劉子菡 郝春雷

摘要：采用土著茵群、無機(jī)鹽、向日葵進(jìn)行了石油烴降解試驗(yàn)，結(jié)果表明：石油烴降解率達(dá)到了76.3%，土壤石油類含量由5621.6 mg/kg下降至1332.3 mg/kg，為石油烴污染土壤治理提供了生物聯(lián)合修復(fù)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐，該技術(shù)是土壤環(huán)境治理技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞：油田;土壤污染;向日葵;石油烴降解菌;就地修復(fù)

中圖分類號(hào)：X53

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1674-9944（2018）4-0117-04

1 引言

河南油田地處河南省西南部的南陽盆地，土壤類型為黃棕壤，是黃紅壤與棕壤之間的過渡性土類，微酸性。河南油田產(chǎn)出原油為低硫石蠟基類稀油和瀝青基類稠油，東部11個(gè)油田生產(chǎn)的原油，除3個(gè)稠油油田外，近80%的原油具有含蠟高、含硫低、凝固點(diǎn)高、輕質(zhì)餾分比例低等特點(diǎn)。隨著油田開采時(shí)間的延長，油水管線腐蝕穿孔、泄露造成的土壤污染，以及集油站、油水井井場(chǎng)等生產(chǎn)設(shè)備密集場(chǎng)所的土壤現(xiàn)狀不容樂觀，同時(shí)，關(guān)停井井場(chǎng)的土壤修復(fù)、復(fù)耕已迫在眉睫。如何高效地進(jìn)行石油烴污染土壤的修復(fù)是擺在石油人面前的難題。

自然環(huán)境中的微生物極其豐富，當(dāng)生存環(huán)境被污染后，微生物群落結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化，適應(yīng)石油污染的種群繼續(xù)發(fā)展或更好地發(fā)展，不適應(yīng)石油污染的種群就會(huì)受到抑制最終被淘汰。土壤中石油烴的降解是混合菌共同作用的結(jié)果，通常不同的降解菌降解不同類型的石油烴分子，原油降解是由多種石油烴降解菌協(xié)同完成的[1]。在實(shí)際環(huán)境中，微生物種類繁多，作用復(fù)雜，它們根據(jù)需要構(gòu)成一個(gè)特殊的生態(tài)群體[2]。大量研究表明，當(dāng)菌群處于石油污染環(huán)境中時(shí)，利用烴類化合物的微生物數(shù)量急劇增長，在這個(gè)生態(tài)群體中，有些菌株雖然不能單獨(dú)利用污染物，但是能利用中間代謝物生長，有的菌株拮抗其他菌株的降解，但是另一種菌株的存在又抵消了這種負(fù)作用，每一種菌在石油降解的過程中都有其用途[3]，因此，使用土著菌群而不是分離出單株菌株進(jìn)行試驗(yàn)是一種有益的嘗試。

在被污染的環(huán)境體系中，石油烴是微生物可以利用的大量碳底物，但它只能夠提供有機(jī)碳而不能夠提供其他營養(yǎng)物，因而氮、磷常常是限制微生物活性的重要因素[4]，為了使污染物完全降解，營養(yǎng)物是影響微生物降解的重要因素之一，有機(jī)和無機(jī)肥料的添加可在不同程度上提高石油烴的降解率;同時(shí)，土壤含氧量、含水率也對(duì)石油烴降解起到重要作用，地表植物的種植可以改善土壤含氧量與含水率狀態(tài)，有利于菌群更好地生存，同時(shí)植物對(duì)有機(jī)物也有吸收降解作用，有研究表明向日葵能減少土壤中多環(huán)芳香烴的能力。因此，烴降解菌群、碳源、營養(yǎng)鹽、含氧量、含水率、土壤有機(jī)質(zhì)、植被等要素構(gòu)成了一個(gè)系統(tǒng)，系統(tǒng)各要素之間協(xié)同作用，改善土壤污染狀況。

2 研究方法

本研究利用土著石油烴降解菌群、無機(jī)營養(yǎng)鹽、植物的共同作用進(jìn)行石油烴污染土壤降解試驗(yàn)。首先，使用采自不同采油井場(chǎng)的土壤，富集土著微生物菌群，在實(shí)驗(yàn)室考察其在液態(tài)環(huán)境對(duì)石油烴的降解性能，選擇具有較好降解效果的土著菌群，進(jìn)行復(fù)壯擴(kuò)培，投加到河南油田污染土壤中;其次，通過種植向日葵，記錄其出芽率及植株生長情況以及烴降解率情況。

2.1 培養(yǎng)基的制備

（1）富集培養(yǎng)基：玉米漿干粉1.5 g，硝酸銨1.2 g，磷酸二氫鉀1.2 g，蒸餾水600 mL，pH值為7.21，培養(yǎng)基120℃滅菌20 min。

（2）細(xì)菌培養(yǎng)基：牛肉膏4g，蛋白胨10 g，氯化鈉5g，蒸餾水1000 mL，培養(yǎng)基120℃滅菌20 min。

（3）平板培養(yǎng)基：玉米漿干粉0.38 g，硝酸銨0.3 g，磷酸二氫鉀0.3 g，蒸餾水150 mL，瓊脂粉5g，pH值為7.23。培養(yǎng)基120℃滅菌20 min。

（4）石油烴降解菌培養(yǎng)基：玉米漿干粉1.5 g，磷酸二氫鉀1.2 g，硝酸銨1.2 g，蒸餾水600 mL，pH值為7.02，培養(yǎng)基120℃滅菌20 min。碳源為正十二烷2 mL。

（5）培養(yǎng)皿的準(zhǔn)備：為微生物計(jì)數(shù)用，準(zhǔn)備直徑90mm的培養(yǎng)皿數(shù)套。將培養(yǎng)皿清洗，在干熱滅菌箱中滅菌2h，滅菌溫度為250℃，冷卻后取出待用。

2.2 微生物的富集

將20 g石油烴污染土壤加入100 mL富集培養(yǎng)基中（每個(gè)樣品均做平行樣，3個(gè)樣品共6個(gè)培養(yǎng)基），置于250 mL錐形瓶中，使用脫脂棉將瓶口塞住，30℃、120 r/min搖床培養(yǎng)6d。待培養(yǎng)液渾濁，搖勻倒出80mL培養(yǎng)液，加入新鮮富集培養(yǎng)基80 mL，與上述培養(yǎng)條件相同轉(zhuǎn)接富集培養(yǎng)5d。

2.3 微生物的發(fā)酵

將細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)基30 mL裝入100 mL錐形瓶中（每個(gè)富集培養(yǎng)基均做3個(gè)平行樣品，共18個(gè)培養(yǎng)基），使用透氣橡皮塞塞住瓶口，于120℃、20 min蒸汽滅菌，待壓力降至0時(shí)取出冷卻至45℃，在無菌試驗(yàn)臺(tái)上將已渾濁的培養(yǎng)液分別在培養(yǎng)基液面上、中、下層吸取1 mL接轉(zhuǎn)至細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、120 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

2.4 石油烴降解菌群的培養(yǎng)

待細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)液渾濁后，在100 mL錐形瓶中加入富集培養(yǎng)基30 mL，在無菌試驗(yàn)臺(tái)上將已渾濁的細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)液接轉(zhuǎn)8 mL（菌液含量20%）至新培養(yǎng)基中，在每個(gè)錐形瓶中加入正十二烷2 mL（濃度5%），30℃、120 r/min搖床培養(yǎng)6d。

2.5 液態(tài)石油烴降解率與表面張力的測(cè)定

生物表面活性劑是微生物在一定條件下將某些物質(zhì)轉(zhuǎn)化為具有表面活性的物質(zhì)，它具有表面活性劑的性質(zhì)，即具有親水、親油性，有降低表面張力的能力，同時(shí)具有較好的生物降解性[5]，因此測(cè)定溶液的表面張力，可以驗(yàn)證石油烴降解菌的作用效果。表面張力測(cè)定使用ST-2000全自動(dòng)界面張力儀，將培養(yǎng)液離心取上清液，將清液注入玻璃杯中，被測(cè)液體距杯口5～7 mm，按動(dòng)升降按鈕，待鉑金環(huán)完全浸入液體后停止升降平臺(tái)上升，按動(dòng)升降按鈕，隨著玻璃平臺(tái)下降，測(cè)定值不斷變大，液膜被拉破，玻璃平臺(tái)自動(dòng)停止，自動(dòng)顯示出該液體的實(shí)際表面張力。每組樣品的C號(hào)使用紅外光度法進(jìn)行石油烴降解率的測(cè)定，以驗(yàn)證石油烴降解菌在液態(tài)的降解效果。

2.6 菌落的計(jì)數(shù)

將表面張力最低的（石油烴降解效果最好的）3個(gè)取出，將滅菌的培養(yǎng)皿編號(hào)，從最大稀釋度的稀釋液中取1 mL稀釋液，加到相應(yīng)編號(hào)的培養(yǎng)皿中，樣品加完后，將滅菌的培養(yǎng)基熔化并冷卻到45℃左右，分別倒入相應(yīng)的稀釋平皿中，搖勻后，置于平臺(tái)上，待培養(yǎng)基凝固后，將平皿倒置于25～28℃恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2.7 生物聯(lián)合修復(fù)試驗(yàn)

取液態(tài)石油烴降解率最高的懸菌液，進(jìn)行復(fù)壯，培養(yǎng)出的懸菌液在室外用花盆進(jìn)行生物聯(lián)合降解實(shí)驗(yàn)，供試植物選用向日葵，挑取一定量顆粒飽滿的種子，播種前浸泡2h，取井場(chǎng)含油土壤樣品混勻，分裝在12個(gè)花盆內(nèi)，每個(gè)花盆分裝1000 mL，每組3個(gè)平行樣，編號(hào)A土壤為空白，不添加菌液與營養(yǎng)鹽，編號(hào)B為添加營養(yǎng)鹽（硝酸銨0.2%，磷酸二氫鉀0.2%）的含油土壤，編號(hào)C為添加菌液的含油土壤，編號(hào)D為添加菌液與營養(yǎng)鹽的含油土壤，每個(gè)花盆中播種3粒向日葵種子，每組共9粒，保持盆土濕潤，記錄每組土壤樣品的出芽時(shí)間、出芽率、植株高度、30 d石油烴降解率，生物聯(lián)合修復(fù)試驗(yàn)具體流程見圖1。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

微生物富集土壤樣品采樣地點(diǎn)選取魏崗油礦魏179井場(chǎng)、魏155井場(chǎng)、落地油污油池周邊三個(gè)區(qū)域的石油污染土壤，生物聯(lián)合修復(fù)實(shí)驗(yàn)的土壤為三處的混合土壤。采樣點(diǎn)位選取在井口放空閥附近、原油最易污染的區(qū)域，距離地面5～10 cm處的土壤樣品，石油烴含量最低5326.3 mg/kg，高于《農(nóng)用污泥中污染物控制標(biāo)準(zhǔn)》（GB 4284-84）中污泥類含油污染物控制標(biāo)準(zhǔn)3000mg/kg（0.3%），土壤樣品基本組成成分?jǐn)?shù)據(jù)見表1。

3.1 表面張力

每組樣品測(cè)定A、B兩個(gè)石油烴降解菌培養(yǎng)液樣品的表面張力，具體數(shù)據(jù)見表2。

采自魏179井場(chǎng)的1#樣品表面張力值均低于采自魏155井場(chǎng)的2#樣品與采自污油池周邊的3#樣品，最低為1# -2B達(dá)到了28.49 mN/m。說明采集的污染土壤樣品中的菌種均能產(chǎn)生表面活性劑，且魏179井場(chǎng)的土壤表面張力最低，而生物表面活性劑同時(shí)具有較好的生物降解性，魏179井場(chǎng)土壤的菌群有較好的石油烴降解性能。

3.2 菌落計(jì)數(shù)

取每組樣品表面張力較低的1# -2B、2#-1A、3#-2B使用平板涂布法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，菌落計(jì)數(shù)情況見表3。

菌數(shù)最高的為污油池周邊污染土壤樣品3# -2B，其次為魏179井場(chǎng)土壤樣品1# -2B，說明污油池周邊及魏179井場(chǎng)污染土壤的菌種具有更好的繁殖能力，能被大量富集培養(yǎng)。

3.3 液態(tài)石油烴降解率

將液態(tài)石油烴培養(yǎng)基在搖床培養(yǎng)6d的懸菌液用四氯化碳為萃取液，使用紅外分光光度法測(cè)定石油烴含量，最后通過式（1）計(jì)算出各菌群的石油降解率，具體數(shù)據(jù)見圖2。

石油降解率（%）=初始石油濃度Co -測(cè)定石油逍度C×100%

（1）

初始石油濃度Co

由圖2可知，其中降解率最高的魏179井場(chǎng)土壤樣品1# -2C、1#-1C降解率達(dá)到了56.9%、51.9%，其次為污油池周邊土壤3# -2C降解率為47.1%，說明魏179井場(chǎng)富集培養(yǎng)的菌群具有較好的石油烴降解能力。

3.4 生物聯(lián)合修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取液態(tài)石油烴降解率最高的魏179井場(chǎng)土壤（1#-2）懸菌液，進(jìn)行生物聯(lián)合修復(fù)實(shí)驗(yàn)，花盆放置在室外露天處，使用晾曬自來水保持土壤濕潤，第3dA組出芽率33%，其余各組出芽率89%，第5dA組出芽率67%，B組89%，其余2組100%，第7dA組出芽率78%，B組89%，其余2組100%。見圖3。

30 d后將向日葵苗移出，每組3個(gè)盆土混合均勻，取適量樣品測(cè)定土壤石油類含量，其中D組樣品的土壤石油類含量降至1332.3 mg/kg，降解率達(dá)到76.3%，具體數(shù)據(jù)見表4。

由表4看出，A組未添加菌液與營養(yǎng)鹽，3d出芽率明顯滯后，出芽率僅33%，其余各組土壤出芽率達(dá)到了89%，而添加菌液的C、D組5 d出芽率就達(dá)到100%;說明向日葵種子的萌發(fā)明顯受到石油烴污染的抑制，經(jīng)微生物降解后，含油土壤更適合向日葵的生長。30 d植株生長情況：A、B組最低的植株僅7 cm，3對(duì)葉片，而C、D組植株高度均勻，最低也達(dá)到15 cm，5對(duì)葉片，且A、B組由于出芽率較低，每盆植株平均2株，3株的就有1株特別矮小，而C、D組每盆3株長勢(shì)均勻，說明菌液的添加對(duì)向日葵的生長有明顯促進(jìn)，對(duì)土壤毒性降低效果明顯。

30 d檢測(cè)各土壤的石油類含量，添加懸菌液與無機(jī)營養(yǎng)鹽的D樣品降解率最高，石油烴降解率達(dá)到了76.3%，土壤石油類含量由5621.6mg/kg下降至1332.3mg/kg，較單獨(dú)種植向日葵的A組土壤，降解率提高了59.1%;同時(shí)，未添加烴降解菌群的B組樣品石油烴降解率23.6%，而生物聯(lián)合修復(fù)的D組樣品，石油烴降解率提高到76.3%，提高了52.7%，說明石油烴降解菌在土壤修復(fù)中起到至關(guān)重要的作用;未添加無機(jī)營養(yǎng)鹽的C組樣品石油烴降解率57.5%，較添加營養(yǎng)鹽的D組樣品低了18.8%，說明添加適量的氮、磷營養(yǎng)鹽能使提高石油烴降解率。

4 結(jié)語

本研究將生物聯(lián)合修復(fù)石油烴污染土壤作為一個(gè)系統(tǒng)，針對(duì)河南油田原油、土壤的特性，在采油井生產(chǎn)場(chǎng)所取樣，富集、篩選高效土著石油烴降解菌群，與向日葵共同進(jìn)行就地生物聯(lián)合修復(fù)試驗(yàn)，30 d石油烴降解率達(dá)到了76.3%;生物聯(lián)合修復(fù)主要集中在亞表層土壤的生態(tài)優(yōu)化，將土壤、植物、微生物組成的復(fù)合體系看成一個(gè)完整的系統(tǒng)來共同降解污染物起到了事半功倍的效果，植物通過光合作用為微生物提供氧氣，使土著微生物對(duì)污染物質(zhì)進(jìn)行最大程度的生物降解，微生物與植物共存，植物為微生物提供了生存場(chǎng)所，并可轉(zhuǎn)移氧氣使根區(qū)的好氧作用能夠正常進(jìn)行;同時(shí)根系的分泌物、脫落物可為微生物提供大量營養(yǎng)，刺激根際各種菌群的生長繁殖，增強(qiáng)細(xì)菌的聯(lián)合降解作用;此外，植物根系可以伸展到不同層系的土壤中，故無需混合土壤即可使降解菌分散在土壤中;另一方面，微生物使污染物轉(zhuǎn)化成植物可以吸收利用的狀態(tài)，減輕了污染物對(duì)植物的毒性，提高了植物的耐受性，通過兩者的互利作用，彌補(bǔ)單一修復(fù)方式的不足，大大提高了石油烴降解效果，為黃棕壤石油烴污染治理提供了生物聯(lián)合就地修復(fù)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐，該修復(fù)技術(shù)耗能低，環(huán)境友好，是目前生物土壤環(huán)境治理技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。

致謝：本實(shí)驗(yàn)得以順利完成要衷心感謝中國石油化工股份有限公司河南油田分公司工程技術(shù)研究院微生物研究所與河南油田勘探局環(huán)境監(jiān)測(cè)站的技術(shù)人員，在儀器設(shè)備、技術(shù)指導(dǎo)、數(shù)據(jù)分析上提供了大力的支持，特此致謝。

參考文獻(xiàn)：

[1]金文標(biāo)，宋莉暉，董曉利，等，油污土壤微生物治理的影響因素[J].環(huán)境保護(hù)，1998 （10）：27～28.

[2]張杰，劉永生，孟玲，等，多環(huán)芳烴降解菌篩選及其降解特性[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào).2003，14 （10）：17 83～1786.

[3]白潔，崔愛玲，呂艷華.石油降解菌對(duì)石油烴的降解能力及影響因素研究[J].海洋湖沼通報(bào)，2007（3）：41～48.

[4]金樑，顧宗濂.石油污染土壤及地下水的生物修復(fù)進(jìn)展[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，1999（5）：130～135.

[5]李穎，賈麗娜，張鵬，高效生物修復(fù)菌株的篩選及其降解能力的研究[J].化工環(huán)保，2004，24（增刊）：15～17.