王文浩，丁 芳

（1. 宜春學院生命科學與資源環(huán)境學院，江西宜春 336000；2. 蘇州系統(tǒng)醫(yī)學研究所，江蘇蘇州 215000）

目前依賴于表型值的選擇在肉禽育種方面已經(jīng)取得了顯著進展，現(xiàn)代肉禽在產(chǎn)肉量和日增重等方面都有了明顯的改善[1-2]，但同時也引發(fā)體脂大量沉積、機體代謝紊亂、免疫力下降、死亡率增高等問題[3]。其中，體脂沉積過多嚴重影響了肉禽的肉質和產(chǎn)肉量，增加肉品加工難度，給生產(chǎn)者和消費者帶來巨大的損失。因此，控制肉禽體內脂肪過度沉積已經(jīng)成為家禽育種的一個主要目標[4-5]。

動物體內脂肪的形成包括脂肪細胞增殖（數(shù)目增加）和肥大（體積增大），脂肪細胞的過度增殖和分化往往會造成脂肪生成過量，從而引發(fā)機體脂肪過度沉積[2]。目前研究人員已陸續(xù)建立多個物種前脂肪細胞原代培養(yǎng)模型，并且針對脂肪細胞增殖和分化調控做了廣泛而細致的研究[6-7]。然而，禽類的脂肪分化研究相對落后，深入了解禽類脂肪分化的調控機理，有利于降低禽類腹脂沉積，為人類提供更加健康的畜禽產(chǎn)品，同時也能為動物遺傳育種與品種改良技術提供參考。本文主要綜述了禽類前脂肪細胞的分離培養(yǎng)、誘導分化方式及其分子調控網(wǎng)絡的研究進展，為深入了解禽類脂肪分化機制提供科學指導。

1 禽類前脂肪細胞的分離、體外培養(yǎng)與鑒定

前脂肪細胞的分離一般采用膠原酶消化的方式，無菌條件下獲得白色脂肪組織，經(jīng)過膠原酶消化、過濾、離心即可獲得基質血管部分，其中包含少量前脂肪細胞。剛接種的前脂肪細胞成分復雜，含有大量的血細胞以及少部分成熟脂肪細胞、巨噬細胞等，這些都可以經(jīng)換液或者傳代后去除，前脂肪細胞會變得更純、更均一。也可以采用天花板培養(yǎng)法，將剪碎的脂肪組織小塊貼在培養(yǎng)瓶頂部，經(jīng)過1～2周，脂肪組織周圍會慢慢長出未分化的前脂肪細胞，即去分化，該方法廣泛用于研究脂肪細胞去分化過程。有研究表明，天花板培養(yǎng)法雖然能分離獲得新的前脂肪細胞，但是該方法會抑制3T3L1前脂肪細胞成脂分化的能力，導致細胞內脂肪沉積降低[8]。因此，目前最常用的分離原代前脂肪細胞的方法是膠原酶消化法，在37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。有研究發(fā)現(xiàn)，39℃條件下，豬前脂肪細胞增殖能力更佳，37℃培養(yǎng)環(huán)境會抑制豬原代前脂肪細胞的增殖與分化能力[9]。禽類前脂肪細胞的體外分離培養(yǎng)比較晚。20世紀80年代，Cryer等[10]首次分離獲得了雞原代前脂肪細胞。利用這個模型，研究人員開始探索雞前脂肪細胞生長特性。2012年，He等[11]首次分離出鴨前脂肪細胞，檢測了脂肪酸結合蛋白（Fatty Acid Synthase，F(xiàn)ABP4）對脂肪分化相關基因表達的影響。隨后本課題組分離出北京鴨原代前脂肪細胞，并且圍繞細胞生長特性與誘導分化方式進行了系統(tǒng)的闡述[12]。前脂肪細胞的鑒定標準：第一，細胞能貼壁生長，形態(tài)為小三角形或梭形；第二，在特定的誘導條件下，梭形的前脂肪細胞可分化為圓形的脂肪細胞，細胞內沉積脂滴，并且能被油紅O染色變成紅色；第三，前脂肪細胞能特異性表達脂肪分化相關的某些標志基因，如FABP4等[11,13]。

與傳統(tǒng)的細胞系相比，體外分離的原代前脂肪細胞往往能更真實地反映體內環(huán)境，并且可以根據(jù)實驗需要，從不同部位、不同年齡的個體中分離出原代細胞開展實驗，因而研究更具有針對性和真實性。盡管如此，原代前脂肪細胞存在著明顯的缺點：第一，鴨脂肪組織中前脂肪細胞數(shù)量少，每次實驗需要犧牲多只動物才能獲得足夠多的前脂肪細胞；第二，雖然年齡較大的動物體內脂肪組織沉積更多，但是幼禽的脂肪細胞增殖能力較好，因此，一般選擇出生后1～2周的鴨作為實驗動物；第三，前脂肪細胞在體外培養(yǎng)的時間不宜過長，多次傳代會導致細胞生長變緩，誘導分化能力降低，因此一般用傳代4次以內的細胞進行實驗，以獲得較真實可靠的結果[13]。

2 禽類前脂肪細胞的誘導分化方式

20世紀以來，研究人員利用體外培養(yǎng)的前脂肪細胞或者細胞系，圍繞前脂肪細胞的誘導分化做了很多深入的研究。不同物種的前脂肪細胞的誘導分化方式不盡相同，對大多數(shù)物種而言，只需要加入誘導劑胰島素、地塞米松（DEX）和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX），即經(jīng)典的“激素雞尾酒”，前脂肪細胞就能分化為成熟的脂肪細胞。少數(shù)物種的前脂肪細胞分化需要同時添加一定量的羅格列酮或曲格列酮，刺激細胞成脂分化[14]。禽類前脂肪細胞體外分化的研究起步較晚，其誘導方法一直在探索中。早期研究發(fā)現(xiàn)，僅僅依靠經(jīng)典的“激素雞尾酒”，禽類前脂肪細胞并不能誘導分化，細胞內無脂滴沉積，而添加油酸后，胞內沉積較多脂滴，細胞能分化成熟[15]。其后Matsubara等[16]研究發(fā)現(xiàn)，僅添加脂肪酸混合物、轉鐵蛋白、胰島素和白蛋白就能誘導雞原代前脂肪細胞分化，說明外源脂肪酸是影響雞前脂肪細胞分化的關鍵因素。Shang等[17]進一步報道單獨添加油酸處理組，無論是否同時添加DEX都能很好地促進胞內脂滴的形成，細胞最終分化為成熟的脂肪細胞，證實油酸是雞前脂肪細胞誘導分化的關鍵誘導劑。本課題組早期圍繞鴨前脂肪細胞的誘導分化做了很多摸索實驗，發(fā)現(xiàn)同時添加激素雞尾酒和油酸，鴨前脂肪細胞能成功分化，而單獨添加油酸的情況下，細胞內也能沉積脂滴，脂肪分化相關基因表達上調[11-12]。以上2種誘導方式調控鴨前脂肪細胞分化的具體機制，目前還不清楚。

胰島素和DEX是大多數(shù)物種前脂肪細胞誘導劑主要成分，但是二者對雞前脂肪細胞分化沒有明顯影響，都不能促進脂肪沉積[17]，本課題組前期圍繞鴨前脂肪細胞開展的實驗結果也充分說明了這一點[13]。羅格列酮被證實能促進前脂肪細胞誘導分化。本課題的研究發(fā)現(xiàn)，羅格列酮能通過促進脂肪合成與脂解，最終促進鴨前脂肪細胞分化成熟[18]。雞前脂肪細胞誘導分化時，添加“激素雞尾酒”與一定量的羅格列酮或曲格列酮，細胞脂肪生成增多，且脂解水平更強，進一步證實羅格列酮能促進禽類脂肪細胞分化。值得注意的是，單獨添加油酸雖然能誘導雞前脂肪細胞分化，但是其細胞脂解能力很弱，而正常的脂解能力是成熟脂肪細胞的表現(xiàn)之一。以上研究結果表明“激素雞尾酒 ”與羅格列酮組合法是一種更有效的誘導方式，有利于禽類前脂肪細胞誘導分化為正常功能的脂肪細胞[19]。

禽類脂肪細胞分化的誘導方式不同于哺乳動物，原因可能與不同物種脂肪從頭合成的發(fā)生部位不同有關。脂肪從頭合成是指脂肪相關組織（肝臟和脂肪組織）利用非脂肪前體物（如糖代謝產(chǎn)生的碳水化合物），并進一步酯化為脂肪的過程。眾所周知，嚙齒類動物脂肪從頭合成主要在肝和脂肪組織[20]，豬牛羊等動物主要在脂肪組織合成脂肪[21]，而禽類的脂肪從頭合成主要發(fā)生在肝臟，然后通過脂蛋白運輸?shù)礁瓮?，促使脂肪沉積在脂肪組織中[22]。禽類脂肪組織本身合成脂肪的能力低下，因此，體外分離出來的前脂肪細胞需要添加外源脂肪酸才能開啟分化的過程。值得一提的是，有研究表明，油酸也能誘導鼠3T3-L1細胞分化為成熟脂肪細胞，但是分化出來的細胞胰島素敏感有一定的損壞，而經(jīng)“激素雞尾酒”正常誘導出來的脂肪細胞并未出現(xiàn)此現(xiàn)象[23]。油酸誘導禽類前脂肪細胞分化，是否也會損壞脂肪細胞胰島素敏感，這一點還有待證實。

3 禽類前脂肪細胞的分子調控

脂肪細胞的分化是一個復雜的分子調控過程，研究已發(fā)現(xiàn)并證實了多個轉錄因子能參與脂肪分化的調控[24]。其中最關鍵的轉錄調控因子包括過氧化物酶體增殖物激活受體家族（Peroxisome Proliferator-activated Receptors，PPARs）、CAAT增強子結合蛋白家 族（CCAAT/enhancer Binding Protein，C/EBPs）、固醇調節(jié)元件結合蛋白家族（Sterol Response Elementbinding Protein，SREBPs）等。這些轉錄因子在脂肪細胞分化過程中，通過影響靶基因表達量或者活性的變化，從而實現(xiàn)對脂肪細胞分化的調控作用[25]。

3.1 PPARγ PPARγ屬于PPARs家族，該家族包括α、β（δ）和γ 3個成員，通過與靶基因啟動子上游的過氧化物增殖體反應元件結合，發(fā)揮其轉錄調控作用。PPARγ主要在脂肪組織中表達，參與調控脂質代謝和脂肪分化。在脂肪細胞分化調控網(wǎng)絡中，PPARγ在脂肪細胞分化早期起關鍵作用，它先于大多數(shù)脂肪細胞特異性基因的表達[26]。研究證實，沒有任何一個因子能在缺失PPARγ的情況下開啟脂肪細胞的誘導分化過程，而且大部分脂肪分化因子都是通過激活PPARγ來發(fā)揮作用[27]。缺失C/EBPα基因的小鼠成纖維細胞，異位表達PPARγ后細胞能進行脂肪分化，而反過來卻不能分化。目前，缺失C/EBPα后，C/EBP家族其他成員是否能部分補償C/EBPα的功能以促進脂肪分化[28]，尚不清楚。

雞PPARγ含有5個剪切體，其開放閱讀框編碼PPARγ1和PPARγ2 2個PPARγ異構體。PPARγ1在雞腹部皮下脂肪組織中高度表達，并且在2～7周齡肥胖型雞脂肪組織表達顯著高于瘦肉型雞，說明它與雞脂肪沉積密切相關[29-30]。細胞水平上，用油酸誘導雞前脂肪細胞分化，PPARγ表達水平在分化后第9小時達到峰值，早于其他分化基因，推測該基因可能是調控雞脂肪分化早期的一個重要基因[15]。此外，PPARγ還能抑制雞前脂肪細胞增殖，使細胞出現(xiàn)生長抑制現(xiàn)象，從而促進前脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞，當干擾該基因表達時，雞脂肪細胞增殖能力增強，分化能力減弱，固醇調節(jié)元件結合蛋白1（sterol regulatory element binding factor1，SREBP1)、FABP4、 脂 蛋 白 脂 肪 酶（Lipoprteinlipase，LPL）等基因表達量均下降[31]。

鴨有PPARγ1與PPARγ2 2個異構體，前者可能與過氧化物酶體增殖有關，后者可能主要調控脂質代謝。細胞水平上，PPARγ的表達量在鴨前脂肪細胞誘導后第3天達到峰值，早于C/EBPα和FABP4，推測鴨PPARγ在脂肪分化早期起作用[12]。個體水平上，雛鴨靜脈注射PPARγ特異性siRNA，第21和第35天鴨腹部皮下脂肪沉積量顯著降低，脂肪分化關鍵基因LPL和FABP4表達都明顯降低，表明PPARγ對鴨脂肪沉積有重要的調控作用，是脂肪分化的一個關鍵轉錄因子[32]。

3.2 C/EBP家族 C/EBP家族包括多個成員，其中與脂肪分化關系密切的主要是C/EBPα、β與δ。C/EBPα的表達早于其他基因，是誘導脂肪分化必不可少的。雞前脂肪細胞誘導分化后，C/EBPα在誘導后24 h表達量達到峰值，而C/EBPβ與C/EBPδ的表達稍晚，分別在誘導后第48、36小時達到峰值，說明C/EBPα對于開啟前脂肪細胞分化具有重要作用[33]。研究證實，雞C/EBPα啟動子上存在SREBP1與C/EBPβ的結合位點，雞胚成纖維細胞DF1細胞系過表達二者時，都會降低雞C/EBPα轉錄活性[34]。與此相反的是，3T3-L1前脂肪細胞過表達SREBP1或C/EBPβ，都會促進C/EBPα基因的轉錄[35]。產(chǎn)生這種結果的原因可能是由于不同物種前脂肪細胞的遺傳背景不同，該差異產(chǎn)生的具體分子機制還有待進一步研究。此外，研究報道 PPARγ啟動子上存在多個C/EBPα和C/EBPβ結合位點，雞胚成纖維細胞系過表達C/EBPα和C/EBPβ都能刺激PPARγ基因啟動子活性[34]。早期研究發(fā)現(xiàn)， C/EBPα可以通過直接結合雞PPARγ啟動子上的結合位點，進而激活PPARγ的轉錄。這些結果表明雞C/EBPα和C/EBPβ能通過直接結合PPARγ啟動子，促進后者的活化[36]。過表達PPARγ能促進下游靶基因FAS啟動子活性提高，但是對C/EBPα啟動子活性無明顯影響[34]?？梢姡uC/EBPα和C/EBPβ能調控PPARγ轉錄活性，促進下游靶基因表達，而反過來PPARγ對C/EBPα和C/EBPβ沒有直接的調控作用。另外，有研究報道，雞胚胎成纖維細胞異位表達C/EBPα或者PPARγ后，都能轉分化為類脂肪細胞，具體表現(xiàn)為細胞內有脂滴沉積，細胞表達脂肪分化標志基因FABP4，說明C/EBPα和PPARγ這2個轉錄因子對開啟禽類前脂肪細胞分化起關鍵作用[37]。

3.3 Krüppel樣因子家族（Krüppel-like Factors，KLFs）KLFs通過結合到靶基因啟動子CACCC/GC/GT區(qū)域，調控眾多基因的表達，它們參與調控一系列細胞生物學過程，包括胚胎發(fā)育、脂肪分化、脂質代謝、胰島素抵抗、心血管疾病等[38-39]。

KLF7是KLF家族中的一員，在調控哺乳動物脂質代謝方面發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，KLF7在雞腹脂中的mRNA表達量與雞腹脂含量顯著相關，它在瘦肉型雞腹脂中的表達量明顯高于肥胖型雞[40-41]。雞前脂細胞過表達KFL7導致LPL、C/EBPα與FAS基因啟動子活性降低，阻礙前脂肪細胞分化為脂肪細胞。干擾KLF7基因表達，導致FABP4、PPARγ、C/EBPα啟動子顯著增強[41]。 由此可見，KLF7是抑制雞脂肪分化的一個基因。過表達與干擾KLF7基因表達的研究結果都證實，KLF7能直接影響C/EBPα的活性，由此推斷KLF7可能是通過調控下游靶基因C/EBPα，進而影響雞前脂肪細胞增殖與成脂分化過程。

KLF2也能調控脂肪分化。研究發(fā)現(xiàn)，KLF2在出生后1周雞腹脂中的表達量最高，隨后表達量降低，但是其表達量與不同品系雞脂肪沉積無顯著關聯(lián)[42]。 KLF2在雞前脂肪細胞分化過程中的表達呈現(xiàn)逐漸降低的模式，雞前脂肪細胞過表達KLF2導致PPARγ、C/EBPα、FABP4基因表達都下降，最終抑制脂肪分化。由此可見，KLF2通過抑制轉錄因子PPARγ、C/EBPα的表達而抑制雞脂肪細胞分化[42]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達KLF2對雞PPARγ和C/EBPα啟動子轉錄活性有著不同的影響，它能激活其中2個不同長度的PPARγ啟動子活性，3個C/EBPα啟動子活性，這說明KLF2對二者啟動子活性的影響可能與研究者構建的啟動子長度有關[43]。

KLF3在雞脂肪組織中也高度表達，過表達KLF3導致雞前脂肪細胞中C/EBPα、FABP4、FAS和LPL啟動子活性都顯著降低，但是PPARγ活性會增加，推測該基因可能通過影響C/EBPα轉錄活性，從而實現(xiàn)對雞脂肪細胞分化的調控。對KLF3進行定點突變，發(fā)現(xiàn)PVDLT位點發(fā)生的ASP突變與KLF3活性顯著相關[44]。KLF5在雞脾臟中表達量最高，腹脂中表達量很低[45]。誘導雞前脂肪細胞分化過程中，KLF5表達量先劇烈降低，分化12 h后出現(xiàn)大幅上升。誘導雞前脂肪細胞分化過程中，其表達量呈現(xiàn)逐步上升的趨勢[45]。目前，關于KLF家族在禽類脂肪分化中的具體作用機理都還不太清楚，有待進一步研究探討。

3.4 其他基因 FABP4是脂肪細胞分化中期、晚期的標志基因，它能促進脂肪酸的轉運擴散，參與調控脂肪的生成和溶解的生化循環(huán)，因而在脂肪酸運輸與代謝中起重要作用。FABP4的表達受PPARγ調控，作為后者的靶基因之一，F(xiàn)ABP4在細胞分化晚期表達量最高，F(xiàn)ABP4能為甘油三酯的形成提供脂肪酸，從而促進脂肪細胞肥大，誘導脂肪形成。雞前脂肪細胞誘導分化時，過表達FABP4導致細胞釋放游離脂肪酸增加，促進脂解，同時脂肪沉積顯著增加。進一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達FABP4能引起PPARγ表達在分化不同階段的表達量都增高，推斷FABP4是通過影響PPARγ途徑而調控雞脂肪分化的[46]。但是相同條件下誘導雞前脂肪細胞分化，當干擾FABP4表達后，細胞脂肪分化、脂解并沒出現(xiàn)明顯的變化 ，具體原因有待進一步探討[46]。FABP4基因在鴨脂肪組織中高度表達，在其他組織中表達量很低[11]。細胞水平上，油酸能促進FABP4基因表達量大幅上升，用油酸誘導鴨前脂肪細胞分化時，干擾FABP4基因表達導致與脂肪分化相關基因表達量都出現(xiàn)明顯的降低，如FAS、LPL和PPARγ等，導致細胞成脂分化受阻，說明FABP4對于鴨脂肪分化起重要的調控作用[11]。

脂肪酸運輸?shù)鞍?（Fatty Acid Transport Protein 1，F(xiàn)ATP1）是脂肪性運輸?shù)鞍准易逯械囊粏T，能幫助長鏈游離脂肪酸進出細胞，通過調控脂肪酸?；饔茫瑥亩绊懠毎舅岽x與脂肪沉積[47-48]。雞前脂肪細胞轉染FATP1基因特異性siRNA后，一方面，PPARγ、C/EBPα和FAS等基因mRNA表達、蛋白表達量都出現(xiàn)顯著降低，前脂肪細胞分化受阻；一方面，細胞凋亡因子Caspase3與Bax都被激活，產(chǎn)生細胞凋亡。以上結果表明，F(xiàn)ATP1基因在雞前脂肪細胞生長與誘導成脂分化過程中都有重要的作用[49]。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA能夠調控脂肪分化，對代謝相關組織發(fā)育與功能起重要作用。Wang等[2]通過正向選擇基因和差異表達基因集成法，篩查出了10個控制鴨脂肪沉積的差異基因，具體作用機理有待進一步驗證。Zhang等[50]利用RNA測序方法，檢測雞腹部皮下脂肪組織分離的前脂肪細胞分化過程中長鏈非編碼RNA和mRNA表達情況，發(fā)現(xiàn)K2簇的基因可能在雞脂肪分化中起關鍵作用。同時該研究團隊圍繞雞肌肉脂肪組織中的前脂肪細胞，也篩查出了一些與肌內脂肪細胞分化相關的長鏈非編碼RNA，發(fā)現(xiàn)10個基因、9個長鏈非編碼RNA與雞肌內脂肪細胞分化密切相關。通過此方法，研究者發(fā)現(xiàn)了一些與肌內脂肪分化相關的經(jīng)典信號途徑，以及一些新的信號通路[51]。以上研究結果，為今后深入了解禽類不同部位脂肪分化提供了新的有力依據(jù)。

4 小 結

脂肪細胞分化是一個復雜的生物學過程，受眾多轉錄因子的共同調控。禽類脂肪分化發(fā)展相對落后，但經(jīng)過眾多探索工作，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并證實了一些關鍵轉錄因子、標志基因影響禽類脂肪分化的機理，但仍有一些問題需要進一步研究。近年來，利用最新的測序技術，研究人員篩查到了一些新的特異性microRNA、長鏈非編碼RNA，并初步證實了它們也能參與脂肪分化調控。未來的研究可以考慮深入挖掘這些特異性RNA影響脂肪分化的作用機理，全面詮釋脂肪分化的調控網(wǎng)絡，為畜禽品質改良和動物遺傳育種技術提供科學基礎。