藺娜 宋欣偉 張繆佳

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是以多關節(jié)腫痛為主要表現(xiàn)的一種慢性、全身炎性的自身免疫性疾病，其病因機制不明，遺傳因素、環(huán)境因素、炎癥因素等均與RA發(fā)病有關。慢性滑膜炎癥、滑膜增生、血管翳形成是RA慢性炎癥階段最突出的病理特征。炎癥反應和血管形成是兩個相互依賴的過程，這些因子相互調節(jié)，形成一個復雜的網絡，促進RA的發(fā)生與發(fā)展[1]。盡管RA血管翳的發(fā)病機制尚不明確，但是目前有大量文獻證實基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是與血管翳生成密切相關的細胞因子，主要通過作用于血管內皮細胞參與RA血管翳的生成[2-6]。但其與炎癥反應階段相關細胞因子的關系尚不清楚。IL-6是一種多效性前炎癥細胞因子，在RA炎癥反應階段起著重要作用，且IL-6水平與疾病活動性及臨床表現(xiàn)密切相關。前期研究證實，IL-6需與IL-6受體結合后才可發(fā)揮相應的生物學效應。IL-6有兩種信號轉導途徑，其中研究最多的一種是IL-6需要與IL-6Rα直接結合，形成IL-6/IL-6α復合物后再與gp130結合形成高親和力的復合物，從而發(fā)揮多種生物學效應[7]。另外一種途徑是一種可溶形式的IL-6R（sIL-6R）與IL-6結合形成循環(huán)復合物，IL-6/sIL-6R復合物與表達gp130細胞結合，增加了對IL-6起反應的細胞種類[8]。研究證實，許多IL-6引起的炎癥均是由sIL-6R介導的，因此IL-6/sIL-6R復合物才是重要的促炎癥介質。目前抗IL-6Rα的人源化藥物Tocilizumab（TCZ）已應用于臨床，該藥可減輕RA患者的癥狀，降低疾病的活動度，但也有一定不良反應，限制了該藥在臨床中的應用[9]。因此IL-6/sIL-6R復合物在RA發(fā)病機制中的研究顯得更為重要。筆者探討RA關節(jié)局部高表達的IL-6/sIL-6R復合物是否與VEGF及MMP-9表達相關，旨在為RA的發(fā)病機制提供依據(jù)，并探索新的藥物治療靶點。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑 人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）購自中科院細胞庫，F(xiàn)BS購自美國Gibco公司，重組人IL-6、sIL-6R購自美國PeproTech公司，兔抗人MMP-9一抗購自美國Cell Signaling Technology公司；兔抗人VEGF一抗購自英國Abcam公司；羊抗人GAPDH單克隆抗體購自中國中杉金橋公司；Trizol購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；real-time PCR試劑盒購自美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將HUVECs置于含體積分數(shù)為10%FBS 和青/鏈霉素（青霉素 100U/ml，鏈霉素 100mg/ml）的DMEM培養(yǎng)基中，在溫度為37℃，體積分數(shù)為5%CO2孵箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的HUVECs，接種于6孔板中，接種密度為 1×105/孔。饑餓 6h 后，用 0、10、20、40、80ng/ml不同濃度的IL-6聯(lián)合sIL-6R 100ng/ml刺激細胞，培養(yǎng)24h后收集細胞，檢測細胞mRNA水平及蛋白表達。

1.2.2 real-time PCR檢測MMP-9及VEGF的mRNA表達 Trizol法提取總RNA，并將RNA反轉錄為cDNA。PCR反應體系：反應體積為5 μl，其中包括Power SYBR Green PCR Master Mix（2×）2.5μl，超純水 1.25μl，上下游引物各0.125μl及稀釋的cDNA 1μl。每組設3個復孔。擴增條件為：95℃ 10min，40 個循環(huán)（95℃ 15s，60℃1min）。以β-actin作為內參基因。引物由Invitrogen公司合成，序列如下：MMP-9：上游引物 5′-TGTACCGCTATGGTTACACTCG-3′，下游引物 5′-GGCAGGGACAGTTGCTTCT-3'；VEGF 引物序列為：上游引物 5′-GAGGAGCAGTTACGGTCTGTG-3′，下游引物 5′-TCCTTTCCTTAGCTGACACTTGT-3′；β-actin 引物序列為：上游引物 5′-ACTGGAACGGTGAAGGTGACC-3′，下游引物 5′-AGAGAAGTGGGGTGGCTTTT-3′。 所有擴增均在ABI 7900 real-time PCR儀上進行。反應結束后作溶解曲線。以目的基因的Ct值減去內參的Ct值為Δ內參，2-Δ內參值來表示目的基因mRNA表達水平的高低。

1.2.3 Western blot法檢測MMP-9和VEGF蛋白的表達 提取標本總蛋白，以蛋白總含量20μg加樣，經SDS-PAGE凝膠電泳后，將蛋白轉移至PVDF膜上，封閉液封閉，4℃孵育一抗過夜，第2天TBST洗膜3次，15min/次，孵育二抗 2h，TBST 洗膜 3 次，15min/次，顯影曝光，測定各條帶吸光度值。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，不同濃度IL-6/sIL-6R復合物與空白組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度IL-6/sIL-6R復合物與空白組 MMP-9及VEGF mRNA表達的比較 結果發(fā)現(xiàn)IL-6 40ng/ml+sIL-6R 100ng/ml組及 IL-6 80ng/ml+sIL-6R 100ng/ml組VEGF及MMP-9的表達較空白組明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），IL-6 20ng/ml+sIL-6R 100ng/ml組及IL-6 10ng/ml+sIL-6R 100ng/ml組較空白組間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。另外HUVECs VEGF及MMP-9的表達與IL-6的刺激呈劑量依賴性。詳見圖1。

圖1 不同濃度IL-6/sIL-6R復合物與空白組MMP-9及VEGF mRNA表達的比較（與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

2.2 不同濃度IL-6/sIL-6R復合物與空白組MMP-9及VEGF蛋白表達的比較 結果發(fā)現(xiàn)IL-6 40ng/ml+sIL-6R 100ng/ml組及 IL-6 80ng/ml+sIL-6R 100ng/ml組VEGF及MMP-9蛋白的表達較空白組明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），IL-6 20ng/ml+sIL-6R 100ng/ml組及IL-6 10ng/ml+sIL-6R 100ng/ml組與空白組間比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），且MMP-9表達與IL-6的刺激呈劑量依賴性。詳見圖2。

圖2 不同濃度IL-6/sIL-6R復合物與空白組MMP-9及VEGF蛋白表達的比較（與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

3 討論

RA的發(fā)病機制涉及復雜的細胞免疫及體液免疫反應，包括免疫復合物形成、血管反應、淋巴細胞及單核細胞在滑膜的浸潤等。這些浸潤的細胞與滑膜細胞一起釋放包括IL-6在內的多種促炎癥介質，作用于滑膜內的其他細胞，形成滑膜及關節(jié)周圍的持續(xù)炎癥[1]。RA的滑膜改變可分為炎癥期、血管翳形成期和纖維化三期。炎癥期以IL-6為代表的炎癥因子的作用結果[10]，血管翳形成期以VEGF及基質金屬蛋白酶為主導[11-12]，本研究發(fā)現(xiàn)高表達的IL-6/sIL-6R復合物可促進內皮細胞VEGF及MMP表達，激活血管新生，加重關節(jié)軟骨和骨質損傷，最終導致患者出現(xiàn)關節(jié)畸形。

RA患者血清及關節(jié)液中IL-6及sIL-6R明顯升高，且IL-6及sIL-6R水平與慢性滑膜炎的局部關節(jié)癥狀及關節(jié)破壞程度顯著相關[13-14]。研究表明，許多IL-6引起的炎癥是由sIL-6R介導的，Hashizume等[15]研究發(fā)現(xiàn)，IL-6、sIL-6R或IL-1β可誘導核因子κB活化因子受體（RANKL）表達，進一步誘導破骨細胞活化，最終導致RA關節(jié)骨破壞，另外TNF-α和IL-17亦只有在sIL-6R存在時才能誘導RANKL的表達。Misato Hashizume等[16]研究證實IL-6/sIL-6R復合物而非IL-6可促進HUVECs的血管增生。而筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，單獨IL-6并不能刺激HUVECs表達VEGF及MMP-9。也有研究證實IL-6聯(lián)合sIL-6R作用于滑膜內其他細胞，可引起滑膜及其他關節(jié)結構的持續(xù)炎癥，加重關節(jié)局部的骨破壞。

VEGF是一類特異性血管生成因子，可以促進內皮，細胞的增殖和提高血管通透性，促進新生血管的形成，參與RA關節(jié)周圍的血管翳生成，為滑膜細胞提供營養(yǎng)及氧，并招募炎癥因子[17]。MMP-9是一類能有效降解細胞外基質及細胞膜成分的蛋白水解酶，同時也能釋放生長因子、趨化因子和細胞因子等，其作用底物廣泛，表達細胞眾多，參與人體許多生理和病理過程[18]。Jackson等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在MMP-9的作用下可導致慢性滑膜組織增生，表現(xiàn)為滑膜襯里細胞增生，炎性細胞浸潤，滑膜下細胞增生和炎性細胞浸潤及滑膜下層血管生成，增生的滑膜組織向軟骨面生長，形成血管翳。

本研究證實IL-6/sIL-6R復合物而非IL-6可上調內皮細胞表達血管生成相關因子VEGF及MMP-9?？梢奍L-6和VEGF在RA發(fā)生、發(fā)展是級聯(lián)先后出現(xiàn)的，IL-6/sIL-6R復合物可促進內皮細胞分泌VEGF和MMP-9，使內皮遷移和增殖，改變小血管通透性，導致血管翳形成，加重骨破壞。因此，IL-6/sIL-6R復合物在RA的炎癥期及血管翳形成期起著承上啟下的作用，在RA的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。

[1] McInnes I B,Schett G.The pathogenesis of rheumatoid arthritis[J] .N EnglJ med,2011,365(23):2205-2219.

[2] Koichiro K,Hiroyuki E,Isao I,et al.Expression of ADAM15 in rheumatoid synovium:up-regulation by vascular endothelial growthfactor and possible implicationsfor angiogenesis[J] .Arthritis ResTher,2005,7(6):R1158-1173.

[3] Jackson C,Nguyen M,Arkel J,et al.Selective matrix metalloproteinase(MMP)inhibition in rheumatoid arthritis-targeting gelatinase Aactivation[J] .Inflamm Res,2001,50(4):183-186.

[4] Nagase H,Woessner JF.Matrix metalloproteinases[J] .J Biol Chem,1999,274:21491-21494.

[5] Van den Steen PE,Dubois B,Nelissen I,et al.Biochemistry and molecular biology of gelatinaseB or matrix metalloproteinase-9(MMP-9)[J] .Crit Rev Biochem MolBiol,2002.37:375-536.

[6] Koch A E.The role of angiogenesis in rheumatoid arthritis:recent developments[J] .Ann Rheum Dis,2000,59(Suppl1):i65-71.

[7] 苗平,張冬青.IL-6/IL-6受體與類風濕關節(jié)炎關聯(lián)性研究新進展[J] .免疫學雜志,2011,27(4):355-360.

[8] Dayer JM,Choy E.Therapeutic targets in rheumatoid arthritis:the interleukin.6 receptor[J] .Rheumatology(Oxford),2010,49(1):15-24.

[9] Scheinecker C,Smolen J,Yasothan U,et al.Tocilizumab[J] .Nature reviews,2009,8(4):273-274.

[10] De Benedetti F.Targeting interleukin-6 in pediatric rheumatic disease[J] .Curt Ooin Rheumatol,2009,21(5):533-537.

[11] Yoo S A,Kwok S K,Kim W U.Proinflammatory role of vascular endothelial growth factor in the pathogenesis of rheumatoid arthritis:prospects for therapeutic intervention[J] .Mediators Inflamm,2008,2008:129873.

[12] Jackson C,Nguyen M,Arkel J,et al.Selective matrix metalloproteinase (MMP)inhibition in rheumatoid arthritis-targeting gelatinase Aactivation[J] .Inflamm Res,2001,50(4):183-186.

[13] Robak T,Gladalska A,Stepien H,et al.Serum levels of interleukin-6 type cytokines and soluble interleukin-6 receptor in patients with rheumatoid arthritis[J] .Mediators Inflamm,1998,7(5):347-353.

[14] Cronstein BN.Interleukin-6-a key mediator of systemic and local symptoms in rheumatoid arthritis[J] .Bulletin of the NYU hospitalfor joint diseases,2007,65(Suppl1):S11-15.

[15] Hashizume M,Hyakawa N,Mihara M.IL-6 trans-signalling directly induces RANKL on fibroblast-like synovial cells and is involved in RANKLinduction by TNF-alpha and IL-17[J] .Rheumatology(Oxford,England),2008,47(11):1635-1640.

[16] Misato Hashizume,Naohiko Hayakawa,Miho Suzuki,et al.IL-6/sIL-6R trans-signalling,but not TNF-α induced angiogenesis in a HUVEC and synovialcellco-culture system[J] .RheumatolInt,2009,29:1449-1454.

[17] 王碩,李時榮.VEGF、IL-6在類風濕關節(jié)炎發(fā)病中的作用研究進展[J] .山東醫(yī)藥,2014,54(7):94-96.

[18] Vandooren J,Van den Steen PE,Opdenakker G.Biochemistry and molecular biology of gelatinase B or matrix metalloproteinase-9(MMP-9):the next decade[J] .Critical reviews in biochemistry and molecular biology,2013,48(3):222-272.

[19] Jackson C,Nguyen M,Arkel J,et al.Selective matrix metalloproteinase(MMP)inhibition in rheumatoid arthritis-targeting gelatinase Aactivation[J] .Inflamm Res,2001,50(4):183-186.