周 梅，曹曉涵，賀小云，孫 慶，狄 冉，胡文萍，王翔宇，張效生，張金龍, 劉秋月*，儲明星*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193;2.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381)

綿羊的產(chǎn)羔數(shù)性狀是由微效多基因控制的，且遺傳力很低，這極大地制約了養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。我國除小尾寒羊和湖羊等少數(shù)綿羊品種產(chǎn)多羔以外，其余絕大部分綿羊品種均產(chǎn)單羔。因此，對影響綿羊產(chǎn)羔數(shù)性狀相關(guān)基因進行研究對于提高綿羊繁殖效率、加快綿羊育種進程、提高綿羊產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益均非常重要。

叉頭框轉(zhuǎn)錄因子(forkhead box L2，F(xiàn)OXL2)是叉頭框核轉(zhuǎn)錄因子3基因家族成員之一，在哺乳動物卵巢生長和成熟過程中發(fā)揮非常關(guān)鍵的作用[1-2]。FOXL2基因在進化上高度保守，它與類固醇激素合成因子(steroidogenic factor-1，SF-1)相互作用對于雌性動物的卵泡發(fā)育非常重要[3]。卵泡特定的神經(jīng)蛋白轉(zhuǎn)錄因子(folliculargenesis specific BHLH transcription factor，F(xiàn)IGLA)基因編碼的是一種螺旋-環(huán)-螺旋型的堿性轉(zhuǎn)錄因子，它是一種在生殖細胞中特異性表達的轉(zhuǎn)錄因子，能夠參與卵泡生成和性腺分化等過程[4-5]。FIGLA基因在雌性生殖細胞中的表達要遠遠高于雄性生殖細胞，并且能夠在卵子發(fā)生過程中上調(diào)雌性特異性相關(guān)基因的表達，同時下調(diào)雄性特異性相關(guān)基因的表達[6]。

研究表明，F(xiàn)OXL2和FIGLA基因均在哺乳動物下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamic-pituitary-gonadal axis，HPG)表達量較高，而HPG是控制哺乳動物性激素分泌的最重要的系統(tǒng)，下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)對促卵泡素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)和促黃體素(luteinizing hormone，LH)等重要生殖激素的分泌有著非常關(guān)鍵的調(diào)控作用[7]，因此，推測FOXL2和FIGLA基因可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)生殖激素的分泌，進而影響卵泡發(fā)育和卵子發(fā)生，最終對排卵活動產(chǎn)生影響。綿羊的產(chǎn)羔數(shù)直接受到排卵數(shù)的影響，因此猜測FOXL2和FIGLA基因可能與綿羊產(chǎn)羔數(shù)性狀有關(guān)。本研究對FOXL2和FIGLA基因在多羔和單羔小尾寒羊8個組織間的表達水平進行研究，以揭示其影響綿羊產(chǎn)羔數(shù)的機制，為綿羊分子育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和主要試劑

單、多羔小尾寒羊均來自天津市畜牧獸醫(yī)研究所種羊場。從每個群體分別挑選2～3歲健康狀況良好且處于非繁殖狀態(tài)的成年母羊各3只。在同期發(fā)情后第7天對挑選的綿羊進行屠宰，采集大腦、小腦、下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管、子宮體和子宮角8種組織，盡快將采集的新鮮組織裝入2 mL的RNase-Free凍存管中，并立即置于液氮中保存，帶回實驗室后全部轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

RNA提取試劑盒購于天根生化科技有限公司(北京)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit)和熒光定量染料(SYBR○RPremix Ex TaqTMⅡ)均購于TaKaRa公司(大連)；Taq PCR Master Mix購于拓英坊科技有限公司(北京)。

1.2 組織總RNA的提取和檢測

采用動物組織總RNA提取試劑盒(天根，北京)加Trizol(Invitrogen, 美國)提取各組織總RNA，并用Nanodrop2000檢測RNA的濃度和OD值；利用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank提供的綿羊FOXL2和FIGLA基因mRNA序列(登錄號分別為：NM_023067.3, NM_001004311.3)，利用Primer 3軟件進行跨外顯子引物設(shè)計，以β-actin(NM_001009784)作為內(nèi)參基因。引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。引物名稱和序列、退火溫度以及擴增片段大小見表1。

表1 綿羊FOXL2和FIGLA基因的引物信息Table 1 Primer information of FOXL2 and FIGLA genes in sheep

1.4 cDNA合成

利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系總體積為20 μL：PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 1.0 μL，Oligo dT Primer 1.0 μL，Random 6 mers 1.0 μL，5×PrimeScript Buffer (for Real Time) 4.0 μL，RNA 1.0 μL，再用RNase-Free ddH2O將總體積補至20 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，獲得cDNA第一鏈。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行5倍稀釋，用于檢測目的基因的表達。

1.5 PCR反應(yīng)

PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系總體積為20 μL：Taq PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 模板1.0 μL，ddH2O 8.0 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物大小。

1.6 實時熒光定量PCR

1.6.1 實時熒光定量PCR體系和程序 反應(yīng)體系總體積為20 μL：SYBR Premix Ex TaqⅡ 10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 模板2.0 μL，ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 s，95 ℃變性5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后對熔解曲線進行分析。

1.6.2 標(biāo)準曲線的建立 將cDNA樣本5倍稀釋后，進行2倍梯度稀釋獲得5個濃度梯度(1、1/2、1/4、1/8、1/16)的cDNA樣品。用這些cDNA作為模板對目的基因和持家基因進行熒光定量PCR，以濃度梯度的對數(shù)值(10為底數(shù))為橫坐標(biāo)，以檢測所得Ct值為縱坐標(biāo)，繪制目的基因和持家基因標(biāo)準曲線。

1.6.3 實時熒光定量檢測與數(shù)據(jù)分析 熒光定量檢測利用Roche Light Cycler○R480Ⅱ型熒光定量PCR儀進行，以β-actin為內(nèi)參基因，每個樣品設(shè)3個重復(fù)。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量，用SPSS20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，用一般線性模型及最小顯著差異(least significant difference, LSD)法進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取與cDNA合成

利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳對RNA完整性進行檢測，試驗結(jié)果表明，提取的RNA均無明顯降解(圖1)，能夠滿足后續(xù)試驗要求，以反轉(zhuǎn)錄之后的cDNA為模板對FOXL2、FIGLA和β-actin進行PCR擴增，設(shè)計的FOXL2、FIGLA和β-actin三對引物擴增效果良好(圖2)，目的片段與預(yù)期的97 bp、131 bp和97 bp一致，且條帶單一，可以用于后續(xù)的熒光定量試驗。

圖1 8個組織RNA電泳檢測
M. DL2000 DNA Marker；1.大腦；2.小腦；3.下丘腦；4.垂體；
5.卵巢；6.輸卵管；7.子宮體；8.子宮角
Fig.1 Electrophoresis of the RNA from eight tissues
M. DL2000 DNA Marker；1. brain；2. cerebellum；3. hypothalamus；
4. pituitary；5. ovary；6. oviduct；7. uterus body；8. uterine horn

圖2 FOXL2、FIGLA和β-actin在8個組織中的PCR產(chǎn)物電泳檢測
M.DL2000 DNA Marker；1.大腦；2.小腦；3.下丘腦；4.垂體；
5.卵巢；6.輸卵管；7.子宮體；8.子宮角
Fig.2 Electrophoresis of the PCR products of FOXL2、FIGLA
and β-actin in eight tissues M.DL2000 DNA Marker;1. cerebrum;2. cerebellum;3. hypothalamus;4. pituitary;5. ovary;6. oviduct;7. uterus body ;8. uterine horn

2.2 FOXL2和FIGLA基因在單、多羔小尾寒羊繁殖相關(guān)組織中的表達

運用熒光定量PCR對多羔和單羔小尾寒羊8個繁殖相關(guān)組織FOXL2和FIGLA基因的表達進行了研究，結(jié)果見表2。由表2可見，F(xiàn)OXL2基因和FIGLA基因在單、多羔小尾寒羊8個組織中均能表達，其中，F(xiàn)OXL2基因在多羔小尾寒羊各組織中表達量由高到低是卵巢、垂體、子宮體、輸卵管、子宮角、下丘腦、小腦以及大腦；而在單羔小尾寒羊各組織中表達量由高到低是卵巢、垂體、下丘腦、子宮角、子宮體、輸卵管、小腦以及大腦；且FOXL2基因在多羔小尾寒羊小腦和子宮體中的表達量顯著高于單羔組(P<0.05)，但在多羔小尾寒羊垂體和卵巢中的表達量顯著低于單羔組(P<0.05)，在多羔小尾寒羊下丘腦中的表達量極顯著低于單羔組(P<0.01)，在其它各組織間的表達差異不顯著(P>0.05)。FIGLA基因在多羔小尾寒羊各組織中表達量由高到低是卵巢、下丘腦、輸卵管、垂體、子宮體、大腦、子宮角以及小腦；而在單羔小尾寒羊各組織中表達量由高到低是卵巢、垂體、輸卵管、下丘腦、子宮體、小腦、子宮角以及大腦；在多羔小尾寒羊大腦中的表達量顯著高于單羔組(P<0.05)，在其它各組織間表達差異均不顯著(P>0.05)。

表2 FOXL2和FIGLA基因在多羔和單羔小尾寒羊各組織中的表達Table 2 Expression of FOXL2 and FIGLA gene in each tissue between multiparous and uniparous Small Tail Han Sheep

注：同組不同肩標(biāo)小寫字母之間表示差異顯著(P<0.05)，同組不同肩標(biāo)大寫字母之間表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:Values with different small letter superscripts in the same group mean significant difference(P<0.05), different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01).

3 討 論

本研究通過提取非繁殖狀態(tài)的多羔和單羔小尾寒羊繁殖相關(guān)組織RNA，并用RT-PCR技術(shù)檢測了FOXL2和FIGLA基因在大腦、小腦、下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管、子宮體以及子宮角8個組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)無論單羔還是多羔小尾寒羊，F(xiàn)OXL2和FIGLA mRNA均在卵巢中表達量最高，在下丘腦、垂體、輸卵管、子宮體和子宮角中呈中等豐度表達，在大腦和小腦中表達量相對較低。也就是說，F(xiàn)OXL2和FIGLA基因均在HPG各組織中表達量較高，這與Leung等[8]曾報道的FOXL2基因在HPG中表達量較高是吻合的，而HPG是控制哺乳動物性激素分泌的最重要的系統(tǒng)[9]，其中下丘腦和垂體是哺乳動物生殖內(nèi)分泌活動的控制中心，卵巢是雌性動物最重要的生殖器官，是卵子生成及多種生殖激素(如雌激素、孕激素)等分泌的場所，對雌性動物的生殖能力有決定性的影響。而FOXL2和FIGLA基因均在HPG軸高表達，這表明二者很有可能在綿羊生殖活動中發(fā)揮重要作用。

研究表明，無論垂體、卵巢還是子宮組織FOXL2基因功能的缺失均會導(dǎo)致雌性小鼠喪失生殖能力[10]。FOXL2基因?qū)τ诼殉补δ艿牡木S持非常重要，能夠激活雌激素信號通路，對顆粒細胞的增殖和分化尤其重要[8，11]。然而，過表達FOXL2基因會對正常大鼠顆粒細胞產(chǎn)生促凋亡作用，同時還能通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β,TGFβ)信號通路中活化素和卵泡抑制素的表達實現(xiàn)抑制顆粒細胞增殖的作用[8，12]。FIGLA基因?qū)τ诼雅菪纬珊苤匾?，并且能夠激活小鼠卵子發(fā)生過程中卵母細胞相關(guān)基因的表達[13]。另外，F(xiàn)IGLA基因還具有雙重作用，F(xiàn)IGLA基因敲除雌性小鼠的卵巢中因無法形成原始卵泡而使其喪失生殖能力，而雄性FIGLA基因敲除小鼠的表型則不會有明顯變化[6]。

本研究發(fā)現(xiàn)FOXL2基因在多羔小尾寒羊小腦和子宮體中的表達量顯著高于單羔組(P<0.05)，但在多羔小尾寒羊垂體和卵巢中的表達量顯著低于單羔組(P<0.05)，在多羔小尾寒羊下丘腦中的表達量極顯著低于單羔組(P<0.01)，推測FOXL2基因可能在產(chǎn)羔數(shù)性狀中起到一定的調(diào)控作用。FOXL2基因可能通過上調(diào)其在單羔小尾寒羊中的表達量從而抑制卵泡發(fā)育或卵子發(fā)生過程中相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進而對綿羊的產(chǎn)羔數(shù)產(chǎn)生影響。FIGLA基因僅在多羔小尾寒羊大腦中的表達量顯著高于單羔組(P<0.05)，在其它各組織間表達差異均不顯著(P>0.05)，但其在單、多羔小尾寒羊HPG中表達量整體較高，表明該基因在動物生殖活動中扮演重要角色，但其本身功能與產(chǎn)羔數(shù)無關(guān)，可能通過調(diào)控其他基因的表達或相關(guān)激素的分泌而對綿羊的產(chǎn)羔數(shù)產(chǎn)生影響，這還有待于進一步研究。

[1] QIN Ning, FAN Xiancong, XU Xiaoxing, et al. Cooperative effects ofFOXL2 with the members of TGF-β superfamily on FSH receptor mRNA expression and granulosa cell proliferation from hen prehierarchical follicles[J]. PLoS ONE, 2015, 10(10): e0141062.

[2] BELLESSORT B, BACHELOT A, HEUDE é, et al. Role ofFOXL2 in uterine maturation and function[J]. Human Molecular Genetics, 2015, 24(11): 3 092-3 103.

[3] JIN Hanyong, WON M, PARK S E, et al.FOXL2 is an essential activator of SF-1-Induced transcriptional regulation of Anti-Müllerian hormone in human granulosa cells[J]. PLoS ONE, 2016, 11(7): e0159112.

[4] QIU Yongxiu, SUN Shaohua, CHARKRABORTY T, et al. Figla favors ovarian differentiation by antagonizing spermatogenesis in a teleosts, Nile tilapia (oreochromis niloticus)[J]. PLoS ONE, 2015, 10(4): e0123900.

[5]KLEPPE L, EDVARDSEN R B, FURMANEK T, et al. bmp15l, figla, smc1bl, and larp6l are preferentially expressed in germ cells in Atlantic salmon (salmo salar L.)[J]. Molecular Reproduction and Development, 2017, 84(1): 76-87.

[6]LIN R S, JIMENEZ-MOVILLA M, DEAN J. Figla-Cre transgenic mice expressing myristoylated EGFP in germ cells provide a model for investigating perinatal oocyte dynamics[J]. PLoS ONE, 2014, 9(1): e84477.

[7]HERNDON M K, NILSON J H. Maximal expression ofFOXL2 in pituitary gonadotropes requires ovarian hormones[J]. PLoS ONE, 2015, 10(5): e0126527.

[8] LEUNG D T, FULLER P J, CHU S. Impact ofFOXL2 mutations on signaling in ovarian granulosa cell tumors[J]. International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 2016, 72: 51-54.

[10] PANNETIER M, CHASSOT A A, CHABOISSIER M C, et al. Involvement ofFOXL2 and RSPO1 in ovarian determination, development, and maintenance in mammals[J]. Sexual Development : Genetics, Molecular Biology, Evolution, Endocrinology, Embryology, and Pathology of Sex Determination and Differentiation, 2016, 10(4): 167-184.

[11] GEORGES A, L'HTE D, TODESCHINI A L, et al. The transcription factorFOXL2 mobilizes estrogen signaling to maintain the identity of ovarian granulosa cells[J]. ELife, 2014, 3: e04207.

[12] CHENG J C, CHANG H M, QIU Xin, et al.FOXL2-induced follistatin attenuates activin A-stimulated cell proliferation in human granulosa cell tumors[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2014, 443(2): 537-542.

[13] FU Liyuan, ZHANG Mingxiang, MASTRANTONI K, et al. Bovine Lhx8, a germ Cell-Specific nuclear factor, interacts with figla[J]. PLoS ONE, 2016, 11(10): e0164671.