王海 周蕾 王克義 懷磊

出生缺陷不僅嚴(yán)重影響嬰幼兒的生命和生活質(zhì)量，而且會給家庭和社會帶來沉重的精神和經(jīng)濟負擔(dān)。染色體非整倍體異常，是嚴(yán)重的出生缺陷之一，目前尚無有效的治療方法，其新生兒發(fā)病率約1‰～2‰[1]，主要包括21-三體綜合征（唐氏綜合征）、18-三體綜合征（愛德華綜合征）、13-三體綜合征（帕特綜合征）及性染色體非整倍體。早中孕期血清學(xué)指標(biāo)聯(lián)合胎兒超聲指標(biāo)檢測進行產(chǎn)前篩查的靈敏度和特異度欠佳，而傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷方法是通過獲取胎兒的絨毛、羊水、臍血或者組織來進行診斷，這些侵襲性的方法可能導(dǎo)致宮內(nèi)感染、流產(chǎn)等不良后果，從而大大降低了產(chǎn)前診斷的依從性。隨著孕婦外周血中胎兒游離DNA（cff-DNA）逐漸被學(xué)者們證實，利用cff-DNA進行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測越來越受到關(guān)注。研究表明，應(yīng)用基于大規(guī)模平行測序技術(shù)的無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測（non-invasive prenatal testing，NIPT），通過孕婦外周血cff-DNA對染色體非整倍體如21-三體綜合征等檢測具有99%以上靈敏度和特異度[2]。筆者選取914例高危孕婦，在早中孕期開展cff-DNA檢測，通過與臨床金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)-羊水細胞染色體核型分析結(jié)果進行比較，對大規(guī)模平行測序技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的臨床應(yīng)用價值進行探討，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 2014年12月至2016年6月在杭州市第一人民醫(yī)院預(yù)約做產(chǎn)前診斷的單胎妊娠高危孕婦共914例，年齡18～48歲，孕周15～22周。排除自身染色體異常、過度肥胖（BMI＞40）、惡性腫瘤、干細胞與移植手術(shù)史的單胎妊娠孕婦。根據(jù)就診原因不同，將待檢測者分為以下3組：（1）唐氏綜合征篩查（唐篩）高危組563例，21-三體綜合征的風(fēng)險切值為1∶270，18-三體綜合征的風(fēng)險切值為 1∶350；（2）高齡組245例，預(yù)產(chǎn)期年齡≥35歲；（3）其他原因組共106例，如B超檢查發(fā)現(xiàn)胎兒頸項透明層（NT）＞3.0mm、室間隔膜部缺損、羊水過多/少、腦室輕度擴張等。本研究經(jīng)杭州市第一人民醫(yī)院倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，所有孕婦均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 于孕婦進行羊水穿刺前，采集孕婦靜脈血7～10ml，使用Cell-Free DNA BCT管（美國Streck公司），采血后顛倒混勻8～10次，24h內(nèi)進行血漿分離，具體流程如下：（1）采血管以4℃低溫下1 600g離心10min，將上清液分裝至多個2ml的離心管中；（2）離心管以4℃低溫16 000g離心10min，上清液轉(zhuǎn)入新的且已編號的2ml離心管中，置于-80℃低溫冰箱保存并做好標(biāo)記。

1.2.2 血漿游離DNA提取 使用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit（德國Qiagen公司）試劑盒，嚴(yán)格按照說明書操作。提取過程中設(shè)置陰性對照和重復(fù)對照，采用Qubit Fluorometer核酸定量計檢測樣品DNA濃度。提取后的DNA用于測序文庫制備，在-80℃條件下保存。

1.2.3 文庫制備和DNA測序 提取的血漿DNA應(yīng)用T4 DNA聚合酶（T4 DNA Polymerase）、克列諾片段（Klenow fragment）和T4多聚核苷酸激酶（T4 PNK）對片段末端進行修復(fù)。在3′端加堿基“A”使得DNA片段與5′端帶有“T”堿基的特殊接頭連接。通過PCR技術(shù)擴增兩端帶有接頭的DNA片段并對PCR產(chǎn)物進行純化，依托美國Life Technologies公司的Ion Proton平臺，采用BioelectronSeq4000高通量測序儀器，應(yīng)用半導(dǎo)體測序法進行高通量基因測序及數(shù)據(jù)分析，獲得不低于500M的有效reads數(shù)，平均每個樣本不低于5M的reads，測序時優(yōu)化測序條件以減少GC不均勻分布的影響。

1.2.4 序列的比對和計算 將測序所得序列比對至人類基因組參考序列圖譜，使用博奧生物技術(shù)有限公司自有軟件《無創(chuàng)產(chǎn)前數(shù)據(jù)分析管理軟件》針對比對結(jié)果計算每條染色體reads所占比例（%ChrN），sample代表需檢測的樣品，mean%ChrNreference和SD%ChrNreference分別代表參照樣品組平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并利用以下公式計算各個染色體Z值。利用Z值來評估樣本染色體的異常情況（cutoff值：｜Z｜=3）。

1.3 診斷方法

1.3.1 評估樣本的患病情況 測試樣本的ChrN Z-score=（%ChrNsample-mean%ChrNreference）/SD%ChrNreference。例如：測試樣本的Chr21的Z值≥3即判定胎兒為唐氏綜合征高風(fēng)險，測試樣本的Chr18的Z值≥3即判定胎兒為18-三體綜合征高風(fēng)險。

1.3.2 胎兒染色體核型確診方法 對NIPT提示染色體非整倍體異?；颊?，經(jīng)知情同意后，于孕18～22周經(jīng)腹羊膜腔穿刺抽取羊水20ml，送遺傳實驗室常規(guī)羊水細胞培養(yǎng)、觀察、收獲、制片、G顯帶，根據(jù)國際人類細胞遺傳學(xué)命名體系（ISCN2013）進行核型分析。

1.3.3 陰性結(jié)果的隨訪 檢測結(jié)果陰性者，胎兒出生半年后電話隨訪其情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Excel 2007統(tǒng)計軟件，計算NIPT的假陽性率和陽性預(yù)測值。

2 結(jié)果

2.1 914例孕婦NIPT檢測結(jié)果 3組孕婦均完成NIPT，檢測結(jié)果提示存在染色體異常19例（2.1%），詳見表1。

表1 914例孕婦NIPT檢測結(jié)果（例）

2.2 兩種方法檢測胎兒染色體非整倍體異常結(jié)果的比較 914例孕婦經(jīng)羊水細胞培養(yǎng)G顯帶染色體核型分析，發(fā)現(xiàn)16例核型結(jié)果與NIPT結(jié)果一致，包括21-三體 8 例，18-三體 3 例，13-三體 1 例，45，X2 例，47，XXX 1例和47，XXY 1例。3例樣本出現(xiàn)假陽性，NIPT提示 45，X 1例，47，XXY 1例和 47，XXX 1 例，而羊水染色體核型分析均為正常核型；詳見表2。

表2 兩種方法檢測胎兒性染色體異常結(jié)果的比較

2.3 NIPT臨床診斷的準(zhǔn)確性 914例標(biāo)本NIPT陽性19例，陰性895例。19例孕婦的假陽性率、陽性預(yù)測值詳見表3。

2.4 檢測陰性的隨訪結(jié)果 NIPT檢測結(jié)果陰性者共895例及3例假陽性者，截止至2017年4月，電話隨訪已出生的新生兒，均未發(fā)現(xiàn)有異常患兒。

表3 NIPT臨床診斷的準(zhǔn)確性[例（%）]

3 討論

21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征、特納綜合征、克氏綜合征約占產(chǎn)前遺傳疾病的80%～95%[3]，傳統(tǒng)產(chǎn)前篩查方法對于這類疾病的產(chǎn)前檢測檢出率有限，而傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷技術(shù)的創(chuàng)傷性限制了其臨床應(yīng)用?；诖笠?guī)模平行測序技術(shù)的NIPT有效解決了此問題，高通量、大規(guī)模且精準(zhǔn)的測序已經(jīng)應(yīng)用于21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征的臨床產(chǎn)前檢測[4]，并具有高靈敏度和特異度。

2015年Noaon等[5]應(yīng)用孕婦血漿DNA高通量測序技術(shù)進行大規(guī)模前瞻性研究，與染色體核型進行比較分析，發(fā)現(xiàn)NIPT對21-三體綜合征的靈敏度和假陽性率分別為99.9%和0.09%；對18-三體綜合征的靈敏度和假陽性率分別為96.3%和0.13%；對13-三體綜合征的靈敏度和假陽性率分別為90.3%和0.23%[6]。梅瑾等[7]研究顯示應(yīng)用孕婦血漿DNA高通量測序技術(shù)進行胎兒染色體非整倍體檢測，該技術(shù)對21-三體綜合征及18-三體綜合征檢測的特異度和靈敏度均為100%，陽性預(yù)測值100%，而林穎等[8]檢測胎兒染色體拷貝數(shù)異常的靈敏度和特異度均為100%，鄧璐莎等[9]報道為100%和96.7%。本研究對914例孕婦外周血進行大規(guī)模平行測序分析，檢出21-三體綜合征高風(fēng)險病例8例，18-三體綜合征高風(fēng)險病例3例，13-三體綜合征高風(fēng)險病例1例，與臨床金標(biāo)準(zhǔn)方法-染色體核型分析法相比，統(tǒng)計分析顯示無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征的陽性預(yù)測值均為100%，而假陽性率均為0，與上述研究報道基本相符，而本研究13-三體綜合征的陽性預(yù)測值為100%，假陽性率均為0，可能由于樣本例數(shù)偏少，故不能排除小概率事件的發(fā)生。對于性染色體非整倍體產(chǎn)前檢測，NIPT技術(shù)的準(zhǔn)確性在國內(nèi)外研究報道則差別較大，國內(nèi)研究中，段紅蕾等[10]對13 041例進行NIPT檢測的病例進行回顧性分析，發(fā)現(xiàn)NIPT技術(shù)對性染色體數(shù)目異常的陽性預(yù)測值僅為40.9%；而 Mazloom 等[11]研究中 NIPT 對 45，X、47，XXX和47，XXY的檢出率分別為83%、85%及83%。本研究中出現(xiàn)3例假陽性，NIPT提示45，X1例，47，XXY1例和47，XXX1例，而羊水染色體核型分析均為正常核型，結(jié)果顯示45，X的假陽性率為0.11%，陽性預(yù)測值為66.7%，47，XXY 和 47，XXX 的假陽性率均為 0.22%，陽性預(yù)測值均為50%，這可能與納入人群和標(biāo)本量有關(guān)。造成胎兒性染色體非整倍體異常NIPT與羊水核型分析結(jié)果不一致的原因眾多,孕齡、體重指數(shù),X染色體GC含量偏移，X和Y染色體高度同源[12]，胎兒分?jǐn)?shù)、胎盤嵌合、母體嵌合以及母體X染色體拷貝數(shù)變異等[13]，都影響NIPT結(jié)果的準(zhǔn)確性，導(dǎo)致假陽性率過高[14]。

綜上所述，NIPT對胎兒常染色體非整倍體異常（21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征），具有極高的陽性預(yù)測值和極低的假陽性率，是一種“近似于產(chǎn)前診斷水平的”產(chǎn)前篩查技術(shù)；但對胎兒性染色體非整倍體異常檢出的陽性預(yù)測值較低，因此NIPT只能作為一種高級篩查性檢測而不是確診方法，篩查陽性病例需要通過進一步用傳統(tǒng)的侵入性產(chǎn)前診斷確診。因此在現(xiàn)有產(chǎn)前篩查、產(chǎn)前診斷模式中，對于NIPT的定位應(yīng)作為現(xiàn)有產(chǎn)前篩查體系的后續(xù)補充，也就是作為高級別的篩查技術(shù)存在，作為高風(fēng)險或臨界風(fēng)險病例的二次篩查模式，后續(xù)與當(dāng)前的侵入性產(chǎn)前診斷技術(shù)體系相結(jié)合[15]。

[1] 邱潔,楊曉華,鄧細娣,等.無創(chuàng)產(chǎn)前診斷在產(chǎn)前篩查后續(xù)診斷的臨床實施與綜合效益分析[J] .中國優(yōu)生與遺傳雜志,2013,21(7):21-22.

[2] Bianchi DW,Parker RL,Wentworth J,et al.DNA sequencing versus standard prenatal aneuploidy screening[J] .N Engl J Med,2014,370(9):799-808．

[3] 戚慶煒,蔣宇林,周希亞,等.6 584例高齡孕婦妊娠中期羊水染色體核型分析結(jié)果[J] .中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志,2013,16(2):76-81．

[4] Nicolaides KH,Syngelaki A,Gil M,et al.Validation of targeted sequencing of single-nucleotide polymorphisms for non-invasive prenatal detection of aneuploidy of chromosomes 13,18,21,X,and Y[J] .Prenat Diagn,2013,33(6):575-579．

[5] Noaon ME,Jacobsson B,Swamy GK,et al.Cell-free DNA analysis for noninvasive examination of trisomy[J] ．N EnglJ Med,2015,372(17):1589-1597.

[6] Gil MM,Quezada MS,Revello R,et al.Analysis of cell.free DNA in maternal blood in screening for fetal aneuploidies:updated meta-analysis[J] .Ultrasound Obstet Gynecol,2015,45(3):249-266.

[7] 梅瑾,王小華,王昊,等.無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測在胎兒染色體非整倍體篩查中的應(yīng)用[J] .中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2014,15(3):238-240．

[8] 林穎,孟露露,季修慶,等.血漿游離DNA高通量測序用于21-三體綜合征無創(chuàng)產(chǎn)前檢測[J] .臨床檢驗雜志,2013,31(1):7-8．

[9] 鄧璐莎,郭曉玲,鐘進,等.100例非整倍體無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測的研究[J] .中國優(yōu)生與遺傳雜志,2013,21(5):14-15．

[10] 段紅蕾,李潔,薛源,等.江蘇省13 041例無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的指征及結(jié)果分析[J] .中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志,2014,17(12):813-816.

[11] Mazloom AR,Dzakula Z,Oeth P,et al.Noninvasive prenataldetection of sex chromosomal aneuploidies by sequencing circulating cell-free DNA from maternal plasma[J] .Prenat Diagn,2013,33(6):591-597．

[12] Wang T,He Q,Li H,et al.An Optimized Method for Accurate Fetal Sex Prediction and Sex Chromosome Aneuploidy Detection in Non-Invasive PrenatalTesting[J] .PLoS One,2016,11(7):e0159648.

[13] Osborne CM,Hardisty E,Devers P,et al.Discordant noninvasive prenatal testing results in a patient subsequently diagnosed with metastatic disease[J] .Prenat Diagn,2013,33(6):609-611.

[14] Dondorp W,de Wert G,Bombard Y,et al.Non-invasive prenatal testing for aneuploidy and beyond:challenges of responsible innovation in prenatal screening[J] .Eur J Hum Genet,2015,23(11):1438-1450.

[15] 蔣宇林,朱宇寧,呂時銘,等.2012年產(chǎn)前分子診斷新技術(shù)專家座談會紀(jì)要[J] .中華婦產(chǎn)科雜志,2012,47(11):804-807.