黃浩然 ， 竇文超 ， 趙廣英

(浙江工商大學食品與生物工程學院 浙江省食品安全重點實驗室 ， 浙江 杭州 310018)

電流型葡萄糖傳感器包含多個種類，目前應用最多的是便攜式葡萄糖傳感器(personal glucose meter，PGM)，在快速、靈敏、準確、便攜、經濟和結果直觀可讀等方面具有突出優(yōu)點[1]。近年來，PGM在檢測非葡萄糖目標物方面引起國內外動物醫(yī)學、醫(yī)學、食品安全和環(huán)境等多領域研究人員的廣泛關注且發(fā)展迅速，自Lu等(2011)[2]首報用PGM檢測非葡萄糖目標物成功以來，各領域研究人員已解決了多種關鍵技術問題，成功研發(fā)了基于PGM的多類型檢測系統(tǒng)，實現了對農殘、獸殘、食品有害添加物、重金屬離子、致病微生物、病毒及真菌毒素的快速檢測。本文將從檢測系統(tǒng)的構建、指示信號的產生、改善與放大和不同類型目標物的檢測3方面進行論述，以期推動PGM在各檢測領域的快速發(fā)展。

1 不同類型檢測系統(tǒng)的構建

基于PGM的非葡萄糖檢測體系有多種，如已見報道的DNA探針、免疫夾心法、核酸適配體技術、分子印跡技術等。

1.1 基于DNA探針的PGM即時檢測 用DNA探針以核酸互補配對方式檢測目標物，具有非常高的特異性和靈敏度，適合用于核酸片段或小分子的檢測。Xu等(2015)[3]利用基于鏈置換反應的DNA等溫擴增技術檢測目標DNA，在聚合酶作用下，少量目標DNA也可以使磁性納米粒子上的多條捕獲DNA與酶標DNA鏈互補結合，起到放大信號的作用，提高了檢測的靈敏度，檢測限為5.0×10-3pM。Luo等(2015)[4]利用DNA探針與多巴胺分子特異性結合后釋放部分DNA鏈的特性，構建了一種基于PGM即時檢測多巴胺的方法。

1.2 基于夾心法的PGM即時檢測 夾心法檢測目標物包括雙抗體夾心法和核酸適配體夾心法。Lu等(2012)[5]首次使用雙抗體夾心法檢測前列腺特異抗原。Sun等(2014)[6]用反膠束法將葡糖淀粉酶封裝在納米金團簇內，在96孔板表面和納米金團簇表面分別修飾凝血酶適配體，從而與被測物形成夾心結構。Wang等(2015)[7]用單克隆抗體捕獲，適配體標記的方式檢測心臟生物標志物肌紅蛋白，既提高了檢測的特異性，又提高了靈敏度，檢測限為50 pM。

2 指示信號的產生、改善與放大

改善和放大指示信號，能有效提高檢測的靈敏度和準確性，是考量檢測系統(tǒng)優(yōu)劣的重要指標。

2.1 分解基質碳源產生葡萄糖 利用活細菌生長繁殖過程中分解基質中特定碳源產生的葡萄糖，在一定時間內檢測培養(yǎng)體系中葡萄糖含量并計算濃度差值△C，依據預先做好的標準曲線，確定樣品中的菌含量[8]。該方法中，細菌總數測定的準確性、對于致病菌定性定量檢測的特異性等，通常取決于配套研制的具有嚴格選擇性的培養(yǎng)基，只有特定菌種才能實現。該方法的最大優(yōu)點是簡便、準確、穩(wěn)定，非常有實用價值，其不足在于研制成具有嚴格選擇性的適用培養(yǎng)基較難。

2.2 酶促水解產生葡萄糖或包埋后釋放葡萄糖 現有報道中多用酶促水解產生葡萄糖，用PGM檢測其量的變化。常用的酶包括蔗糖酶、葡萄糖淀粉酶以及淀粉葡萄糖苷酶等，其中蔗糖酶最為常用，Gao等(2016)[9]設計了一種檢測甲基轉移酶的方法，在磁性納米粒子表面修飾多條雙鏈DNA，并通過親和素-生物素特異性結合蔗糖酶，由于未甲基化的雙鏈DNA會被限制性內切酶HpaⅡ切斷并釋放蔗糖酶，因此葡萄糖信號較低則說明樣品中存在甲基轉移酶。近年來有研究者引入脂質體作為媒介，如利用脂質體包埋葡萄糖分子，用以檢測黃曲霉毒素[10]。Xue等(2017)[11]包被葡萄糖淀粉酶，再在脂質體表面修飾DNA探針，當甲基轉移酶存在時，限制性內切酶DpnⅠ會特異性地切斷甲基化DNA鏈，釋放脂質體囊泡，最后使囊泡破裂水解淀粉，檢測限可以達到0.002 U/L。利用脂質體作為媒介可以放大信號、降低檢測限，但是由于其制作成本較高、難度較大，欲作為一種通用方法得到普及較難。

3 對不同類型目標物的檢測

3.1 對獸藥殘留的檢測 濫用獸藥導致的有害物質殘留對人體健康和畜牧業(yè)發(fā)展都有很大危害，即時檢測氯霉素、萊克多巴胺等獸藥殘留有助于進一步降低動物源性食品的安全風險。

Chen等(2015)[12]以磁性納米粒子為載體，用分子印跡技術在納米粒子表面留下空隙，實現特異性檢測氯霉素分子。Gan等(2014)[13]在磁性納米粒子表面修飾β-環(huán)狀糊精(簡稱β-CD)，β-CD可與萊克多巴胺上的苯環(huán)形成包結復合物，再在Envision試劑的聚糊精胺骨架表面修飾大量蔗糖酶用于信號放大，使最低檢測限達到0.34 ng/mL，且檢測時間遠低于傳統(tǒng)的色譜法和ELISA法。

3.2 飼料中有毒有害物質的檢測 飼料作為影響動物源性食品安全的源頭物質，加強監(jiān)管、完善即時檢測方法具有重要意義?；赑GM檢測系統(tǒng)可以實現對飼料中有毒有害污染物包括重金屬離子、黃曲霉毒素和三聚氰胺等的即時檢測。Lu等(2013)[14]利用鉛離子會使特定DNA鏈斷裂的特性，設計以磁性納米粒子為載體的檢測方法，對鉛離子檢測限為75 nM。Zhang等(2015)[15]設計在96孔板表面修飾鏈霉親和素，再連接基板鏈和催化鏈，當鉛離子存在時，基板鏈斷裂并連接互補DNA鏈，從而實現對鉛離子的檢測，該方法檢測限可低至1 pM。

汞也是飼料的主要污染因素之一，在人體內富集會造成不可逆的DNA損傷和中樞神經損傷。有研究表明，汞離子可通過N-Hg鍵形成胸腺嘧啶-汞-胸腺嘧啶錯配的特殊結構，其強度高于氫鍵。唐點平課題組利用這一特殊結構，分別以96孔板和金電極為載體發(fā)表了兩篇PGM即時檢測汞離子的文章。一是在DNA鏈的一端連接納米金包被的蔗糖酶，用于信號輸出，對汞的檢測限為10 pM[16]。二是用同樣的方法捕獲汞離子，但將載體換成了金電極，用于信號輸出的物質改為納米金修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物，增大了比表面積，因此能修飾更多蔗糖酶，使輸出信號更強，檢測限進一步降低到了4.2 pM[17]。Fang等(2016)[18]利用重金屬離子對微生物葡萄糖消耗的抑制作用，設計了一套檢測多種重金屬的方法，更加經濟、簡便。

Tang等(2016)[10]報以96孔板為載體，以免疫夾心法檢測黃曲霉毒素，在標記抗體一端連接封裝有葡萄糖分子的脂質體，最后用表面活性劑釋放葡萄糖產生信號。另外，清華大學與美國伊利諾伊大學合作開發(fā)了一種PGM即時檢測三聚氰胺的方法[19]。研究人員將BDNA與酶標DNA一起與三聚氰胺適配體互補結合，并巧妙地利用了三聚氰胺與其適配體結合時的特性，即在三聚氰胺存在時，適配體會折疊成特殊的形狀，從而釋放出酶標DNA。該方法在緩沖液中的檢測限為41.1 μg/mL，在牛奶樣品中為67.5 μg/mL，均接近美國標準。

3.3 對病原微生物的檢測 病原微生物檢測在醫(yī)學和動物醫(yī)學領域都具有重要的研究價值，完善病原微生物即時檢測方法有助于提高治療效率、減少經濟損失。Joo等(2013)[20]利用雙抗體夾心法結合PGM，在標記抗體一端修飾蔗糖酶，用以檢測沙門菌，相較于傳統(tǒng)的ELISA法，靈敏性和準確度都有所提升，檢測限為10 CFU/mL。Ren等(2015)[21]通過靜電吸附作用，設計了一種檢測大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的方法。即在磁性納米粒子表面包硅，處理后得到一種可以靠靜電吸附酶和微生物的納米粒子，因大腸桿菌和金黃色葡萄球菌表面帶有較強的負電荷，納米粒子會緊緊吸附在菌體表面，從而釋放原本吸附的葡萄糖淀粉酶，再通過酶促反應釋放信號。本研究室自2013年開始進行PGM即時檢測病原微生物研究至今，完成了多項檢測研究[8,22]。解決了多個關鍵技術問題，實現了對大腸埃希菌計數、菌落總數測定、嗜熱脂肪芽孢桿菌定性和定量檢測，弧菌屬細菌和克洛諾阪崎腸桿菌的快速檢測等，在致病微生物檢測方面具有顯著優(yōu)勢。

3.4 對病毒的檢測 血糖儀用于病毒的即時檢測也有報道，Lu等(2012)[23]利用核酸的特異性雜交，將捕獲探針修飾在磁性納米粒子上，與酶標探針一同形成乙肝核酸的互補鏈，同時，改變片段上的一個堿基，設計多個錯配的核酸片段以驗證該方法的特異性。結果顯示，該方法較好地實現了在生物樣品中對乙肝核酸序列的選擇性檢測，檢測限為40 pM。Wang(2014)[24]等結合微流控芯片，利用其高通量、多通道的特性，設計檢測3種乙肝病毒核酸，通過親合素-生物素在通道表面修飾大量捕獲DNA，提高了檢測的靈敏度，檢測限低至10 pM，且可多目標同時檢測。

4 展望

目前，PGM即時檢測的拓展研究展現出了令人欣喜的成果，并顯示出了很大的應用潛力。用該方法結合其他新技術和新材料可進一步提高靈敏度和準確性。從已有的研究成果來看，該方法在動物源性食品安全、飼料安全檢測等方面具有顯著優(yōu)勢。更重要的是，該法所需時間短，檢測價格低廉，靈敏度高，且對設備和人員要求低，適于制成試劑盒供養(yǎng)殖戶和商家使用，同時也為欠發(fā)達地區(qū)的動物醫(yī)學檢測提供了新的方法。但其也存在不足之處，如市售血糖儀種類繁多，不同品牌的血糖儀對同一樣品的定量檢測結果有時會有較大差異，因此使用不同品牌儀器的實驗室需各自預先建立自己的標準曲線?？傊?，基于PGM的即時檢測系統(tǒng)在檢測非葡萄糖目標物時具有廣闊的應用前景，相信在不久的將來，該方法能在動物醫(yī)學、醫(yī)學和食品安全等領域取得長足進展。

參考文獻：

[1] Montagnana M, Caputo M, Giavarina D,etal. Overview on self-monitoring of blood glucose [J]. Clin Chim Acta, 2009, 402: 7-13.

[2] Xiang Y, Lu Y. Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets[J]. Nat Chem， 2011, 3(9): 697-703.

[3] Xu X T, Liang K Y, Zeng J Y. Portable and sensitive quantitative detection of DNA based on personal glucose meters and isothermal circular strand-displacement polymerization reaction[J]. Biosensors and Bioelectronics， 2015, 64: 671-675.

[4] Xu H, Xu Y Q, Xie G L,etal. Aptamer biosensor for highly sensitive and selective detection of dopamine using ubiquitous personal glucose meters[J]. Sensors and Actuators B: Chemical， 2015, 209: 596-601.

[5] Xiang Y, Lu Y. Portable and quantitative detection of protein biomarkers and small molecular toxins using antibodies and ubiquitous personal glucose meters[J]. Anal Chem， 2012, 84(9): 4 174-4 178.

[6] Sun A L, Jia F C, Zhang Y F,etal. Gold nanocluster-encapsulated glucoamylase as a biolabel for sensitive detection of thrombin with glucometer readout[J]. Microchimica Acta， 2014, 182(5-6): 1 169-1 175.

[7] Wang Q, Liu F, Yang X H,etal. Sensitive point-of-care monitoring of cardiac biomarker myoglobin using aptamer and ubiquitous personal glucose meter[J]. Biosens Bioelectron， 2015, 64: 161-164.

[8] 陳妍. 便攜式血糖儀快速檢測食品安全微生物的研究[D]. 杭州: 浙江工商大學, 2015.

[9] Deng H M, Peng S Y, Gao Z Q. Highly sensitive detection of M.SssI DNA methyltransferase activity using a personal glucose meter[J]. Anal Bioanal Chem， 2016, 408:5 867-5 872.

[10] Tang J, Huang Y P, Liu H Q,etal. Novel glucometer-based immunosensing strategy suitable for complex systems with signal amplification using surfactant-responsive cargo release from glucose-encapsulated liposome nanocarriers[J]. Biosens Bioelectron， 2016, 79: 508-514.

[11] Zhang Y N, Xue Q W, Liu J F,etal. Magnetic bead-liposome hybrids enable sensitive and portable detection of DNA methyltransferase activity using personal glucose meter[J]. Biosensors and Bioelectronics， 2017, 87: 537-544.

[12] Chen S, Gan N, Zhang H R,etal. A portable and antibody-free sandwich assay for determination of chloramphenicol in food based on a personal glucose meter[J]. Anal Bioanal Chem， 2015, 407(9): 2 499-2 507.

[13] Chen S, Zhang J B, Gan N,etal. An on-site immunosensor for ractopamine based on a personal glucose meter and using magnetic β-cyclodextrin-coated nanoparticles for enrichment, and an invertase-labeled nanogold probe for signal amplification[J]. Microchimica Acta， 2014, 182(3-4): 815-822.

[14] Xiang Y, Lu Y. An invasive DNA approach toward a general method for portable quantification of metal ions using a personal glucose meter[J]. Chem Commun， 2013, 49(6): 585-587.

[15] Zhang J, Tang Y, Teng L M,etal. Low-cost and highly efficient DNA biosensor for heavy metal ion using specific DNAzyme-modified microplate and portable glucometer-based detection mode[J]. Biosens Bioelectron， 2015, 68: 232-238.

[16] Zhang J, Tang Y, Lv J,etal. Glucometer-based quantitative determination of Hg(II) using gold particle encapsulated invertase and strong thymine-Hg(II)-thymine interaction for signal amplification[J]. Microchimica Acta， 2014, 182(5-6): 1 153-1 159.

[17] Qiu Z L, Shu J, Jin G X,etal. Invertase-labeling gold-dendrimer for in situ amplified detection mercury(II) with glucometer readout and thymine-Hg(2+)-thymine coordination chemistry[J]. Biosens Bioelectron， 2016, 77: 681-686.

[18] Fang D Y, Gao G Y, Yu Y,etal. Adaptive use of a personal glucose meter (PGM) for acute biotoxicity assessment based on the glucose consumption of microbes[J]. The Analyst， 2016, 141(10): 3 004-3 011.

[19] Gu C M, Lan T, Shi H C,etal. Portable Detection of Melamine in Milk Using a Personal Glucose Meter Based on an in Vitro Selected Structure-Switching Aptamer[J]. Anal Chem， 2015, 87(15): 7 676-7 682.

[20] Joo J, Kwon D, Shin H H,etal. A facile and sensitive method for detecting pathogenic bacteria using personal glucose meters[J]. Sensors and Actuators B: Chemical， 2013, 188: 1 250-1 254.

[21] Wang Z Z, Chen Z W, Gao N,etal. Transmutation of Personal Glucose Meters into Portable and Highly Sensitive Microbial Pathogen Detection Platform[J]. Small， 2015, 11(37): 4 970-4 975.

[22] 郭燕, 竇文超, 趙廣英. 便攜式電流型葡萄糖傳感器快速檢測致奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌的研究[J]. 中國預防獸醫(yī)學報， 2015, 37(10): 780-785.

[23] Xiang Y, Lu Y. Using commercially available personal glucose meters for portable quantification of DNA[J]. Anal Chem， 2012, 84(4): 1 975-1 980.

[24] Wang Q, Wang H, Yang X H,etal. Multiplex detection of nucleic acids using a low cost microfluidic chip and a personal glucose meter at the point-of-care[J]. Chem Commun， 2014, 50(29): 3 824-3 826.