亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        新生獼猴UCMSC的制備、鑒定及對老年獼猴自發(fā)DM的治療作用

        2018-01-24 06:31:39朱向情蔡學(xué)敏李自安龐榮清潘興華
        西南國防醫(yī)藥 2018年1期
        關(guān)鍵詞:獼猴自發(fā)性胰島

        朱向情,王 強,蔡學(xué)敏,李自安,龐榮清,魏 玲,潘興華

        糖尿?。―M)是一組以高血糖為特征的代謝性疾病,可導(dǎo)致多種組織,特別是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害、功能障礙[1]。隨著人口結(jié)構(gòu)的老化,DM的患病率也在增高。西方國家老年(>65歲)DM的患病率約20%,我國老年(>60歲)DM的患病率也在顯著增長[2]。DM是老年人的多發(fā)病、常見病,其并發(fā)癥已成為繼心血管、腦血管及痛癥等疾病之后的主要死亡原因,嚴(yán)重影響老年人的健康。本研究建立了獼猴臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UCMSC)體外制備方法,證實其具有分化為脂肪、骨、軟骨和胰島樣細(xì)胞的能力,并進(jìn)一步探討了UCMSC對老年獼猴自發(fā)性DM的治療作用。

        1 材料與方法

        1.1 主要試劑與設(shè)備 DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Hyclone公司),新生牛血清(美國Gibco公司),雙抗(美國Hyclone公司),檸檬酸鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),NaCl(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司),超氧化物岐化酶測試盒(南京建成),淋巴細(xì)胞分離液(南京建成),百萬級層流超凈工作臺(SW-CL-2F型,蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司),百級層流超凈工作臺(吳江市綠鳥凈化設(shè)備廠),倒置相差顯微鏡(BX60型,日本奧林巴斯),LEICA RM2135組織切片機(德國萊卡)。

        1.2 實驗動物 自發(fā)性DM老年獼猴1只,24周歲,雌性,由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院昆明醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所實驗動物中心提供,于普通級環(huán)境下,按照常規(guī)條件飼養(yǎng)觀察。

        1.3 獼猴UCMSC分離、擴(kuò)增 取健康足月妊娠獼猴,3%戊巴比妥鈉麻醉后,仰臥,常規(guī)消毒、鋪巾,剖腹取臍帶并立即浸泡于含有雙抗20%DMEM-12胎牛血清培養(yǎng)基中。在無菌條件下,剔除臍動脈、臍靜脈和被膜組織,0.9%的生理鹽水沖洗,剪成體積小于1×1×1 mm3的組織塊,接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中,使組織塊均勻分布于瓶底,加入20%DMEM-F12胎牛血清培養(yǎng)基1 ml浸潤組織塊,置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),6~12 d后第1次換液。待細(xì)胞融合達(dá)80%時,用0.25%胰酶消化,常規(guī)傳代培養(yǎng)。

        1.4 UCMSC分化能力鑒定

        1.4.1 成骨誘導(dǎo)分化 將細(xì)胞以3×104/cm2的密度接種在6孔板中,置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24 h至達(dá)到80%融合,更換成骨分化培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)。此后,每2 d換成骨分化培養(yǎng)基1次。分化誘導(dǎo)21 d后,固定細(xì)胞,并用茜素紅進(jìn)行鈣結(jié)節(jié)染色(MSC go Osteogenic XFTM,BI,Israel)。

        1.4.2 成脂分化誘導(dǎo) 將細(xì)胞以3×104/cm2的密度接種在6孔板中,置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24 h至達(dá)到80%融合,更換成脂分化培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)。此后,每2 d換成脂分化培養(yǎng)基1次。分化誘導(dǎo)14 d后,固定細(xì)胞,并用油紅O染色(MSC go Adipogenic XFTM,BI,Israel)。

        1.4.3 成軟骨分化誘導(dǎo) 將細(xì)胞以3×105/cm2的密度接種在6孔板中,置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)48 h至形成球體,更換成軟骨分化培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)。此后,每4 d換成軟骨分化培養(yǎng)基1次。分化誘導(dǎo)21 d后,固定細(xì)胞,并用阿爾辛藍(lán)染色(MSC go Chondrogenic XFTM,BI,Israel)。

        1.4.4 成胰島細(xì)胞分化誘導(dǎo)采用四步法:第一步,將細(xì)胞以3×105/cm2的密度接種于6孔培養(yǎng)板中,用含2%B27、11.1 mM葡萄糖、4 nM activin A的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d,用含有0.1 mM丁酸鈉的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)1 d,用膠原酶Ⅳ,將細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液,轉(zhuǎn)移至超低粘附6孔板。第二步,用含2%B27、20 ng/ml EGF、2 ng/ml bFGF、100 ng/ml Noggin 的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)2 w。第三步,用含2%B27、EGF(20 ng/ml)、Noggin(100 ng/ml)的 RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)1 w。第四步,用含BSA(0.5%)、nicotinamide(10 mM)、胰島素樣生長因子Ⅱ(50 ng/ml)的 RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d。每個步驟用都是3~4 d換1次液。最后用insulin免疫熒光染色

        1.5 UCMSC細(xì)胞治療 將上述分離、純化并鑒定后的UCMSC調(diào)整濃度為5×106個/ml,并按照5×106個/kg經(jīng)靜脈輸入自發(fā)性DM老年獼猴,1次/2 w,連續(xù)3次。

        1.6 療效評價 收集UCMSC治療前及治療后2 w的自發(fā)性DM老年獼猴血清,采用自動生化分析儀檢測葡萄糖(Glu)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、血清胰島素(INS)、血清 C-肽(C-P)含量。

        2 結(jié)果

        2.1 獼猴UCMSC表型 收集傳代至第3代的UCMSC,通過流式細(xì)胞分析,CD34和CD45表達(dá)率分別為0.098%和0.75%;CD44和CD29表達(dá)率分別為96.2%和99.4%。見圖1。

        2.2 獼猴UCMSC體外分化能力 收集傳代至第3代 UCMSC(圖2A),分別向軟骨樣細(xì)胞、骨樣細(xì)胞、脂肪樣細(xì)胞、胰島樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化,在分化誘導(dǎo)完成后,去除培養(yǎng)基成分,4%甲醛固定細(xì)胞后,茜素紅染色。從圖2可見,UC-MSC可以誘導(dǎo)分化為軟骨樣細(xì)胞,阿爾辛藍(lán)染色為陽性(圖2B);UC-MSC可以誘導(dǎo)分化為骨樣細(xì)胞,茜素紅染色為陽性(圖2C);UC-MSC可以誘導(dǎo)分化為脂肪樣細(xì)胞,油紅O染色為陽性(圖2D);UC-MSC可以誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞,insulin免疫熒光染色為陽性(圖2E)。表明獼候UCMSC具有向軟骨、骨、脂肪、胰島細(xì)胞分化的潛能。

        2.3 UCMSC對DM的治療作用 UCMSC治療3次后,自發(fā)性DM老年獼猴血清Glu、TG、TC含量均顯著降低,而INS、C-P均顯著升高(表1)。

        3 討論

        UCMSC是一種具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞,能分化成多種不同的細(xì)胞譜系,如骨、脂肪、軟骨等間質(zhì)細(xì)胞譜系,以及神經(jīng)元、肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等內(nèi)胚層和神經(jīng)外胚層細(xì)胞[3-4]。體內(nèi)外實驗證實,UCMSC可分化為能夠分泌胰島素的功能細(xì)胞[5-6]。UCMSC具有參與損傷修復(fù)、分泌生長因子、調(diào)節(jié)免疫、抑制炎癥、促進(jìn)代謝、抗氧化應(yīng)激等多方面的生物效應(yīng),利用這些生物效應(yīng)對DM進(jìn)行治療,對促進(jìn)胰腺損傷修復(fù)、改善代謝功能、改善糖代謝、治療和預(yù)防DM等均會產(chǎn)生積極作用。研究發(fā)現(xiàn),同基因或異基因MSC移植給DM鼠后,可快速降低血糖水平,有效逆轉(zhuǎn)其高血糖癥狀[7]。

        圖1 新生獼猴UCMSC的免疫表型流式分析

        圖2 UCMSC成軟骨、成骨、成脂、成胰分化

        表1 UCMSC治療前后DM相關(guān)指標(biāo)的變化

        本實驗成功分離、培養(yǎng)并獲得了獼猴UCMSC,流式分析結(jié)果顯示,免疫表型為CD44(96.2%)和CD29(99.4%)表達(dá)陽性,CD45(0.75%)和 CD34(0.098%)表達(dá)陰性。同時檢發(fā)現(xiàn)其可以分化為脂肪樣細(xì)胞、骨樣細(xì)胞、軟骨樣細(xì)胞和胰島樣細(xì)胞,表明所獲得的UCMSC符合間充質(zhì)類干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。利用其治療自發(fā)性DM老年獼猴后,血清Glu、TG、TC含量均顯著降低,而INS、C-P均顯著升高,表明UCMSC對老年自發(fā)性DM有一定治療效果。分析其機制,可能是:(1)分泌多種細(xì)胞因子,抑制胰島細(xì)胞凋亡,支持胰腺功能,促進(jìn)其功能的恢復(fù)[8]。(2)分化為胰島β細(xì)胞,替代受損的β細(xì)胞,增加胰腺細(xì)胞的數(shù)量,修復(fù)受損胰腺[9]。(3)減少機體由于異常代謝產(chǎn)生的免疫和慢性炎癥反應(yīng),阻止胰島β細(xì)胞的進(jìn)一步受損,同時減輕胰腺以及其他組織的炎癥反應(yīng),緩解胰島素抵抗,提高組織對胰島素的敏感性[10]。

        [1] Fontana L,Kennedy BK,Longo VD,et al.Medical research:treat ageing[J].Nature,2014,511(7510):405-407.

        [2] 吳曉珍.老年糖尿病的護(hù)理[J].大家健康旬刊,2012,6(7):55-56.

        [3] Augello A,Tasso R,Negrini SM,et al.Cell therapy using allogeneic bone marrow mesenchymal stem cells prevents tissue damage in collagen-induced arthritis[J].Arthritis Rheum,2007,56(4):1175-1186.

        [4] Glennie S,Soeiro I,Dyson PJ,et al.Bone marrow mesenchymal stem cells induce division arrest anergy of activated T cells[J].Blood,2005,105(7):2821-2827.

        [5] Kern S,Eichler H,Stoeve J,et al.Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow,umbilical cord blood,or adipose tissue[J].Stem Cells,2006,24(5):1294-1301.

        [6] Yanli Y,Furong L.Mesenchymal stem cells research status of cell therapy of diabetes[J].Chin J Pancreatol,2010,10(4):299-301.

        [7] 謝洪彬,齊暉,李富榮.間充質(zhì)干細(xì)胞治療糖尿病機制的研究進(jìn)展[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2010,30(8):885-888.

        [8] 陳楚嫻,任莉莉,蔣錦杏,等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞胰腺內(nèi)移植治療糖尿病:是否發(fā)生了細(xì)胞的“轉(zhuǎn)分化”[J]? 中國組織工程研究,2014,32:5158-5165.

        [9] Kern S,Eichler H,Stoeve J,et al.Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow,umbilical cord blood,or adipose tissue[J].Stem Cells,2006,24(5):1294-1301.

        [10] Donath MY,Shoelson SE.Type 2 diabetes as an inflammatory disease[J].Nat Rev Immunol,2011,11(2):98-107.

        猜你喜歡
        獼猴自發(fā)性胰島
        小獼猴征集令
        小獼猴話跆拳道
        童話世界(2020年32期)2020-12-25 02:59:14
        自發(fā)性冠狀動脈螺旋夾層1例
        小獼猴偵探社
        小獼猴偵探社
        胰島β細(xì)胞中鈉通道對胰島素分泌的作用
        4例自發(fā)性腎破裂患者的護(hù)理
        家兔胰島分離純化方法的改進(jìn)
        自發(fā)性乙狀結(jié)腸穿孔7例診治體會
        自發(fā)性血胸治療體會
        好爽~又到高潮了毛片视频 | 人妻精品在线手机观看| 色综合久久网| 日韩少妇内射免费播放18禁裸乳| 越猛烈欧美xx00动态图| 免费高清日本中文| 无码天堂在线视频| 国产黄色一级到三级视频| 亚洲综合av大全色婷婷| 伊人久久大香线蕉av网禁呦| 国内揄拍国内精品| 亚洲日韩区在线电影| 亚洲综合偷拍一区二区| 亚洲av福利天堂一区二区三| 思思久久96热在精品国产| 久久人人做人人妻人人玩精| 超高清丝袜美腿视频在线| 国产精品毛片极品久久| 久久久亚洲av成人网站| 性一交一乱一伦a片| 无码一区东京热| 日本一区二区视频免费在线观看| 国产成人精品一区二三区孕妇| 又色又爽又黄高潮的免费视频| 欧产日产国产精品精品| 无码在线观看123| 久久精品国产亚洲片| 蜜桃视频羞羞在线观看| 精品成在人线av无码免费看| 久久精品国产9久久综合| 91精品国产免费久久久久久青草| 精品久久精品久久精品| 不卡的高清av一区二区三区| 国内露脸少妇精品视频| 婷婷色综合成人成人网小说| 亚洲av色精品国产一区二区三区| 亚洲欧洲成人a∨在线观看| 少妇被粗大的猛进69视频| 中文字幕精品一区二区日本 | 亚洲国产精品无码久久久| 久久成人麻豆午夜电影|