衛(wèi)佳寧，續(xù)國強，高繼萍，宋國華

(山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物與人類疾病動物模型山西省重點實驗室，太原 030001)

口腔癌是世界上最常見的第十一種惡性腫瘤，尤其是在發(fā)展中國家，在發(fā)病總數(shù)中排名第九[1]。雖然隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)的死亡率保持相對不變。但統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)口腔癌患者趨于年輕化，該癌癥的總體預(yù)后較差，生存率約55%～65%[2]。這可能是由于延遲診斷，早期診斷是降低口腔癌死亡率的關(guān)鍵，目前尋找一種新的生物標(biāo)志物和治療目標(biāo)是至關(guān)重要的。環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)在哺乳動物中廣泛存在[3]，通過共價鍵連接3’和5’末端形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)源性非編碼RNA[4]，因其閉環(huán)結(jié)構(gòu)能夠抗核糖核酸酶的降解，在細胞和組織的發(fā)育階段能夠穩(wěn)定的表達[5]。一些研究發(fā)現(xiàn)，circRNA可參與RNA蛋白復(fù)合物的形成和RNA-RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[6]，可作為一個病毒或病毒復(fù)制的模板，在RNA加工反應(yīng)中作為順式作用元件起作用，如snoRNA基因和miRNA海綿[7]。研究表明，circRNA參與一些疾病的發(fā)生發(fā)展[8]，尤其在腫瘤方面。因此，從circRNA角度研究口腔鱗癌致病機理及治療方案具有重要意義。

1 CircRNA的生物合成、分類及作用機制

1.1 CircRNA的生物合成

CircRNA是前體mRNA(pre-mRNA)通過可變剪切加工產(chǎn)生，廣泛且穩(wěn)定地存在于所有的真核生物中的一類非編碼RNA[9-10]。大部分的circRNA是由外顯子序列構(gòu)成，在不同的物種中具有保守性，同時存在組織及不同發(fā)育階段的表達特異性。CircRNA也可以通過非經(jīng)典剪接方式進行反向剪接形成。2013年，Jeck等[5]在《RNA》中提出circRNA產(chǎn)生的兩種模型：套索驅(qū)動環(huán)化和內(nèi)含子驅(qū)動環(huán)化。套索驅(qū)動環(huán)化模型認為pre-mRNA的轉(zhuǎn)錄過程中由于RNA發(fā)生了部分折疊，拉近了原本非相鄰的外顯子，從而發(fā)生了外顯子跳躍，使得被跨越的區(qū)域形成了環(huán)形RNA中間體，進一步通過套索剪接形成由外顯子構(gòu)成的環(huán)形RNA分子。另一種模型認為，內(nèi)含子區(qū)域的反向互補序列導(dǎo)致內(nèi)含子區(qū)域配對，介導(dǎo)反向剪接，從而形成環(huán)形RNA分子[11]。

1.2 CircRNA的分類

環(huán)狀RNA的產(chǎn)生多種多樣，可來源于不同的基因，也可由同一基因產(chǎn)生。根據(jù)來源可以分為3類：存在于細胞質(zhì)中僅由外顯子構(gòu)成的環(huán)狀RNA(exonic circRNA)；置于細胞核中僅由內(nèi)含子構(gòu)成的環(huán)狀RNA(intronic circRNA)[12]；包含外顯子之間的內(nèi)含子的circRNA(exon-intro circRNA)[13]。

1.3 CircRNA的作用機制

CircRNA最初被認為是mRNA拼接錯誤的副產(chǎn)品，具有穩(wěn)定、多樣化和保守的特點。近期研究顯示，circRNA在不同物種中起到miRNA“分子海綿”的作用，稱之為競爭性內(nèi)源RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)，能競爭性結(jié)合疾病相關(guān)的miRNA，解除miRNA對其靶基因的抑制作用，上調(diào)靶基因的表達水平，從而在疾病調(diào)控中發(fā)揮重要作用。CircDOCK1通過作為ceRNA調(diào)節(jié)BIRC3表達并參與OSCC細胞凋亡的過程[14]。Circ_100290通過充當(dāng)miR-29的“分子海綿”在口腔癌中發(fā)揮作用[15]。CircHIPK3作為miR-124海綿，調(diào)節(jié)靶標(biāo)水通道蛋白3(AQP-3)表達，AQP-3進而促進細胞增殖和遷移[16]。CircRNA也可與lncRNA競爭性結(jié)合miRNA。Li等[17]通過GO分析和KEGG分析發(fā)現(xiàn)，在生殖干細胞中l(wèi)ncRNA Meg3和cirRNA Igf1r可以與miRNA-15a-5p競爭結(jié)合增加靶基因InhA、ACSL3、KIF21B和IGFBP2的表達。這些發(fā)現(xiàn)為lncRNAs和circRNAs提供了新的視角，為將來對生殖干細胞中l(wèi)ncRNAs和circRNAs調(diào)控機制的研究奠定了基礎(chǔ)。

2 CircRNA與口腔鱗癌

2.1 口腔鱗癌中充當(dāng)miRNA海綿作用

CircRNA可以與miRNA結(jié)合，從而阻止miRNA沉默，因此circRNA也稱miRNA海綿[18-19]。有研究表明[3, 7, 14-15]，circRNA_100290、circDOCK1、circRNA BANP和circRNA ITCH在口腔癌中通過miRNA的海綿參與發(fā)病機制。

2.1.1 CircRNA_100290

Chen等[15]使用微陣列分析對OSCC中的circRNA進行了全面研究，鑒定出在OSCC組織和非癌組織之間差異表達的circRNAs，發(fā)現(xiàn)circ_100290在OSCC發(fā)展中起著重要的調(diào)節(jié)作用。CircRNA_100290在口腔癌組織中表達上調(diào)，通過充當(dāng)miR-29家族成員的“分子海綿”來調(diào)節(jié)基因表達。CircRNA_100290與OSCC細胞在體外和體內(nèi)的增殖相關(guān)。他們還發(fā)現(xiàn)circRNA_100290在OSCC組織中上調(diào)并與CDK6共表達。通過使用circRNA_100290特異性小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)敲低circRNA_100290的表達水平，檢測OSCC細胞系中G1/S期阻滯，抑制細胞增殖并降低CDK6的表達。通過熒光素酶報告基因檢測，觀察到circRNA_100290直接與miR-29家族成員結(jié)合，包括miR-29a、miR-29b和miR-29c。進一步EGFP/RFP報告分析顯示CDK6是miR-29b的直接靶標(biāo)?？傊?，circRNA_100290可能作為ceRNA通過抑制miR-29b家族成員來調(diào)節(jié)CDK6表達。這表明circRNA可能在OSCC中發(fā)揮調(diào)節(jié)功能，可作為OSCC治療的潛在靶點。進一步的研究顯示circRNA_100290通過攜帶miR-29家族成員來發(fā)揮其調(diào)控功能，以減少CDK6的表達，CDK6也直接被miR-29家族靶向。它表明circRNA_100290和CDK6 mRNA是由miR29家族連接的一對ceRNA。

2.1.2 CircDOCK1

CircDOCK1為環(huán)狀RNA鳥苷酸交換因子，先前有研究顯示[20]通過TGF-β處理，circDOCK1的表達降低，而circDOCK1的靶基因mRNA表達增加2倍。此外TGF-β處理可以誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transformation，EMT)，表明circDOCK1的功能之一可以誘導(dǎo)上皮細胞mRNA下調(diào)，從而保持細胞穩(wěn)定性。Wang等[14]通過用TNF-α刺激CAL-27細胞建立凋亡模型，使用高通量微陣列從細胞凋亡模型和正常CAL-27細胞中獲得差異表達的circRNA譜，發(fā)現(xiàn)has_circ_100721(circDOCK1)過表達并且敲低circDOCK1表達水平可導(dǎo)致細胞凋亡率的增加。他們利用多種生物信息學(xué)方法，預(yù)測了circRNA、miRNA和基因之間的相互作用，并構(gòu)建了circDOCK1/miR-196a-5p/BIRC3網(wǎng)絡(luò)，確定circDOCK1與miR-196a-5p通過與BIRC3競爭，最終調(diào)節(jié)細胞凋亡而相互作用。用siRNA沉默circDOCK1和模擬物上調(diào)miR-196a-5p的表達，導(dǎo)致OSCC細胞中細胞凋亡增加并減少BIRC3形成，并通過qRT-PCR方法比較口腔鱗狀細胞癌組織及癌旁組織中的circDOCK1，miR-196a-5p和BIRC3的表達進一步證實了此結(jié)果。最后得出結(jié)論，circDOCK1通過在OSCC中靶向BIRC3抑制miR-196a-5p來抑制細胞凋亡。

2.1.3 CircRNA BANP和circRNA ITCH

研究人員一直在探索控制牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells，PDLSC)成骨分化的分子機制。研究表明，circRNA參與成骨分化[3, 7]。CircRNA BANP和circRNA ITCH分別為環(huán)狀RNA酸性神經(jīng)肽和環(huán)狀RNA泛素連接蛋白。CircRNA BANP和circRNA ITCH可能與miRNA-34a和miRNA-146a相互作用以通過MAPK途徑調(diào)節(jié)PDLSC成骨分化。雖然有數(shù)種lncRNAs、circRNAs和miRNAs被認為參與了PDLSC成骨分化，但是關(guān)于它們潛在的網(wǎng)絡(luò)和功能的數(shù)據(jù)并不多。為了充分了解ceRNA對PDLSC成骨分化的影響，整合lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA競爭性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)至關(guān)重要。利用Illumina HiSeq2000開發(fā)RNA測序(RNA-seq)，以全面鑒定正常和成骨誘導(dǎo)性PDLSCs中差異表達的lncRNA和circRNA。使用qRT-PCR進一步證實了代表性的lncRNA和circRNA。最后，基于miRanda預(yù)測了lncRNA、circRNA、miRNA和mRNA的ceRNA網(wǎng)絡(luò)，并通過GO分析和KEGG分析研究了它們的潛在調(diào)控作用。CeRNA網(wǎng)絡(luò)表明，TCONS_00212979、TCONS_00212984、circRNA BANP和circRNA ITCH可能與miRNA-34a和miRNA-146a相互作用以通過MAPK途徑調(diào)節(jié)PDLSC成骨分化[21]。研究結(jié)果可能為探索PDLSC成骨分化的分子機制提供新的證據(jù)。

2.2 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用

Li等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在人類HeLa細胞中存在與RNA聚合酶II相關(guān)的circRNAs。在這些circRNA中，外顯子被環(huán)化，內(nèi)含子在外顯子之間“保留”，可稱它們?yōu)橥怙@子-內(nèi)含子circRNA或EIciRNA(exon-intron circRNA)。EIciRNA主要定位于核內(nèi)，與U1 snRNP相互作用并促進其親本基因的轉(zhuǎn)錄。他們的研究結(jié)果揭示了circRNA在調(diào)節(jié)細胞核中基因表達中的新作用，其中EIciRNAs增強其順式的親本基因表達，并突出了通過U1 snRNA和EIciRNAs之間的特定RNA-RNA相互作用進行轉(zhuǎn)錄控制的調(diào)控策略[22]。

2.3 生物標(biāo)志物

據(jù)報道，circRNA BANP和circRNA ITCH有助于致癌并可能作為癌癥生物標(biāo)志物[23-24]。CircRNA_100290作為miR-29家族成員的海綿起作用，在口腔癌中起到CDK6的ceRNA的作用[15]，circDOCK1通過作為ceRNA調(diào)節(jié)BIRC3表達并參與OSCC細胞凋亡的過程[13]。因此，circRNA_100290和circDOCK1可能成為OSCC的新型潛在生物標(biāo)志物和治療靶點。CircRNA參與多種病理狀態(tài)，包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病[25-26]、血液病[27]、軟骨退化[28]、先天性巨結(jié)腸病[29]和多種癌癥，這可以作為有前途的診斷生物標(biāo)志物和治療靶點。與miRNA和lncRNA相比，circRNA具有序列保守性，生物學(xué)穩(wěn)定性和組織特異性特點，因此circRNA被認為是有希望的生物標(biāo)志物和治療靶點，并且可能在基因表達的調(diào)節(jié)中發(fā)揮潛在的功能。

3 展望

近幾年來，circRNA具有充當(dāng)miRNA分子“分子海綿”、調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、與蛋白質(zhì)相互作用、吸附蛋白質(zhì)以及參與蛋白質(zhì)的翻譯等功能，且能穩(wěn)定存在于血清等特性。雖然目前對circRNA的研究并不是很多，但隨著RNA測序技術(shù)的迅速發(fā)展，circRNA這個未來之星在口腔鱗癌的診斷和預(yù)后治療方面有很大的發(fā)展前景。從circRNA入手挖掘新的生物標(biāo)志物及circRNA在口腔中的潛在功能有助于口腔癌的早發(fā)現(xiàn)、早治療。目前部分circRNA已被證實與腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移和患者的預(yù)后相關(guān)。隨著生物信息學(xué)方法及實驗技術(shù)手段不斷成熟，大數(shù)據(jù)分析的廣泛應(yīng)用，挖掘新數(shù)據(jù)、篩選具有生物標(biāo)記的circRNA、結(jié)合circRNA-miRNA-mRNA機制及circRNA-lncRNA-mRNA機制分析疾病通路對于研究口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展進程具有廣闊的發(fā)展前景。