編譯 陳軼翔

在費(fèi)城賓夕法尼亞大學(xué)攻讀生物工程博士學(xué)位時(shí)，韋斯利·勒戈特（Wesley Legant）遇到了一個(gè)令人沮喪的障礙：他有自己的研究想法，但能夠?qū)⑾敕ǜ吨T實(shí)施的設(shè)備卻尚未出現(xiàn)。

由于對(duì)細(xì)胞力學(xué)和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)很感興趣，勒戈特開始研發(fā)工具來(lái)測(cè)量細(xì)胞對(duì)環(huán)境的作用力。他在一個(gè)哺乳動(dòng)物的增殖細(xì)胞周圍的物質(zhì)中嵌入了熒光微球，這樣一來(lái)，當(dāng)細(xì)胞移動(dòng)時(shí)，其周圍物質(zhì)就會(huì)變形，從而推動(dòng)熒光微球移動(dòng)。通過(guò)測(cè)量熒光微球的移動(dòng)距離，勒戈特就可以計(jì)算出細(xì)胞施加的作用力。然而，他很難獲得準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。

細(xì)胞依靠自身能量緩慢移動(dòng)——速度最快為每分鐘幾微米——因此，需要在很長(zhǎng)一段時(shí)間里用顯微鏡觀察這一細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。為了跟蹤記錄三維立體的熒光微珠，勒戈特必須使整個(gè)系統(tǒng)在高空間分辨率下成像。那是在2010年左右，當(dāng)時(shí)可用的商業(yè)顯微鏡——采用點(diǎn)掃描、渦流盤技術(shù)的共聚焦顯微鏡——無(wú)法完成上述工作。

比如有一個(gè)透明立方體。共聚焦顯微鏡可以讓科學(xué)家一個(gè)一個(gè)地捕捉到立方體中的每一個(gè)點(diǎn)，并逐漸形成一個(gè)三維影像。為此，共聚焦顯微鏡在樣本中垂直地投射一束光，但是每一束光都會(huì)產(chǎn)生破壞樣本的活性氧——也就是勒戈特所說(shuō)的“光毒性”效應(yīng)。與此同時(shí)，顯微鏡檢測(cè)到的發(fā)光“熒光團(tuán)”會(huì)隨著時(shí)間的推移而逐漸消失——一種叫做光漂白的過(guò)程。

在勒戈特的實(shí)驗(yàn)中，每一幅三維影像大約需要1分鐘的時(shí)間來(lái)獲取。然后他又要再等5分鐘——使細(xì)胞得以恢復(fù)，才能獲取下一幅影像，這樣才能在收集到所需數(shù)據(jù)之前使細(xì)胞避免由于光毒性而“逐漸消失”。勒戈特能夠測(cè)量細(xì)胞所產(chǎn)生的作用力，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)法達(dá)到他想要的詳細(xì)程度。

為解決上述問(wèn)題，勒戈特在其博士后研究中改變了研究方向。在弗吉尼亞州阿什伯恩市的霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所的珍妮莉婭法姆研究學(xué)院，勒戈特與物理學(xué)家兼顯微鏡專家埃里克·白茲格（Eric Betzig）一起工作，他還加入了一個(gè)規(guī)模雖小但正在不斷發(fā)展壯大的自己動(dòng)手制造（DIY）顯微鏡的社團(tuán)。

成像技術(shù)

制造顯微鏡是一項(xiàng)復(fù)雜而耗時(shí)的挑戰(zhàn)，它需要一個(gè)擁有恰當(dāng)技能組合的團(tuán)隊(duì)，來(lái)處理其中所涉及到的各種光束陣列、機(jī)械及計(jì)算機(jī)部件。

在珍妮莉婭法姆研究學(xué)院，研究人員突破了神經(jīng)科學(xué)和發(fā)育生物學(xué)的界限。這些領(lǐng)域很大程度上依賴于顯微鏡和成像技術(shù)，而該研究學(xué)院擁有大量現(xiàn)成的商用顯微鏡。但是當(dāng)這些顯微鏡無(wú)法滿足研究需求時(shí)，研究者并不是在等待著新型顯微鏡的發(fā)明——而是自己動(dòng)手去制造。

珍妮莉婭法姆研究學(xué)院的一位物理學(xué)家菲利普·科勒（Philipp Keller）表示：“在科技發(fā)展中我們的工作動(dòng)力是希望有一天能夠?qū)崿F(xiàn)現(xiàn)有顯微鏡無(wú)法進(jìn)行的新型實(shí)驗(yàn)。”

定制顯微鏡，如圖所示的等尺寸比例顯示光片照明顯微鏡，使研究人員能夠突破商業(yè)顯微鏡的限制

2005年左右，在德國(guó)海德堡的歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室工作時(shí)，科勒遇到了一個(gè)和勒戈特類似的問(wèn)題：他想要跟蹤一個(gè)發(fā)育中的斑馬魚胚胎的所有細(xì)胞，以了解它們是如何移動(dòng)、合并形成不同的組織和器官的。但是當(dāng)時(shí)使用的大多數(shù)顯微鏡，由于強(qiáng)烈的光照需要，都無(wú)法使這樣大小的一個(gè)樣本持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間成像——直徑大約700微米的一團(tuán)細(xì)胞。

于是，科勒轉(zhuǎn)向了光片照明顯微鏡，這是當(dāng)時(shí)剛開始使用的一種技術(shù)。光片照明顯微鏡不是照亮整個(gè)樣本，而是將弱聚焦、低強(qiáng)度的光片直接投射到用戶想要成像的物體的焦平面上。高品質(zhì)相機(jī)可以在一次曝光中捕捉到整個(gè)焦平面，通過(guò)在樣本中垂直移動(dòng)平面，研究人員可以重現(xiàn)整個(gè)三維影像的物體。

科勒說(shuō)：“光片照明顯微鏡是一種非常快速的成像技術(shù)，但同時(shí)也很溫和。那些離焦的結(jié)構(gòu)不會(huì)因暴露于光線中遭到破壞。”當(dāng)時(shí)，沒有現(xiàn)成的顯微鏡適用于科勒的研究，因此他在2005年決定自己制造一個(gè)。他設(shè)計(jì)的顯微鏡被稱為數(shù)字掃描激光光片熒光顯微鏡（DSLM），可以在90秒內(nèi)捕捉到一個(gè)正在發(fā)育的斑馬魚胚胎中的每一個(gè)細(xì)胞。

并不是所有自己動(dòng)手制造顯微鏡的人在開始設(shè)計(jì)時(shí)都有一個(gè)具體的研究問(wèn)題。對(duì)于德國(guó)哥廷根馬克斯·普朗克生物物理化學(xué)研究所的物理學(xué)家斯蒂芬·黑爾（Stefan Hell）來(lái)說(shuō)，提出關(guān)于顯微鏡技術(shù)的新概念本身就是一個(gè)目標(biāo)。他說(shuō)：“這是一項(xiàng)科學(xué)研究。我這樣做的目的是為了促進(jìn)顯微鏡技術(shù)的發(fā)展。”

他在這方面取得了巨大的成功。2014年，黑爾與加州斯坦福大學(xué)的威廉姆·莫爾納爾（William Moerner），以及白茲格共同獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)——他們發(fā)明了超高分辨率熒光顯微技術(shù)，使研究人員能夠在納米尺度上使生物結(jié)構(gòu)成像。

黑爾認(rèn)為，盡管自己構(gòu)建的一些顯微鏡設(shè)計(jì)已經(jīng)商業(yè)化了，但生物學(xué)家一般不需要效仿，因?yàn)橹圃焐虝?huì)十分迅速地將新的構(gòu)建想法投入生產(chǎn)。他自己的諾貝爾獎(jiǎng)獲獎(jiǎng)設(shè)計(jì)，被稱為“受激發(fā)射損耗”，或者STED，始建于1999年耗資20萬(wàn)美元?，F(xiàn)在，它已經(jīng)簡(jiǎn)化為一個(gè)按鈕操作系統(tǒng)，其大小是鞋盒的一半，可以附著在任何現(xiàn)有的共聚焦熒光顯微鏡上。黑爾表示，還有幾家公司也在制造光片照明顯微鏡。

研究人員可以將定制設(shè)計(jì)，比如OpenSPIM.org網(wǎng)站上的設(shè)計(jì)，應(yīng)用到不同的配置中

然而，科勒認(rèn)為，光片照明顯微鏡的技術(shù)領(lǐng)域仍然相對(duì)不成熟，而且少數(shù)幾個(gè)已經(jīng)商業(yè)化的系統(tǒng)要達(dá)到科學(xué)研究的前沿需求，還需要7到8年的時(shí)間。他說(shuō)：“實(shí)際上，我們是不得不自己動(dòng)手去建造所需的新型顯微鏡。”

這個(gè)過(guò)程必然是有利有弊的。定制系統(tǒng)在速度和分辨率方面是遙遙領(lǐng)先的，并且可以為特定的生物問(wèn)題或系統(tǒng)而定制。但這是以靈活性為代價(jià)的。在一些自己動(dòng)手制作的系統(tǒng)中，一些簡(jiǎn)單的事情做起來(lái)也并非易事。定制系統(tǒng)需要大量的時(shí)間和精力來(lái)構(gòu)建和維護(hù)。

馬里蘭州貝塞斯達(dá)市的美國(guó)國(guó)家心肺血液研究所的一名細(xì)胞生物學(xué)家，克萊爾·沃特曼（Clare Waterman）表示，對(duì)于那些愿意接受挑戰(zhàn)的人來(lái)說(shuō)，回報(bào)是值得的。在20世紀(jì)90年代初，沃特曼利用新攝像技術(shù)開發(fā)了一種名為熒光斑點(diǎn)成像的技術(shù)，該技術(shù)可以用于研究細(xì)胞骨架和其它大型的多蛋白質(zhì)復(fù)合體。

DIY顯微鏡指南

無(wú)論是為了促進(jìn)顯微技術(shù)發(fā)展還是為了解決一個(gè)特定的生物學(xué)問(wèn)題，構(gòu)建新型顯微鏡的過(guò)程基本上都是一樣的?？评赵谶@方面經(jīng)驗(yàn)豐富，他說(shuō)：“我們會(huì)長(zhǎng)期研究、構(gòu)建新型顯微鏡?！彼堰@個(gè)構(gòu)建過(guò)程簡(jiǎn)要地進(jìn)行了總結(jié)（見下文“DIY顯微鏡的十個(gè)步驟”）?？评毡硎荆粋€(gè)優(yōu)秀的顯微鏡構(gòu)建團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)該需要一個(gè)物理學(xué)家或生物醫(yī)學(xué)工程師來(lái)管理這個(gè)項(xiàng)目，同時(shí)需要至少4位專業(yè)人士的支持：一位光學(xué)工程師進(jìn)行光路設(shè)計(jì)；一位機(jī)械工程師研究如何將零部件組裝在一起；一位軟件開發(fā)者對(duì)機(jī)器進(jìn)行編程；一位計(jì)算機(jī)工程師將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成可用影像。

DIY顯微鏡的十個(gè)步驟

建造顯微鏡是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，不過(guò)，菲利普·科勒將這一過(guò)程精煉為十個(gè)步驟：

1 集思廣益，對(duì)要設(shè)計(jì)的新型顯微鏡進(jìn)行研究討論

2 計(jì)劃并檢測(cè)光路設(shè)計(jì)

3 利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)軟件來(lái)設(shè)計(jì)主體和定制的部件

4 訂購(gòu)零件，制造定制的機(jī)械和光學(xué)部件

5 借用組件來(lái)檢測(cè)它們的性能和集成度

6 組裝一個(gè)原型

7 編寫顯微鏡控制軟件

8 根據(jù)性能改進(jìn)定制部件

9 進(jìn)行原理論證實(shí)驗(yàn)

10 研發(fā)并改進(jìn)圖像處理軟件

第一步是光路設(shè)計(jì)。利用專業(yè)軟件——科勒和勒戈特使用的是華盛頓柯克蘭的Zemax公司提供的軟件“視覺工作室”——光學(xué)工程師在虛擬空間中工作，確定激光器、透鏡、反光鏡和其他光學(xué)元件的正確排列，以達(dá)到所需的分辨率，并滿足相應(yīng)的特性。

然后，機(jī)械工程師需要研究所有這些部件在現(xiàn)實(shí)世界中應(yīng)如何組裝在一起，就像將物理部件固定在一個(gè)光學(xué)臺(tái)上一樣。在珍妮莉婭法姆研究學(xué)院和科勒一起工作的布賴恩·庫(kù)柏（Brian Coop）說(shuō)：“此時(shí)，它只是排成一行的一束透鏡，還漂浮在空中。我的任務(wù)就是要讓它獨(dú)自站立起來(lái)?！?/p>

庫(kù)柏認(rèn)為，這一階段最大的挑戰(zhàn)是要在極其嚴(yán)格的物理約束條件下工作。當(dāng)顯微鏡必須聚焦于只有幾微米甚至是幾納米大小的物體時(shí)，幾乎不容有任何差錯(cuò)。透鏡、反光鏡和激光器需要精確定位，才能產(chǎn)生有用的、焦距內(nèi)的圖像，而庫(kù)柏需要考慮到，諸如金屬熱膨脹等微小的變化，可能會(huì)使它們發(fā)生偏離。庫(kù)柏說(shuō)：“注意光學(xué)校準(zhǔn)的精度會(huì)使得一切后續(xù)工作都變得簡(jiǎn)單?！?/p>

庫(kù)柏盡可能用現(xiàn)成的零部件來(lái)制造顯微鏡。但每臺(tái)顯微鏡都需要一些定制的部件，因此庫(kù)柏必須自己設(shè)計(jì)，有時(shí)會(huì)在珍妮莉婭法姆研究學(xué)院的機(jī)械車間里自己制造。

一旦光學(xué)工程師和機(jī)械工程師組裝了一個(gè)原型之后，軟件開發(fā)者和計(jì)算機(jī)工程師就會(huì)投入工作，以確保各部件能夠協(xié)調(diào)、正常運(yùn)作并產(chǎn)生有用的圖像。珍妮莉婭法姆研究學(xué)院的一名計(jì)算機(jī)程序員丹尼爾·米爾琪（Daniel Milkie）表示，許多顯微鏡構(gòu)造者使用一個(gè)叫做LabVIEW的商業(yè)程序包來(lái)控制他們的顯微鏡，但是當(dāng)機(jī)器變得更高級(jí)時(shí)，有時(shí)需要一個(gè)定制的解決方案。

米爾琪說(shuō)：“我們正在設(shè)計(jì)新的工具和新型顯微鏡來(lái)提高硬件可達(dá)到的極限，所以需要設(shè)計(jì)專門的軟件以達(dá)到最佳性能?！标P(guān)鍵是要確保軟件足夠靈活，能夠快速調(diào)整以滿足新的需求，比如數(shù)量更多的探測(cè)器。因此，米爾琪使代碼模塊化，這意味著不必從頭開始就可以很容易集成新的元件。

但是，米爾琪說(shuō)，軟件方面最大的挑戰(zhàn)是如何處理顯微鏡產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)。高速攝像機(jī)每秒能產(chǎn)生十億字節(jié)的數(shù)據(jù)，而一些顯微鏡可能有幾個(gè)攝像頭在同時(shí)運(yùn)行。米爾琪表示，僅白茲格實(shí)驗(yàn)室每年就可以產(chǎn)生50 ～100兆兆字節(jié)的數(shù)據(jù)。他說(shuō)：“我們已經(jīng)創(chuàng)建了這個(gè)數(shù)據(jù)流，那么它將流向哪里呢?”

成品看起來(lái)和傳統(tǒng)的顯微鏡沒什么不同。所有的部件——反光鏡、透鏡、激光器、攝像頭和樣品腔——都被連接到一個(gè)重達(dá)幾噸的桌子上的各種柱子和夾子上，并經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)以使顯微鏡免受震動(dòng)。勒戈特表示，這就像一套精心設(shè)計(jì)的樂高玩具。

科勒估計(jì)，從零開始制造一臺(tái)顯微鏡至少需要一年的時(shí)間，但如果團(tuán)隊(duì)能夠從早期的設(shè)備中回收零部件和軟件，就可以減少所需時(shí)間。而且由于定制需要越來(lái)越高級(jí)，使得研發(fā)所需的費(fèi)用變得越來(lái)越多。科勒于2005年設(shè)計(jì)的數(shù)字掃描激光光片熒光顯微鏡（DSLM）花費(fèi)了大約5萬(wàn)美元，而后來(lái)設(shè)計(jì)的顯微鏡花費(fèi)則高達(dá)10萬(wàn)～ 20萬(wàn)美元。他于2015年設(shè)計(jì)的最新版本——各向同性多視圖顯微鏡——花費(fèi)在100萬(wàn)美元以上。科勒說(shuō)：“我認(rèn)為，如今一個(gè)只花費(fèi)5萬(wàn)美元就設(shè)計(jì)制造出來(lái)的顯微鏡不能說(shuō)是對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的改進(jìn)?！?/p>

關(guān)于定制的問(wèn)題

定制顯微鏡也需要使用更多的技巧，因?yàn)槊總€(gè)實(shí)驗(yàn)通常都需要進(jìn)行大量的設(shè)置和校準(zhǔn)——用戶親自動(dòng)手的那種調(diào)整——商業(yè)制造商通常不會(huì)這么做的。但沃特曼認(rèn)為，這不應(yīng)該是一個(gè)障礙。她說(shuō)：“這是顯微鏡基礎(chǔ)課程中應(yīng)該學(xué)的基本技能?！?/p>

涉及新型顯微鏡系統(tǒng)的已發(fā)表研究中通常包括設(shè)計(jì)方案和零部件清單。對(duì)于那些想要了解相關(guān)技能的人，可以從網(wǎng)絡(luò)上獲取珍妮莉婭法姆研究學(xué)院有關(guān)顯微鏡的設(shè)計(jì)方案和軟件，該學(xué)院還為顯微鏡的構(gòu)建過(guò)程提供幫助。勒戈特說(shuō)：“有大約20個(gè)小時(shí)的視頻教程講解如何組裝并調(diào)準(zhǔn)所有的零部件?！贝送?，還有其它可以獲得專業(yè)技能的渠道。例如，馬里蘭州貝塞斯達(dá)的美國(guó)國(guó)家生物醫(yī)學(xué)成像和生物工程研究所的高分辨率光學(xué)成像部的一位生物物理學(xué)家哈里·什羅夫（Hari Shroff）開創(chuàng)的diSPIM.org網(wǎng)站；德國(guó)德勒斯登的馬克斯·普朗克分子細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)研究所的帕維爾托曼卡克發(fā)育生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)立的OpenSPIM.org網(wǎng)站；西班牙巴塞羅那市光子科學(xué)研究所的埃米利奧·瓜爾達(dá)（Emilio Gualda）負(fù)責(zé)的OpenSpinMicroscopy網(wǎng)站等。這些網(wǎng)站都免費(fèi)提供各種光片照明顯微鏡的配置指導(dǎo)。

但是，盡管按照現(xiàn)有的計(jì)劃去構(gòu)建一個(gè)顯微鏡比從頭開始設(shè)計(jì)一個(gè)要簡(jiǎn)單得多，但仍然需要光學(xué)、機(jī)械學(xué)、電子學(xué)、計(jì)算機(jī)編程和生物學(xué)方面的知識(shí)。瓜爾達(dá)說(shuō)，最大的優(yōu)勢(shì)是價(jià)格。由OpenSpinMicroscopy網(wǎng)站提供的選擇性平面照明顯微鏡的商業(yè)版售價(jià)約為20萬(wàn)美元。據(jù)瓜爾達(dá)估計(jì)，使用他的開源軟件和像Arduino控制器這樣的經(jīng)濟(jì)型硬件，研究人員可以制造出一種高級(jí)顯微鏡，而費(fèi)用只需要大約5萬(wàn)美金，其中大部分花費(fèi)在激光器和攝像頭上。瓜爾達(dá)補(bǔ)充道：“你可以根據(jù)自己的具體需要去定制顯微鏡?！?/p>

用戶還可以從一些線論壇上得到建議和技巧。馬薩諸塞州波士頓的哈佛醫(yī)學(xué)院的一位分子生物學(xué)家，蘇里古庫(kù)·烏帕迪亞尤拉（Srigokul Upadhyayula）曾于2014年在珍妮莉婭法姆研究學(xué)院與勒戈特一起構(gòu)建了首臺(tái)晶格層光顯微鏡，他認(rèn)為，這種合作表示這些科學(xué)家的工作方式發(fā)生了巨大變化。他說(shuō)：“這樣的合作在該領(lǐng)域是很少見的，因?yàn)樵谶^(guò)去每個(gè)人都曾是孤立的?！?/p>

勒戈特目前正準(zhǔn)備在北卡羅來(lái)納大學(xué)教堂山分校建立自己的實(shí)驗(yàn)室。這將使他能夠繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)和顯微鏡設(shè)計(jì)方面的工作。他的首批項(xiàng)目之一將是重新探討細(xì)胞如何移動(dòng)的問(wèn)題。他說(shuō)：“我們已經(jīng)用自己的最新系統(tǒng)解決了技術(shù)問(wèn)題——只是還沒有機(jī)會(huì)把它應(yīng)用到那個(gè)特定的問(wèn)題上?！爆F(xiàn)在，勒戈特已經(jīng)設(shè)計(jì)出了做這項(xiàng)工作所需的工具，或許最終會(huì)得到他多年來(lái)一直在追尋的答案。