劉苑蘋(píng) 李恒 包蓓艷 陳江華

糖尿病腎病是糖尿病常見(jiàn)的重要微血管并發(fā)癥之一，是終末期腎病的主要原因之一，也是糖尿病患者致殘、致死的重要原因。糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，已有研究表明血流動(dòng)力學(xué)因素、細(xì)胞因子因素在糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。尾加壓素Ⅱ（urotensinⅡ，UⅡ）是迄今發(fā)現(xiàn)體內(nèi)作用最強(qiáng)的縮血管活性肽，其縮血管效應(yīng)是內(nèi)皮素-1的10倍多[1]，且UⅡ還是一種具有絲裂原樣作用的生長(zhǎng)因子，有刺激細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)等多種非血流動(dòng)力學(xué)效應(yīng)[2-3]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）是一種多潛能的生長(zhǎng)因子，由多種細(xì)胞分泌、具有多重生物學(xué)效應(yīng)。近年來(lái)有研究提示UⅡ及TGF-β1與糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展存在一定的關(guān)系[4-5]，但有關(guān)UⅡ在糖尿病腎病的表達(dá)規(guī)律迄今未見(jiàn)報(bào)道。筆者通過(guò)免疫組化法觀察糖尿病腎病腎臟組織中UⅡ 和TGF-β1的表達(dá)，旨在探討UⅡ和TGF-β1與糖尿病腎病病理及實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)之間的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選擇2012年1月至2015年1月寧波市泌尿腎病醫(yī)院行腎穿刺且病理診斷為糖尿病腎病的42例患者，排除合并惡性腫瘤及其他腎臟病（如原發(fā)性腎小球腎炎、藥物性腎損傷等）。Tervaet等[6]標(biāo)準(zhǔn)病理指標(biāo)定義：Ⅰ期：腎小球基底膜增厚，輕度或非特異性光鏡改變；Ⅱ期：系膜增生；Ⅲ期：結(jié)節(jié)性硬化；Ⅳ期：球性廢棄＞50%。根據(jù)Tervaet糖尿病腎病病理分型分為病變較輕組（糖尿病腎病Ⅰ期、Ⅱ期，A組）20例和病變較重組（糖尿病腎?、笃?、Ⅳ期，B組）22例。A組男9例，女11 例，年齡 39～71（57.81±9.47） 歲；BMI 21.81～26.12（24.35±2.09）kg/m2；B 組男 12 例，女 10 例，年齡 45～75（59.90±7.97）歲；BMI 21.23～26.14（24.46±3.16）kg/m2。選自同期寧波市泌尿腎病醫(yī)院泌尿外科住院手術(shù)患者15例作為對(duì)照組（C組），男9例，女6例，年齡39～77（57.47±10.41）歲；BMI 21.91～26.20（24.29±2.61）kg/m2，標(biāo)本取自腎外傷破裂切除、腎腫瘤切除的腎組織（腎腫瘤切除組織需取遠(yuǎn)離腫瘤的腎組織），排除合并急慢性腎臟病、糖尿病、肉眼血尿的患者。3組患者性別、年齡、BMI的比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

1.2 主要試劑 人UⅡ試劑盒、人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1試劑盒均由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)。

1.3 標(biāo)本采集 A、B組標(biāo)本采集：腎組織均為經(jīng)皮腎穿刺活檢方法獲得，穿刺部位選擇左腎下極外側(cè)緣。每例患者獲得2條直徑1.2mm，長(zhǎng)約1.2cm腎組織，腎小球數(shù)不少于15個(gè)；尿液：腎穿刺前1d清晨留取晨尿；24h尿液：留取腎穿刺前1d至腎穿刺當(dāng)日24h尿液，甲醛固定防腐；血液：腎穿刺當(dāng)日清晨空腹抽血。C組標(biāo)本采集：腎組織為手術(shù)時(shí)留?。荒蛞海菏中g(shù)前1d清晨留取晨尿；24h尿液：手術(shù)前1d至手術(shù)當(dāng)日24h尿液，甲醛固定防腐；血液：手術(shù)當(dāng)日清晨空腹抽血。腎組織標(biāo)本均行常規(guī)病理檢查。腎小球、腎小管間質(zhì)及血管病變的各項(xiàng)病理參數(shù)，采用KatafuChi的半定量標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分。

1.4 腎組織形態(tài)學(xué)觀察和免疫組織化學(xué)檢測(cè) 腎組織經(jīng)4%中性甲醛固定48h，常規(guī)制備石蠟切片，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組腎組織中UⅡ、TGF-β1的表達(dá)情況。采用雙盲法光鏡觀察，每張切片選取20個(gè)高倍鏡（×200）視野下的腎小管區(qū)域，UⅡ、TGF-β1 采用半定量方法計(jì)數(shù)，以腎小管上皮細(xì)胞質(zhì)染色棕褐色為UⅡ、TGF-β1表達(dá)陽(yáng)性腎小管，通過(guò)每個(gè)視野下UⅡ、TGF-β1陽(yáng)性腎小管占總腎小管的百分?jǐn)?shù)評(píng)分，0分：無(wú)；1/2分：0～12.5%；1分：12.5%～25%；2分：25%～50%；3分：50%～75%；4分：75%～100%；最后以平均值表示。腎小球中UⅡ、TGF-β1的表達(dá)以15個(gè)腎小球中染色棕褐色為陽(yáng)性腎小球細(xì)胞，最后以平均值表示。

1.5 觀察指標(biāo) 記錄3組患者血肌酐、血尿素氮、24h尿蛋白定量、尿微量白蛋白、腎小球?yàn)V過(guò)率（eGFR），以及KatafuChi的半定量慢性化積分、總積分（半定量慢性化積分+半定量活動(dòng)性積分）、UⅡ和TGF-β1在腎小球及腎小管的表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用表示,組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)、多元線性回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 3組患者血肌酐、血尿素氮、24h尿蛋白定量、尿微量白蛋白、eGFR、KatafuChi的半定量慢性化積分和總積分的比較 各組血肌酐、血尿素氮、24h尿蛋白定量、尿微量白蛋白、eGFR、KatafuChi的半定量慢性化積分、總積分差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，糖尿病病變較重組顯著高于其他兩組（均P＜0.05），詳見(jiàn)表1。

表1 3組患者血肌酐、血尿素氮、24h尿蛋白定量、尿微量白蛋白、eGFR、KatafuChi的半定量慢性化積分和總積分的比較

2.2 3組患者UⅡ、TGF-β1表達(dá)情況的比較 UⅡ、TGF-β1在C組腎小管的陽(yáng)性表達(dá)均較低，在A、B組表達(dá)水平均明顯增強(qiáng)，其中B組表達(dá)水平高于A組，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。UⅡ、TGF-β1在C組中腎小球只有極個(gè)別細(xì)胞陽(yáng)性，在A組腎小球中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)有所增加，而B(niǎo)組腎小球中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為各組中最多，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），詳見(jiàn)表2。

表2 3組患者UⅡ、TGF-β1表達(dá)情況的比較

2.3 UⅡ、TGF-β1之間與其他實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)的關(guān)系糖尿病患者中UⅡ在腎小球、腎小管的表達(dá)與TGF-β1的表達(dá)均呈正相關(guān)（r腎小球=0.950，r腎小管=0.963，均P＜0.01），與血肌酐、血尿素氮、24h尿蛋白定量、KatafuChi的半定量慢性化積分、總積分均呈正相關(guān)，與微量白蛋白正相關(guān)，與eGFR呈負(fù)相關(guān)。UⅡ、TGF-β1在腎小球、腎小管的表達(dá)與eGFR、半定量積分相關(guān)性最強(qiáng)，詳見(jiàn)表3。分別以腎小球及腎小管U II及TGF-β1的表達(dá)為因變量，將血肌酐、血尿素氮、24h尿蛋白定量、尿微量白蛋白、eGFR、KatafuChi的半定量慢性化積分、總積分作為自變量，進(jìn)行多元線性回歸分析，發(fā)現(xiàn)存在共線性（VIF=16）。因本研究中eGFR通過(guò)血肌酐值計(jì)算而來(lái)，總積分包含慢性化積分，24h尿蛋白定量包含尿微量白蛋白；故將自變量中剔除血肌酐、尿微量白蛋白、慢性化積分剔除，再次行多元回歸分析，結(jié)果顯示：eGFR、總積分與因變量有顯著相關(guān)性（T＞1，P＜0.05），而血尿素氮、24h尿蛋白定量相關(guān)性不顯著。

表3 糖尿病患者UⅡ、TGF-β1在腎小球、腎小管的表達(dá)與血肌酐、血尿素氮、24h尿蛋白定量、eGFR、KatafuChi的半定量慢性化積分和總積分的相關(guān)性（r值）

3 討論

糖尿病腎病的早期病理改變?yōu)槟I小球肥大、基底膜增厚、細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）積聚。已有研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病腎病模型大鼠的腎組織中，UⅡ水平的表達(dá)與腎小球平均體積及基底膜厚度的關(guān)系均呈正相關(guān)，表明UⅡ的過(guò)度表達(dá)與糖尿病腎病模型大鼠的腎臟病理的形態(tài)學(xué)改變密切相關(guān)[7]。

UⅡ?qū)δI固有細(xì)胞具有很強(qiáng)的促有絲分裂作用。采用3H-TdR摻入法研究體外培養(yǎng)的大鼠腎系膜細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)UⅡ能以濃度依賴(lài)式促進(jìn)3H-TdR摻入增加，促進(jìn)腎系膜細(xì)胞增殖，該效應(yīng)與胞外Ca2+內(nèi)流、鈣調(diào)素激酶以及蛋白激酶C有關(guān)[8]。

UⅡ能夠促進(jìn)體外高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞纖連蛋白、Ⅳ膠原mRNA的表達(dá)[9]。UⅡ同樣能以劑量依賴(lài)式促進(jìn)豬腎內(nèi)皮細(xì)胞索3H-TdR摻入增加，使豬腎內(nèi)皮細(xì)胞索的DNA合成及細(xì)胞數(shù)量增加，提示UⅡ表現(xiàn)出生長(zhǎng)因子的活性[1]。本研究發(fā)現(xiàn)UⅡ表達(dá)在系膜增寬部位是增加的，KW形成區(qū)域明顯增加。UⅡ表達(dá)與腎小球活動(dòng)性積分呈正相關(guān)，說(shuō)明UⅡ表達(dá)與系膜區(qū)細(xì)胞基質(zhì)增生及細(xì)胞增殖密切相關(guān)。糖尿病腎病同樣存在腎小管間質(zhì)病變，腎小管間質(zhì)病變可能在糖尿病腎病患者進(jìn)展至終末期腎病中占據(jù)更主要的決定作用[11]。

TGF-β1是一個(gè)多潛能的生長(zhǎng)因子，由多種細(xì)胞分泌的、具有多重生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，如趨化作用、有絲分裂原作用、促凋亡作用、促纖維化等[3、12]。TGF-β1主要分布在腎臟，其增多與組織纖維化之間存在因果關(guān)系，是公認(rèn)的一種促纖維化因子，它不僅在間質(zhì)表達(dá)，而且也存于在腎小管上皮細(xì)胞中，并可以誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化[13]。

已有研究發(fā)現(xiàn)大鼠糖尿病組腎小管上皮細(xì)胞UⅡ與TGF-β1的表達(dá)水平呈正相關(guān)[2]。UⅡ能促進(jìn)大鼠NRK-49F細(xì)胞增殖，影響細(xì)胞周期，可能與致纖維化因子TGF-β1的提高有關(guān)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1的表達(dá)與腎小管間質(zhì)病變積分呈正相關(guān)，本研究通過(guò)觀察糖尿病腎病患者腎臟組織中UⅡ與TGF-β1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)不管在腎小球還是在腎小管，兩者表達(dá)均正相關(guān)（r腎小球=0.950，r腎小管=0.963，P＜0.01），說(shuō)明兩者之間存在密切的聯(lián)系，兩者可能存在協(xié)同作用，但兩者之間作用機(jī)制尚不明確。

本研究發(fā)現(xiàn)UⅡ在正常對(duì)照組中的表達(dá)極少，在糖尿病腎病患者中表達(dá)明顯增加，且在糖尿病病變較重組的表達(dá)明顯高于糖尿病病變較輕組，而且UⅡ的表達(dá)與KatafuChi的半定量慢性化積分、總積分顯著相關(guān)，說(shuō)明UⅡ隨著糖尿病腎病病情的加重表達(dá)是增加的，其能較好的評(píng)估糖尿病腎病的病變程度。UⅡ及TGF-β1的表達(dá)與血肌酐、eGFR、24h尿蛋白定量均有一定相關(guān)性，引入多元性回歸分析后24h尿蛋白定量并無(wú)顯著相關(guān)性，可能與糖尿病腎病進(jìn)展到一定程度，腎小管間質(zhì)損傷突出，尿蛋白并未進(jìn)一步增加有關(guān)，說(shuō)明腎組織中UⅡ及TGF-β1的表達(dá)比尿蛋白能更好的反應(yīng)糖尿病腎病嚴(yán)重程度。多元性回歸分析表明尿素氮與UⅡ及TGF-β1的表達(dá)并無(wú)明顯相關(guān)性，考慮與患者肌肉含量、飲食等混雜因素有關(guān)。

最近有研究表明，UⅡ受體拮抗劑palosuran可增加胰島素的釋放并提高糖尿病大鼠的存活率，可以延緩糖尿病大鼠尿蛋白和腎臟損傷的發(fā)生[15]。故隨著UⅡ生物學(xué)作用的進(jìn)一步闡明,UⅡ可能成為腎臟疾病尤其是糖尿病腎病治療的新靶點(diǎn)。

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