陳 穎, 郝錦霞, 趙 晶, 李登喆, 張 梅

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 血液內(nèi)科, 陜西 西安, 710000)

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種以漿細(xì)胞惡性增殖為特征的血液系統(tǒng)惡性腫瘤疾病[1]。MM多發(fā)于中老年人，由于MM患者體內(nèi)正常漿細(xì)胞功能受限、正常免疫球蛋白數(shù)量減少，易受到細(xì)菌、病毒等微生物感染，并伴隨出血、貧血、骨痛、神經(jīng)癥狀、腎功能不全、淀粉樣變、高鈣血癥等臨床癥狀[2-4]。Toll樣受體(TLR)在先天免疫過程中起到重要作用，大多表達(dá)于巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞表面，有研究[5-6]報道B淋巴細(xì)胞上也存在TLR，并可調(diào)控B淋巴細(xì)胞增殖、分化和抗凋亡。目前關(guān)于MM患者骨髓單個核細(xì)胞(BMMCs)中Toll樣受體表達(dá)研究較少，本研究分析其在BMMCs中表達(dá)水平以及臨床意義，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年4月—2017年4月本院收治的MM患者30例作為觀察組，其中男21例，女9例，年齡42～76歲，平均年齡(56.28±8.33)歲; 國際分期系統(tǒng)(ISS)分期: Ⅰ期7例, Ⅱ期9例, Ⅲ期14例?；颊呔鶠镮gG型MM, 骨髓漿細(xì)胞大于5%, 血清IgG水平高于正常值。另選取同一時期門診骨髓報告為增生性貧血患者10例作為對照組，其中男7例，女3例，年齡40～72歲，平均(54.12±8.15)歲。所有受試者均自愿簽署知情同意書，本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)同意。MM患者采用硼替佐米聯(lián)合地塞米松(PD)方案化療[7]。

1.2 主要試劑與儀器

Ficoll 分離液購自杭州百通生物技術(shù)有限公司; TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司; 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司; 熒光定量PCR試劑盒購自上海信帆生物科技有限公司。ABI Prism?7900HT熒光定量PCR儀購自于美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.3 收集樣本

觀察組于化療前和完成2周期PD方案化療后(復(fù)查骨髓穿刺漿細(xì)胞數(shù)小于5%), 采集骨髓液1 mL, 采用EDTA-K2 抗凝處理，對照組采集骨髓液1 mL, 采用EDTA-K2 抗凝處理，均用于BMMCs的分離，分離需在6 h內(nèi)完成。

1.4 骨髓單個核細(xì)胞分離

將EDTA-K2抗凝骨髓液1 mL與3 mL PBS混合均勻, 1 000 r/min離心5 min, 去除脂肪組織后，加入等體積PBS混合均勻，然后轉(zhuǎn)至10 mL無菌離心管，將Ficoll 分離液5 mL加入其中, 2 000 r/min離心20 min, 吸取中間白膜層，用10倍體積PBS稀釋, 500 r/min離心10 min，PBS洗滌3次后，加入TRlzol 1 mL, 轉(zhuǎn)至1.5 mL離心管低溫保存。

1.5 實(shí)時熒光定量檢測

細(xì)胞總RNA采用TRLzol法提取，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作步驟將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 經(jīng)適當(dāng)比例稀釋后，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增, GAPDH為內(nèi)參。反應(yīng)條件為: 95 ℃ 10 min, 95 ℃ 15 s, 55 ℃ 1 min, 72 ℃ 10 s, 重復(fù)38個循環(huán)。TLR相對表達(dá)量以TLR與GAPDH表達(dá)量比值表示。每個樣本設(shè)置3個重復(fù)孔，取平均值。引物由上海生工合成，序列如下: TLR-1上游引物5′-TTCACAGTGTCTGGTACACGCAT-3′, 下游引物5′-ACCGTGTCTGTTAAGAGATTATTGGA-3′; TLR-2上游引物5′-GCCTCTCCAAGGAAGAATCC-3′, 下游引物5′-TCCTGTTGTTGGACAGGTCA-3′; TLR-4上游引物5′-AATCTAGAGCACTTGGACCTTTCC-3′, 下游引物5′-GGGTTCAGGGACAGGTCTAAAGA-3′; TLR-9上游引物5′-GGACCTCTGGTACTGCTTCCA-3′, 下游引物5′-AAGCTCGTTGTACACCCAGTCT-3′; TLR-10上游引物5'-AAGAAAGGTTCCCGCAGACTT-3, 下游引物5′-TGTTATGGCATAGAATCAAAACTCTCA-3′; GAPDH上游引物5′-AGAAGGCTGGGCTCATTTG-3′, 下游引物5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用t檢驗(yàn)，采用Pearson相關(guān)性分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

熒光定量PCR后，觀察組TLR-4和TLR-9相對表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05), 見表1。隨著ISS分期升高, TLR-4和TLR-9表達(dá)量升高，且組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見表2。IgG(M蛋白)和β2-MG是目前公認(rèn)可反映MM患者疾病嚴(yán)重程度的臨床指標(biāo)，經(jīng)相關(guān)性分析顯示, TLR-4和TLR-9表達(dá)量與IgG和β2-MG呈正相關(guān)，見表3。MM患者接受治療后, BMMCs中TLR-4和TLR-9表達(dá)量顯著下降(P<0.05), 見表4。

表1 TLR在2組受試者BMMCs中的表達(dá)

與對照組比較, *P<0.05。

表2 不同分期MM患者BMMCs中TLR-4和TLR-9表達(dá)量比較

與Ⅰ期和Ⅲ期比較, *P<0.05。

表3 BMMCs中TLR-4和TLR-9表達(dá)量與MM臨床指標(biāo)關(guān)系

表4 治療前后MM患者BMMCs中TLR-4和TLR-9表達(dá)量變化

與治療后比較，*P<0.05。

3 討 論

TLR是人體免疫系統(tǒng)中研究相對深入的受體家族之一, TLR通過識別病原相關(guān)分子模式(PAMPs), 介導(dǎo)天然或獲得性免疫應(yīng)答反應(yīng)[8-10]。有研究[11]指出，腫瘤細(xì)胞表面TLR活化會促進(jìn)腫生長。在抑制性細(xì)胞因子、蛋白水解酶、炎性細(xì)胞因子、氧化亞氮等小分子的輔助作用下，腫瘤細(xì)胞可實(shí)現(xiàn)免疫逃避。腫瘤細(xì)胞在LPS(TLR4的配體)刺激后產(chǎn)生前炎性因子，使腫瘤細(xì)胞逃避細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和自然殺傷細(xì)胞(NK)攻擊[12-13]。當(dāng)采用TLR4抑制劑或TLR4 siRNA阻斷TLR4信號傳導(dǎo)通路時，腫瘤細(xì)胞生長變緩慢，患病小鼠生存期延長[14]。所以，腫瘤細(xì)胞表面TLR的表達(dá)與腫瘤發(fā)展有一定聯(lián)系。

MM屬于B淋巴細(xì)胞淋巴瘤范疇，是漿細(xì)胞的癌變[15]。Bohnhorst J等[16]研究指出，人正常漿細(xì)胞很少表達(dá)TLR, 其中表達(dá)較多的是TLR-1, 而在MM細(xì)胞系上，幾乎所有TLR均有表達(dá)，且TLR相應(yīng)配體具有促進(jìn)MM細(xì)胞增殖作用。Jego G等[17]研究指出, TLR廣泛表達(dá)于MM細(xì)胞系和原代MM細(xì)胞，在TLR-7、TLR-9配體作用下，MM細(xì)胞增殖較快，且可成功逃避凋亡誘導(dǎo)。本研究采用熒光定量PCR方法檢測MM患者和健康者BMMCs中TLR1-10相對表達(dá)量，由于TLR-3、TLR-5、TLR-6、TLR-7、TLR-8、TLR-10相對表達(dá)量較低，未納入結(jié)果統(tǒng)計中，MM患者其他TLR表達(dá)量均高于健康者，在TLR-4和TLR-9表達(dá)量方面，差異有統(tǒng)計學(xué)意義, TLR在MM患者BMMCs中表達(dá)上調(diào)可能與患者骨髓中存在大量原始或成熟漿細(xì)胞有關(guān)，與徐揚(yáng)[18]研究報道一致。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), TLR-4和TLR-9表達(dá)水平隨著ISS分期增加而升高，提示MM患者BMMCs中TLR-4和TLR-9表達(dá)水平與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)。由于ISS分期可在一定程度上預(yù)估患者生存期[19-24], 所以推測TLR-4和TLR-9表達(dá)水平可能也與生存期有關(guān)。M蛋白是漿細(xì)胞或B淋巴細(xì)胞惡性增殖分泌的功能異常免疫球蛋白, β2-MG是由白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等有核細(xì)胞產(chǎn)生的小分子球蛋白，表達(dá)于細(xì)胞表面，與淋巴細(xì)胞識別有關(guān)。二者均是反映MM腫瘤負(fù)荷和惡性程度的重要指標(biāo)[25-30]。本研究相關(guān)性分析顯示, TLR-4和TLR-9表達(dá)水平與M蛋白和β2-MG呈正相關(guān)，推測TLR-4和TLR-9參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。

地塞米松為人工合成皮質(zhì)類固醇，具有抗內(nèi)毒素、抗炎、抗休克等多種作用[31-32]。硼替佐米是一種可逆性蛋白酶體抑制劑，可選擇性結(jié)合蛋白酶體活性位點(diǎn)，阻止NF-κB抑制因子I-B的降解，有效抑制NF-κB活性，從而降低細(xì)胞增殖、黏附相關(guān)因子表達(dá)，誘發(fā)MM細(xì)胞凋亡[33]。本研究MM患者經(jīng)治療后, TLR-4和TLR-9表達(dá)水平顯著下調(diào)，提示硼替佐米聯(lián)合地塞米松通過抑制TLR-4和TLR-9達(dá)到抗腫瘤目的。

綜上所述, TLR-4和TLR-9在MM患者BMMCs中表達(dá)上調(diào)，并且與MM分期、M蛋白以及β2-MG相關(guān)，參與MM的發(fā)生發(fā)展, TLR或可作為MM疾病評估預(yù)后的關(guān)鍵指標(biāo)以及新的治療靶點(diǎn)。

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