狀細胞，血液外組織不表達SLAMF7。超過90%的MM表達SLAMF7，而且不受MM病情進展以及化療藥物的影響。elotuzumab是一種靶向SLAMF7的單克隆抗體，證實可以提高MM患者的中位生存期。Wang等［35］利用兩種Car-T進行研究，一種靶抗原為B細胞成熟抗原（B-cell maturation antigen，BCMA），另一種靶抗原為SLAMF7，在小鼠模型上發(fā)現(xiàn)抗SLAMF7的Car-T細胞療效優(yōu)于抗BCMA的Car-T細胞。

3 Car-T技術(shù)存在的問題

Car-T技術(shù)雖然已經(jīng)在MM治療方面顯示出巨大的潛力，但仍然存在一些問題有待進一步探討：（1）尚需觀察病毒載體是否會帶來有害的插入性突變。（2）Car-T治療過程中具有一定的不良反應(yīng)，如細胞因子釋放綜合征、腫瘤溶解綜合征（tumor lysis syndrome，TLS）以及脫靶效應(yīng)（off-target toxicity）等。（3）Car-T的臨床試驗結(jié)果各個中心結(jié)果不一，難以達到統(tǒng)一的標(biāo)準化治療。（4）Car-T的設(shè)計和培養(yǎng)制備成本過高。

4 展望

針對MM多種靶點的Car-T技術(shù)，目前不少國家和地區(qū)的醫(yī)療機構(gòu)、科研機構(gòu)已進行了大量的臨床試驗。在臨床應(yīng)用過程中，其安全性、Car-T的相關(guān)信號通路有待進一步研究。構(gòu)建多靶向的Car-T能夠同時針對多種類型的MM靶抗原，進一步增強其抗腫瘤能力，也是未來Car-T技術(shù)需要研究的方向。但是由于其在復(fù)發(fā)/難治性MM中已顯示出顯著的治療效果，因此Car-T免疫治療在臨床中的應(yīng)用非常值得期待。