張翔宇，謝曉紅，黃鄧萍

（四川省畜牧科學(xué)研究院，動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川成都 610066）

家兔是節(jié)糧型食草小動物，是重要的肉類和皮毛來源之一，也是許多人類疾病研究的理想動物模型。兔肉具有高蛋白、高卵磷脂、高氨基酸和低膽固醇的特性，是許多慢性病患者（肥胖、心腦血管病、糖尿?。┑睦硐肴忸悂碓矗虼思彝迷谛竽翗I(yè)和科學(xué)研究中占據(jù)著十分獨特的地位[1]。肌肉和皮毛發(fā)育對家兔各生長階段的體重、產(chǎn)肉性能、肉質(zhì)、兔皮品質(zhì)均有重要影響，與之相關(guān)的重要功能基因研究一直是家兔科研領(lǐng)域的熱點。家兔的肌肉和皮毛發(fā)育是一個涉及多基因表達、多信號通路及多調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜過程。隨著miRNA的發(fā)現(xiàn)和功能研究的深入，大量證據(jù)表明，基因組中非蛋白質(zhì)編碼區(qū)的miRNA與靶mRNA共同參與了個體的許多重要生理過程[2]。miRNA調(diào)控主要是通過與靶基因的mRNA互補結(jié)合后形成雙鏈RNA，進而誘導(dǎo)沉默復(fù)合物降解mRNA或抑制其翻譯過程[3]。同時，作為一類新的調(diào)控因子，miRNA在細胞增殖分化和凋亡、個體的生長和發(fā)育中起了重要的調(diào)節(jié)作用[4]。因此，闡明miRNA及其靶mRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在生長和發(fā)育過程中的作用機制顯得尤為重要。本文對家兔轉(zhuǎn)錄組的研究進展，尤其是轉(zhuǎn)錄本對家兔肌肉和皮毛發(fā)育、繁殖生理及免疫調(diào)控進行了綜述，以期為家兔的遺傳改良和人類疾病的研究提供參考。

1 家兔轉(zhuǎn)錄組鑒定的高通量測序技術(shù)

轉(zhuǎn)錄組是指處于特定發(fā)育階段或具有特定功能的組織（細胞）轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生的所有RNA的總和，包括信使RNA、核糖RNA、轉(zhuǎn)運RNA和非編碼RNA[5]。轉(zhuǎn)錄組的相關(guān)研究主要通過對不同發(fā)育階段、不同生理狀態(tài)和不同環(huán)境條件下不同類型轉(zhuǎn)錄本的表達量分析，發(fā)現(xiàn)與生物學(xué)過程密切相關(guān)的差異表達轉(zhuǎn)錄本，這些差異表達的轉(zhuǎn)錄本是進一步進行生物學(xué)功能和作用機理研究的重要前提[6-7]。根據(jù)原理的不同，轉(zhuǎn)錄組的主要研究技術(shù)包括基于雜交原理的芯片技術(shù)、基于測序原理的RNA-seq測序技術(shù)和基于PCR原理的實時熒光定量技術(shù)。家兔全基因組測序的完成不僅為許多馴化相關(guān)的遺傳學(xué)問題提供了答案，也為家兔轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的深入提供了必要條件[8]。以Sanger測序為原理的SAGE技術(shù)和MSPP技術(shù)不需要相關(guān)基因組信息，具有自動化程度高、通量較大的優(yōu)點。但傳統(tǒng)的Sanger測序操作復(fù)雜、效率低、測序深度有限，嚴重制約了動物新轉(zhuǎn)錄本的發(fā)現(xiàn)速度。令人欣慰的是，基于第二代測序的RNA-seq具有檢測速度快、成本低、覆蓋深度廣、信息量大等特點，特別適合小分子RNA測序；同時，RNA-seq技術(shù)解決了低豐度和組織特異表達轉(zhuǎn)錄子難于鑒定的技術(shù)問題，通過對測定的序列進行計數(shù)，以準(zhǔn)確獲得每個特定轉(zhuǎn)錄本的表達量。羅氏454公司的GS FLX測序平臺、Illumina公司的Solexa Genome Analyzer測序平臺和ABI公司的SOLiD測序平臺是使用較為普遍的RNA-seq測序技術(shù)平臺。Solexa技術(shù)采用“邊合成邊測序（Sequencing-By-Synthesis，SBS）”的原理，一次性可以得到最大約10億個堿基序列，足以分析單個樣本中所有轉(zhuǎn)錄本的詳細信息，GS FLX較SOLiD技術(shù)擁有更高的通量和更低的成本。然而，物種的基因組注釋信息太少將嚴重影響高通量測序發(fā)現(xiàn)新miRNA的準(zhǔn)確性和數(shù)據(jù)挖掘的深度，極大地限制RNA-seq測序技術(shù)在相關(guān)轉(zhuǎn)錄組研究中的應(yīng)用。Li等[9]利用SOLiD和Solexa高通量測序平臺對家兔大腦和心臟的miRNA進行了檢測，共檢測到了464個miRNA前體和886個成熟的miRNA，部分miRNA及其同形異構(gòu)體在大腦和心臟的表達上存在差異。牛曉艷等[10]采用Illumina平臺對白色和海貍色獺兔皮膚組織中mRNA進行高通量測序，共發(fā)現(xiàn)12 408個差異表達基因，其中8個差異基因位于細胞色素代謝通路中。CP2F1、CP2BB和GSTA4可能對獺兔毛色的形成起調(diào)控作用。周太成等[11]采用RNA-seq測序技術(shù)對高原鼠兔進行低海拔馴養(yǎng)過程中轉(zhuǎn)錄組的變化進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與脂肪代謝、抗紫外線輻射和酒精代謝相關(guān)基因表達量降低，而與免疫適應(yīng)和抗電離輻射相關(guān)基因表達量升高?；虮磉_譜芯片技術(shù)主要基于核酸雜交配對的原理，利用經(jīng)不同熒光分子標(biāo)記的處理組和對照組的mRNA分別與芯片進行雜交，再計算雜交熒光信號的比值來確定mRNA的表達量。基因表達譜芯片可以對不同個體、組織、生理過程、發(fā)育階段下細胞內(nèi)的mRNA或逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA的表達量進行檢測，具有準(zhǔn)確、快速和高效的特點，一次能檢測上萬個基因的表達量，幾乎覆蓋該物種的所有基因[12]。但基因表達譜芯片技術(shù)的分析價格較為昂貴，同時還受到基因組信息完整程度的限制。李冰等[13]利用家兔全基因組表達芯片對4日齡不同被毛密度獺兔皮膚組織進行了差異基因篩選，篩選出188個差異表達基因，其中IGF-1 、VEGF和BMP-2可能與獺兔被毛的形成有關(guān)，Wnt和PPAR信號通路可能參與獺兔被毛發(fā)育。孫露露等[14]采用家兔全基因組芯片對被毛長度和密度存在顯著差異的皖系長毛兔和新西蘭白兔皮膚組織中的轉(zhuǎn)錄組進行了差異表達分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Wnt10b、Shh、SFRP2基因可能在家兔毛纖維的生長發(fā)育中起重要作用。段紅梅等[15]利用全基因組芯片對胚胎期和出生后家兔皮膚創(chuàng)傷后愈合組織的基因表達量進行了檢測，共發(fā)現(xiàn)差異表達基因113個，推測這些基因可能參與胎兒及成人皮膚瘢痕愈合的形成過程。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料，以實現(xiàn)對PCR全程的監(jiān)測。通過對每次循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時收集來實現(xiàn)對起始模板定量和定性的分析，該技術(shù)可在實驗結(jié)束后立即得到定量結(jié)果，無需凝膠電泳分析和其他實驗操作，具有操作簡單、結(jié)果可靠的特點，逐漸成為對轉(zhuǎn)錄組進行定量分析的常用方法[16]。但qRT-PCR一次檢測的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量較少，覆蓋度較低。吳添文等[17]采用實時熒光定量技術(shù)對福建黃兔、德系長毛兔和美系獺兔不同部位皮膚組織中的KAP3.1、KAP3.3、KAP6.1和FGF5等基因的表達規(guī)律進行了研究，結(jié)果表明這些基因的表達存在品種和部位的差異。隨著技術(shù)不斷發(fā)展和對實驗結(jié)果準(zhǔn)確性的要求不斷提高，出現(xiàn)了新的檢測技術(shù)和實驗策略。cDNARFLP將RT-PCR和AFLP技術(shù)相結(jié)合，通過對cDNA限制性酶切片段進行選擇性擴增最終形成RNA指紋圖譜，極大地提高了實驗的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。另外，隨著基因芯片和RNA-seq成本的逐漸降低，采用2種及以上技術(shù)進行聯(lián)合分析也成為轉(zhuǎn)錄組研究的新趨勢。

2 肌肉發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組

肌肉的生長發(fā)育不僅影響家兔產(chǎn)肉量，還影響著肉質(zhì)、機體的能量和蛋白質(zhì)代謝[18]。肌肉發(fā)育是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，涉及骨骼肌干細胞和成肌細胞的增殖和分化。轉(zhuǎn)錄本（mRNA和miRNA）幾乎參與了肌肉發(fā)育的所有環(huán)節(jié)，在肌肉發(fā)育過程中起重要的調(diào)控作用。目前研究表明，多個基因參與了家兔肌肉的生長發(fā)育并影響肌肉的功能。Wang等[19]以生長速度和肉質(zhì)存在顯著差異的新西蘭白兔和福建黃兔為研究對象，利用基因芯片技術(shù)篩選到7個與肌肉發(fā)育關(guān)聯(lián)的差異表達基因（Myh6、Myh7、Myh7b、Myo5b、Tnnc1、Tpm3、Acta2），并發(fā)現(xiàn)Tpm3和Myh7基因在背肌中的表達水平高于腿肌，可能存在協(xié)同作用。王文洲等[20]利用qRT-PCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，Myh6基因在福建黃兔和新西蘭白兔背肌和腿肌中的表達量都是先增加后降低最后趨于穩(wěn)定，在新西蘭白兔中的表達量高于福建黃兔，這與肌纖維面積、長徑和短徑的變化一致。因此，推測Myh6基因可能促進肌纖維的發(fā)育。另外，SPF環(huán)境下新西蘭兔的后腿MyoG基因表達量顯著高于普通環(huán)境組，這與后腿重量差異結(jié)果一致，因此MyoG基因除參與調(diào)節(jié)體外肌細胞分化外還可能調(diào)控家兔后腿的肌肉發(fā)育[21]。吳周林等[22]對兔骨骼肌衛(wèi)星細胞中MSTN和Ankrd2基因的表達進行了抑制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肌管分化能力增強，推測MSTN和Ankrd2基因?qū)」芊只幸种谱饔?。miRNA-1/206具有高度的同源性，功能也十分相似。miRNA-1/206通過作用于靶基因Pax7和Notch3，能促進骨骼肌衛(wèi)星細胞分化為成熟的肌細胞[23]。在骨骼肌再生和肌細胞融合過程中，miR-1通過與mTOR通路的相互作用實現(xiàn)對該過程的調(diào)控。miR-1基因通過與氧化磷酸化相關(guān)基因Cox1和ND1相互作用，加強細胞線粒體的能量代謝水平[24]。miRNA-206能與多個靶基因（如Id1-3、MyoR、BDNF、Hmyb3、RUNX1、ZNF238 和Cx43等）作用促進骨骼肌細胞的分化和發(fā)育，還能作用于Hdac4基因，促進骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖，其表達量與衛(wèi)星細胞的活化程度相關(guān)[25]。miR-27能夠通過與靶基因的作用抑制肌源性祖細胞增殖、遷移，促進分化，miR-27過表達時會減緩小鼠肌肉損傷的修復(fù)，縮減新生肌纖維的直徑[26]。

3 毛皮發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組

皮膚的發(fā)育不僅影響兔皮的面積，皮膚表皮中的毛囊還影響著兔毛的密度和品質(zhì)，一定程度上還參與了兔毛色的形成。研究兔毛皮的生長發(fā)育不僅有助于提高兔皮的質(zhì)量，還有助于人類脫發(fā)、白癜風(fēng)等疾病的研究。研究表明，許多轉(zhuǎn)錄本參與了動物皮膚、毛囊的周期性發(fā)育和色素沉積，通過調(diào)控相關(guān)的信號通路，影響皮張的面積和毛色的變化[27]。陳賽娟等[28]利用基因芯片技術(shù)，檢測了被毛密度存在差異的獺兔皮膚組織的差異表達基因，結(jié)果篩選出了2 657個在皮膚組織中差異表達的基因。經(jīng)注釋后，這些基因大多與細胞增殖、分化、凋亡、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等有關(guān)，其中，MP2、TGFβl、TGFβ2、IGF-1B 、BMP2、ActRCCNA2基因可能對皮膚毛囊的發(fā)育起重要調(diào)控作用，最終造成獺兔被毛密度的差異。Zhao等[29]采用RNA-seq技術(shù)對青紫蘭色獺兔的背部和腹部皮膚組織的轉(zhuǎn)錄組進行分析，發(fā)現(xiàn)共有336個基因差異表達，主要富集于與皮毛發(fā)育密切相關(guān)的 WnMAPK信號通路，SFRP2、FRZB、CACNG1、SLC25A4和SLC16A3可作為皮毛發(fā)育的重要候選基因。Pan等[30]以皺襞型和非皺襞型白色獺兔為研究對象，皺襞型白色獺兔因其腹部、四肢及其臀部會出現(xiàn)一些皺褶，皮張面積較普通型大15%，采用RNASeq技術(shù)以皮膚為樣本進行測序分析，共檢測到308個差異表達的基因，其中與家兔皮膚發(fā)育密切相關(guān)的基因（MYL12B、LAMB3、PLON、EIF3E、CEBPA、FADS2、ENPP6），可能是調(diào)控獺兔皺襞的關(guān)鍵因子。為了揭示獺兔毛色的遺傳機制，Qin等[31]對3種不同毛色的全同胞獺兔（黑色、青紫藍色和白色）的皮膚組織的轉(zhuǎn)錄組進行高通量測序，共檢測到257個差異表達的基因，其中TYRP1、TYR、Oca2、Dct和Slc7a11基因可能在獺兔毛色形成過程中起重要作用。秦立志等[32]利用表達譜芯片技術(shù)對全同胞青紫藍色獺兔和白色獺兔背部皮膚組織中的差異表達基因進行了檢測，共發(fā)現(xiàn)89個差異表達的基因，其中Crebl、TH、Wnt2、Gnaq、Dvl1、Mapk12等基因可能參與獺兔毛色形成。王曉明等[33]對福建黃兔和新西蘭白兔雜交F1代不同發(fā)育階段的MC1R表達量進行了分析，發(fā)現(xiàn)4～10周齡表達量持續(xù)上升，10～12周齡表達量出現(xiàn)了短暫的下降。上述研究表明，不同表型和生理狀態(tài)的皮膚組織中mRNA的表達在數(shù)量和種類存在差異，差異表達的基因可能對皮毛發(fā)育過程中的特定生理過程有重要的調(diào)控作用。miRNA對動物皮膚、毛囊的發(fā)育及色素沉積起著重要的調(diào)控作用，MiR-199和MiR-200家族在皮膚和毛囊中差異表達，Oar-miR-320、Oar-miR-103和Oar-miR-148可能通過Wnt信號通路來控制羊毛生長，MiR-205可以調(diào)控PIK3信號通路，促進早期毛囊干細胞的增殖，對毛囊形態(tài)具有重要的作用[34-35]。MiR-125b能作用于靶基因維生素D受體，影響干細胞的分化能力，其異常表達會引起脫毛[36]。MiR-137、MiR-182、MiR-25和MiR-218通過作用于小眼畸形轉(zhuǎn)錄因子（MITF），調(diào)控酪氨酸酶及其相關(guān)蛋白，影響機體黑色素生成[37]。

4 繁殖相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組

卵巢和子宮是重要的生殖器官，轉(zhuǎn)錄組在家兔卵巢和子宮發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用，通過復(fù)雜的信號通路直接參與受精、植入和妊娠等生理過程。馮雪等[38]以低產(chǎn)加利福尼亞兔和高產(chǎn)哈爾濱白兔為研究對象，構(gòu)建了高產(chǎn)組和低產(chǎn)組文庫，經(jīng)高通量測序后，共篩選到321個差異表達的mRNA，其中FSHR、BMP6、BMPl5、INHBB和HSD17B1基因與兔繁殖力相關(guān)最緊密。Ballester等[39]采用抑制性消減雜交的方法對2個子宮容量存在差異的肉兔品系進行了基因差異表達研究，發(fā)現(xiàn)了47個與胚胎著床和發(fā)育相關(guān)的差異表達基因，其中PGR、HSD17B4和ERO1L基因在子宮容量較小的品系中過量表達。另一項研究表明，TIMP-1基因在子宮容量存在差異的2個品系家兔輸卵管中的表達量存在顯著差異[40]。Saenz-de-Juano等[41]利用實時熒光定量對體內(nèi)和體外發(fā)育的兔囊胚期胚胎的OCT4、VEGF和erbB3的mRNA進行了表達差異分析，發(fā)現(xiàn)OCT4基因的表達量在不同的發(fā)育環(huán)境中存在顯著差異，推測OCT4基因可能影響家兔胚胎的囊胚期發(fā)育。Baranda-Avila等[42]利用qRT-PCR 技術(shù)對懷孕早期的家兔輸卵管不同部位的ESR基因表達量進行了檢測，與未懷孕母兔相比，懷孕母兔輸卵管不同部位的表達量均顯著升高，但壺部和峽部的表達方式存在差異，可能與其功能差異有關(guān)。隨著對miRNA研究的深入，其在調(diào)控卵巢生理方面的作用逐漸引起研究人員的關(guān)注。定向敲除Dicer的雌性小鼠均出現(xiàn)了不同程度的生殖缺陷，而Dicer酶為miRNA成熟過程中必須的酶。因此推測miRNA在生殖過程中發(fā)揮重要作用[43]。雌激素和孕酮可以調(diào)控基質(zhì)細胞中miR-20a、miR-26a和miR-21的表達以發(fā)揮其在繁殖過程中的功能[44]。miR-18a、miR-29a和miR-199在子宮、卵巢、輸卵管及黃體等組織中大量表達，但其作用機理有待進一步研究[45]。

5 疾病相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組

Kwon等[46]首次建立了兔軟骨組織的EST文庫，用于軟骨相關(guān)遺傳機理的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)COL2A1和COL10A1 在兔的軟骨組織中高表達，而PRG4、DCN和COMP的表達量隨兔齡的不同而存在差異。陳仕毅等[47]對患腸炎病兔與正常兔的MyD88的mRNA表達量進行了比較，發(fā)現(xiàn)MyD88 mRNA的表達量隨個體易感性的增加而增加，并且抗感染能力最強的CC基因型個體的mRNA表達量最低。家兔是研究高脂血癥等人類疾病的重要實驗動物。Zhen等[48]研究了3種實驗室應(yīng)用最廣泛的家兔品種（新西蘭白兔、日本大白兔和遺傳性WHHL兔）的全基因組變異，并對WHHL和高能量飼喂的新西蘭白兔的不同器官進行轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種家兔的主動脈的基因表達方式基本一致，高能量飼養(yǎng)組肝臟出現(xiàn)了明顯的炎癥反應(yīng)和異常的脂代謝。研究結(jié)果為鑒定動物模型高脂血癥的治療標(biāo)靶提供參考。王蕭等[49]運用導(dǎo)管術(shù)造成新西蘭白兔主動脈瓣膜關(guān)閉不全建立心衰模型，并利用基因芯片技術(shù)分析該模型基因表達差異，共檢測出665個差異表達基因，主要與離子通道、肌收縮和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能有關(guān)。綠膿桿菌是引起傷口感染的一種常見細菌。Karna等[50]建立了兔耳外切傷模型，對感染后的家兔進行了轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果發(fā)感染后到感染后第3天miRNA迅速下調(diào)，隨著感染的加劇miRNA開始上調(diào)，而皮膚發(fā)育相關(guān)的編碼基因表達量降低。大量的mRNA和miRNA可能參與到傷口從感染到康復(fù)的整個過程。免疫系統(tǒng)是機體對抗疾病的重要屏障。大量的研究結(jié)果表明，miRNA在機體固有性免疫應(yīng)答、獲得性免疫應(yīng)答、T/B淋巴細胞的分化、病原體感染與免疫及炎性等重要免疫過程中起重要作用[51]。miR-155是維持正常的免疫功能必須的轉(zhuǎn)錄因子，還能調(diào)控炎癥反應(yīng)。miR-155通過抑制靶基因的表達參與機體對LPS的負反饋調(diào)控[52]。miR-150參與了T、B細胞的發(fā)育成熟，并且與Foxp3存在關(guān)聯(lián)[53]。miR-16則通過參與調(diào)控細胞周期調(diào)控機體的免疫過程[54]。

6 結(jié) 語

綜上所述，家兔轉(zhuǎn)錄組學(xué)主要從整體水平上研究細胞中轉(zhuǎn)錄本的表達情況和轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律，是家兔生物學(xué)的重要分支。目前已經(jīng)利用基因芯片、RNA-seq和熒光定量等技術(shù)對家兔不同品種、發(fā)育階段和生理狀態(tài)進行了轉(zhuǎn)錄組分析。對繁殖性狀、生長性狀、毛皮發(fā)育和疾病相關(guān)性狀的研究發(fā)現(xiàn)了許多對家兔重要經(jīng)濟性狀有影響的生物學(xué)通路，篩選出了大量參與肌肉和毛皮發(fā)育并具有重要生物學(xué)意義的潛在功能基因。

在后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組相關(guān)研究中，一方面應(yīng)當(dāng)充分利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)挖掘更多的具有重要生物學(xué)功能的轉(zhuǎn)錄本（mRNA和miRNA），另一方面應(yīng)當(dāng)加強篩選對生理過程和發(fā)育周期可能有重要作用的轉(zhuǎn)錄本的表達譜分析和功能研究。綜合利用轉(zhuǎn)染、基因敲除和熒光素酶報告檢測等技術(shù)從細胞水平上驗證候選轉(zhuǎn)錄本的功能，并開展轉(zhuǎn)錄機制的研究，在此基礎(chǔ)上篩選出能應(yīng)用于育種實踐的分子標(biāo)記。最終實現(xiàn)家兔生產(chǎn)性能的整體提升，并為人類許多代謝疾病、慢性病的治療提供參考。