王 歡，朱向情，李慧萍，尹 娜，甘世保，楊 靜，李麗娟，潘興華，魏 玲

心肌細(xì)胞凋亡是心肌重構(gòu)的主要病理基礎(chǔ)，它在心衰、心律失常等多種心臟疾病的病理生理中起著重要作用。本課題組前期研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）在心肌微環(huán)境下，能向心肌細(xì)胞、浦肯野細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞分化，并分泌各種細(xì)胞因子，抑制心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)心肌細(xì)胞生長(zhǎng)，減少基質(zhì)膠原沉積，減輕心肌纖維化[1]。Klotho基因是1997年Kuro等研究自發(fā)性高血壓大鼠時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)的新型抗衰老基因，具有抗氧化應(yīng)激、減少炎癥反應(yīng)、抑制心肌細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、改善心肌微環(huán)境等作用[2]。本研究將重組慢病毒介導(dǎo)的Klotho基因轉(zhuǎn)染至BMSC，并移植到慢性心衰大鼠心肌中，探討Klotho基因修飾的BMSC移植對(duì)慢性心衰大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性SD大鼠24只，其中 18 只鼠齡約 3 月齡，體重（300±30）g，用于心衰大鼠模型制備，另外6只為正常組；另有6只1月齡大鼠，體重（100±20）g，用于制備 BMSC。所用動(dòng)物均由昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滇）2011-0005]。置動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，自由攝食及飲水，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食。

1.2 試劑與儀器 DMEM-F12細(xì)胞培養(yǎng)基（北京HyClone 公司），胎牛血清（FBS，美國(guó) BI公司），胰蛋白酶-EDTA消化液、青-鏈霉素抗生素（北京Solarbio公司），SD大鼠BMSC成骨、成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（廣州賽業(yè)生物科技有限公司）；鹽酸異丙腎上腺素注射液（上海禾豐制藥有限公司），Masson染色試劑盒（武漢谷歌生物科技有限公司），慢病毒載體LVEGFP-Klotho基因，LV-EGFP基因（上海吉?jiǎng)P生物有限公司）。

1.3 BMSC的分離培養(yǎng)及Klotho基因轉(zhuǎn)染 取1月齡大鼠，按本課題組另文報(bào)道的方法制備、鑒定BMSC。取第 3代 BMSC，以 5×105個(gè)細(xì)胞/孔鋪板于48孔板，至細(xì)胞覆蓋率達(dá)70%時(shí)，按預(yù)先測(cè)的最佳感染復(fù)數(shù)（MOI值）150計(jì)算并加入慢病毒LV-EGFP、LVKlotho病毒液，進(jìn)行慢病毒LV-EGFP-Klotho基因轉(zhuǎn)染BMSC。取病毒轉(zhuǎn)染1 w后的BMSC，同時(shí)以未轉(zhuǎn)染BMSC及EGFP-BMSC為對(duì)照。用Trizol法提取總RNA，測(cè)定RNA濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，并以cDNA為模板，擴(kuò)增目的基因片段。PCR引物由上海生工生物有限公司合成。大鼠Klotho引物：上游CAATGG CTTCCCTCCTTTACCT，下游 TTCTCTTCTTGGCTAC AACCCC，內(nèi)參GAPDH引物：上游5'TTCCTACCCC CAATGTATCCG3'，下游 5'CATGAGGTCCACCACCC TGTT3'。PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃、10 min，再一步變性95℃、15 s，退火延伸60℃、60 s，共40個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)束后，根據(jù)每個(gè)樣本反應(yīng)后達(dá)到熒光信號(hào)閾值的循環(huán)數(shù)（Ct值）計(jì)算 2-△△Ct值。

1.4 大鼠心衰模型制備及分組 實(shí)驗(yàn)大鼠腹腔給予異丙腎上腺素注射，3 mg/(kg·d)，共 14 d，建立慢性心衰大鼠模型。隨機(jī)將18只慢性心衰模型大鼠分為Klotho-BMSC、BMSC、模型組，同時(shí)設(shè)正常組，每組6只。Klotho-BMSC組和BMSC組分別經(jīng)尾靜脈注射攜帶Klotho基因的EGFP基因標(biāo)記BMSC(EGFP-Klotho-BMSC)和僅EGFP基因標(biāo)記的BMSC(EGFP-BMSC)5×106個(gè)/ml，1 ml/只；模型組經(jīng)尾靜脈注射等量生理鹽水，正常組不做處理，

1.5 大鼠心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè) BMSC治療后28 d，取各組大鼠心肌組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、連續(xù)切片，切片厚度為 5 μm，進(jìn)行 TUNEL染色。另取各組大鼠心肌組織標(biāo)本進(jìn)行OCT包埋及冰凍切片（15 μm），在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染EGFP的BMSC存活及分布情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多個(gè)樣本均數(shù)間的比較采用方差分析和LSD-t檢驗(yàn)；兩變量相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSC形態(tài)觀察 BMSC分離培養(yǎng)48 h后，可見短小梭形、三角形的BMSC貼壁生長(zhǎng)；4 d后集落形成，細(xì)胞體積增大，多呈長(zhǎng)梭形；原代細(xì)胞10 d左右達(dá)90%以上融合，為均一呈漩渦狀排列的長(zhǎng)梭形細(xì)胞群。傳代后細(xì)胞增殖時(shí)間縮短，形態(tài)為成纖維樣，平均4 d達(dá)85%以上融合。見圖1。

2.2 轉(zhuǎn)染Klotho后各組Klotho mRNA表達(dá)量比較RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組、BMSC組、Klotho-BMSC組的Klotho mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.4256±0.4464、0.4185±0.4251 和 1.000±0.7076，Klotho-BMS 組顯著高于其他兩組（P＜0.05）。

2.3 Klotho-BMSC治療4 w后各組心肌組織綠色熒光分布 熒光顯微鏡下可見，Klotho-BMSC組和BMSC組有EGFP標(biāo)記的BMSC在心肌組織中分布，并且Klotho-BMSC組明顯多于單純BMSC組，而模型組和正常組未見EGFP陽(yáng)性細(xì)胞分布（圖2）。

2.4 各組心肌Klotho mRNA表達(dá)水平比較 各組大鼠心肌組織中均有Klotho基因表達(dá)（圖3）。正常組、模型組、BMSC組、Klotho-BMSC組心肌組織中Klotho基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.803±0.530、0.782±0.145、1.207±0.214、4.857±0.597。 Klotho-BMSC組的Klotho mRNA表達(dá)水平較模型組、BMSC組高（P＜0.01），BMSC組與模型組之間無(wú)顯著差異（P ＞ 0.05）。

2.5 Klotho-BMSC治療4 w后各組心肌細(xì)胞凋亡率比較 正常組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量很少；腹腔注射ISO后，心肌細(xì)胞凋亡率增加，BMSC組為（23.55±3.62）%、Klotho-BMSC 組為（12.61±2.00）%、模型組為（43.61±4.88）%,較正常組（1.53±0.69）%顯著升高（P＜ 0.01）。 而 Klotho-BMSC 組、BMSC 組低于模型（P＜0.01），以Klotho-BMSC組降低最明顯（P＜ 0.01）。

2.6 心肌細(xì)胞凋亡率與心肌組織Klotho mRNA的相關(guān)性分析 各組心肌組織Klotho mRNA的表達(dá)量及心肌細(xì)胞凋亡率均呈正態(tài)分布。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，心肌Klotho mRNA表達(dá)量與心肌細(xì)胞凋亡率呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.598，P＜0.05）。

3 討論

圖1 BMSC培養(yǎng)形態(tài)觀察

心肌細(xì)胞凋亡是心肌重構(gòu)期心肌收縮單元不斷喪失的主要原因[6]。研究顯示，心肌細(xì)胞凋亡后，其自我修復(fù)能力是極其有限的，不足以彌補(bǔ)心肌細(xì)胞數(shù)的減少及維持心肌損傷的修復(fù)，其對(duì)早期及晚期心肌重構(gòu)乃至心衰的產(chǎn)生和惡化均有促發(fā)作用[7]。BMSC具有自我更新及高度增殖能力，能自體移植，能向多種組織分化，并且具有修復(fù)受損組織的潛能[3]。王永等[3]研究發(fā)現(xiàn)，BMSC移植能改善犬急性心肌梗死后心肌纖維化，其心肌間質(zhì)膠原含量隨著時(shí)間呈減少趨勢(shì)。徐燕等[4]研究證明，BMSC能治療擴(kuò)張型心肌病大鼠，細(xì)胞移植4 w后，大鼠心功能明顯改善，心肌膠原含量減少，心肌MMP-2及MMP-9的表達(dá)降低，心肌纖維化明顯改善。本研究與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似，也發(fā)現(xiàn)BMSC移植治療慢性心衰大鼠4 w后，大鼠心肌細(xì)胞變性壞死程度較模型組明顯減少，提示BMSC具有抗慢性心衰大鼠心肌細(xì)胞凋亡的作用。

圖2 EGFP標(biāo)記的大鼠BMSC在心衰大鼠心肌內(nèi)的分布情況

圖3 心肌組織中Klotho mRNA表達(dá)水平的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果

Klotho基因具有抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)活性氧族產(chǎn)生、抑制細(xì)胞衰老及凋亡、抗炎癥反應(yīng)、維持內(nèi)皮細(xì)胞完整性、促進(jìn)NO的產(chǎn)生、改善動(dòng)脈順應(yīng)性、改善心肌重構(gòu)及纖維化等作用[5-6]。本實(shí)驗(yàn)將Klotho基因轉(zhuǎn)染至EGFP基因標(biāo)記的BMSC，并成功移植到慢性心衰大鼠心肌中，熒光顯微鏡下可見，Klotho基因修飾后的BMSC在心肌組織中的存活率明顯增加，而心肌細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步降低。本研究結(jié)果提示，BMSC本身具有抑制心衰大鼠心肌細(xì)胞凋亡、纖維化的功能，Klotho基因修飾BMSC移植治療慢性心衰大鼠,可顯著提高BMSC在心肌組織中的存活率，使其抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用更加顯著。

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