郭德鑌，李青青，王金祥，劉菊芬，王 強(qiáng)，楊建勇，朱向情，潘興華,楊 嬡

造血微環(huán)境和免疫細(xì)胞對電離輻射具有高度敏感性，而電離輻射又能催化炎癥細(xì)胞與炎癥因子相互作用，加重造血免疫紊亂，但機(jī)制尚未闡明，有研究提示這可能與輔助性T細(xì)胞的Th1/Th2的異常或失衡有關(guān)[1]。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UCMSC）具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)和促進(jìn)造血重建作用，預(yù)計UCMSC對放射性組織損傷及其誘導(dǎo)的炎癥、免疫反應(yīng)可產(chǎn)生治療效應(yīng)。有研究證明，在體外T細(xì)胞可被PHA、異種抗原、CD3、CD28抗體等刺激活化增殖，而與MSC共培養(yǎng)時，T細(xì)胞增殖整體受到抑制，Th1細(xì)胞因子分泌減少，Th2細(xì)胞因子分泌增加[2]。為探索UCMSC體內(nèi)移植對淋巴細(xì)胞增殖是否有相似的作用，本實驗觀察了UCMSC治療對放射傷樹鼩外周血和脾淋巴細(xì)胞表達(dá)Th1/Th2類細(xì)胞因子的影響，進(jìn)而探討UCMSC調(diào)節(jié)造血免疫功能的作用機(jī)制，為臨床運用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 DMEM/F12培養(yǎng)基（Hyclone），胎牛血清、0.25%胰酶（BI）,鼠抗人CD31/CD34/CD44/CD90（4ABiotech），高純總 RNA 提取試劑盒（BioTeke），熒光定量 PCR-Mix（SYBR Green），PCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega），LifeECO 基因擴(kuò)增儀(BIOER)，C1000 PCR 儀（BIO-RAD），F(xiàn)ACScabilur流式細(xì)胞儀（BD 公司），基因引物（GAPDH、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6）由昆明碩擎、碩陽公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 UCMSC的復(fù)蘇、培養(yǎng)、鑒定 UCMSC取自本科室建立的樹鼩UCMSC庫，參考文獻(xiàn)[3]方法復(fù)蘇細(xì)胞。待細(xì)胞生長達(dá)95%融合后，0.25%胰酶消化， 收集細(xì)胞（1×105個/管），PBS洗滌， 分別加入CD31/CD34/CD44/CD90單克隆抗體，流式細(xì)胞術(shù)分析UCMSC的表型。

1.2.2 實驗動物及分組 成年雄性樹鼩30只，體重（125.8±9.2）g，由中國科學(xué)院昆明動物所提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(滇)K2012-0001。隨機(jī)分為模型組（15只）、治療組（15只）。將所有樹鼩置于自制的塑料盒內(nèi)，接受全身一次性4.5 Gy電離輻照，照射劑量及方法參照文獻(xiàn)[4]。治療組于照射后當(dāng)日開始經(jīng)股靜脈輸注UCMSC3×107個/kg），模型組則給予同體積生理鹽水，均1次/w，連續(xù)治療4次。實驗期間，所有樹鼩均普通喂養(yǎng)。

1.3 觀察指標(biāo) 在末次治療后1 w，分別統(tǒng)計或檢測兩組下列指標(biāo)。（1）樹鼩存活率；（2）外周血和脾Th1/Th2細(xì)胞因子mRNA表達(dá)：脫頸處死存活樹鼩，參照文獻(xiàn)[5]方法,制備脾單細(xì)胞懸液，用試劑盒提取RNA。RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。需檢測的Th1/Th2細(xì)胞因子目的基因（TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6）PCR 引物序列見表1。采用實時熒光定量PCR反應(yīng)，各熒光曲線與基線交叉點的循環(huán)數(shù)為Ct值。依據(jù)公式△Ct=CT目的基因-CTβ-actin與△△Ct=2-△Ct， 計算檢測基因的mRNA相對表達(dá)量，每組重復(fù)3次取平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UCMSC的培養(yǎng)和鑒定 復(fù)蘇后的樹鼩UCMSC貼壁生長，大小均一，形態(tài)規(guī)整，長梭形，呈平行排列或旋渦狀生長，低密度時細(xì)胞較扁平，高密度時細(xì)胞稍細(xì)長。流式細(xì)胞儀檢測UCMSC表面標(biāo)記CD31/、CD34、CD44、CD90 陽 性 細(xì) 胞 率 分 別 約 為:0.2%、0.2%、99.7%、99.8%。

2.2 生存率比較 在照射后4 w，模型組存活率為 53.33%（8/15），治療組為 86.77%(13/15)，兩組比較差異顯著（P＜0.05），模型組結(jié)果與本課題組前期報道的制備模型相似[4]，表明模型復(fù)制成功。

2.3 兩組外周血和脾Th1/Th2細(xì)胞因子mRNA表達(dá) 在連續(xù)4次UCMSC治療后1 w，治療組外周血和脾 Th1細(xì)胞因子（TNF-α、IL-2）均低于模型組（P＜0.05）， 而外周血和脾Th2 細(xì)胞因子（IL-4、IL-6）均高于模型組（P＜0.05）。 見表 2、3。

3 討論

機(jī)體的免疫系統(tǒng)對電離輻射具有高度敏感性，即使低劑量的輻射，也能造成免疫失衡。輔助T淋巴細(xì)胞是執(zhí)行免疫防御的重要細(xì)胞，主要分為Th1、Th2細(xì)胞亞群，正常情況下，兩種細(xì)胞亞群通過分泌的細(xì)胞因子相互制衡。如果受到外界干擾導(dǎo)致Th1/Th2失衡，則會觸發(fā)異常免疫應(yīng)答，造成病理狀態(tài)[6]。Th1、Th2細(xì)胞一般通過測量其特定分泌的細(xì)胞因子來間接反映二者比例。Th1細(xì)胞主要分泌IL-17、TNF、IL-2、IFN-γ，參與細(xì)胞免疫；Th2 細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-6、IL-5、IL-10，參與體液免疫。

表1 Th1/Th2細(xì)胞因子mRNA引物序列

表2 兩組外周血h1/h2細(xì)胞因子相對表達(dá)量比較

表2 兩組外周血h1/h2細(xì)胞因子相對表達(dá)量比較

注:與治療組比較,①P＜0.05

Th1細(xì)胞因子 Th2細(xì)胞因子組別 TNF-α IL-2 IL-6 IL-4治療組(n=13) 1.00±0.03 1.00±0.09 1.00±0.15 1.00±0.08模型組(n=8) 2.58±0.22 3.98±0.11 0.14±0.01 0.21±0.09

表3 兩組脾Th1/Th3細(xì)胞因子相對表達(dá)量比較

Th1、Th2細(xì)胞因子的檢測可使用ELASA試劑盒、流式或?qū)崟r熒光定量PCR等方法檢測，但由于樹鼩特異性抗體缺乏的限制，最終本實驗決定采用實時熒光定量PCR法檢測樹鼩外周血和脾淋巴細(xì)胞分泌的 Th1/Th2 細(xì)胞因子 TNF-α、IL-2、IL-6、IL-4，探討UCMSC對體內(nèi)Th1/Th2細(xì)胞因子的平衡調(diào)節(jié)。結(jié)果顯示，模型組外周血和脾Th1細(xì)胞因子（TNF-α、IL-2）均高于治療組（P＜0.05），提示電離輻射促進(jìn)TNF-α、IL-2的分泌，Th1/Th2平衡向Th1方向飄移，與文獻(xiàn)報道相似[7]。IL-2是T細(xì)胞生長因子，能刺激T細(xì)胞進(jìn)人細(xì)胞分裂周期，增強(qiáng)T細(xì)胞的殺傷活性；TNF-α能刺激纖維母細(xì)胞增殖，促進(jìn)凝血因子和組織因子活性，增強(qiáng)中性粒細(xì)胞對血管內(nèi)皮的粘附性，加速血管出血壞死，還能誘導(dǎo)IL-2的產(chǎn)生。模型組外周血和脾Th2細(xì)胞因子（IL-4、IL-6）均低于治療組（P＜0.05），提示UCMSC移植后促進(jìn)Th2細(xì)胞因子優(yōu)勢化。IL-4可單獨維持Th2細(xì)胞的增殖，抑制TNF的分泌，還可協(xié)同CSF刺激造血細(xì)胞的增殖，協(xié)同G-CSF增強(qiáng)粒細(xì)胞集落形成，協(xié)同EPO增強(qiáng)BFU-E的形成，減輕炎癥反應(yīng)，進(jìn)而維持造血微環(huán)境的穩(wěn)定。IL-6具有復(fù)雜的生理功能，它可誘導(dǎo)B細(xì)胞分化并產(chǎn)生抗體，促進(jìn)T細(xì)胞增殖，促進(jìn)骨髓造血干細(xì)胞增殖，增強(qiáng)血細(xì)胞分化,且不同的刺激對IL-6有不同的主導(dǎo)作用，會導(dǎo)致機(jī)體不一樣的免疫反應(yīng)。

綜上所述，UCMSC移植治療放射損傷樹鼩，可促進(jìn)體內(nèi)外周血和脾中Th1向Th2細(xì)胞飄移，結(jié)果為細(xì)胞治療放射損傷提供理論依據(jù)，但UCMSC對細(xì)胞因子的調(diào)控機(jī)制有待深入研究。

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