張文舉，楊 智，王曉圓

（1.吉林省梨樹縣孤家子鎮(zhèn)畜牧站動物檢疫監(jiān)督所，吉林 梨樹 136506；2. 安徽省太和縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，安徽 太和 236600；3.吉林省吉林市船營區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，吉林 吉林132000）

1 介紹

基因編輯是指通過基因工程技術(shù)對生物體的特定基因進(jìn)行精確改造，包括刪除，替換或插入單個核苷酸或某段DNA序列，以達(dá)到預(yù)期的基因型或表型。目前，應(yīng)用較廣泛的基因編輯技術(shù)主要有三類，包括鋅指核酸酶（Zincfingernucleases,ZFNs）、類轉(zhuǎn)錄激活因子核酸酶（Transcriptionactivatorlikeeffectornucleases,TALENs）和規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列相關(guān)核酸酶（Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR/Cas）。現(xiàn)如今應(yīng)用最廣泛的基因編輯技術(shù)為CRISPR/Cas9系統(tǒng)，被廣泛地應(yīng)用到生物學(xué)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)和臨床等多個領(lǐng)域，用該技術(shù)制備基因編輯動植物等已有數(shù)十種，且效率高，速度快。在動物育種、醫(yī)學(xué)模型、器官移植和臨床治療等領(lǐng)域都表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用價值。在CRISPR/Cas系統(tǒng)尚未問世以前，制備基因編輯動物是非常困難的，因為成本高、周期長、操作繁瑣，尤其是制備大動物豬、牛、羊等。在科研人員的不斷努力下，使得CRISPR/Cas系統(tǒng)面向世人，才把制備基因編輯動物變得簡單容易，尤其是基因編輯豬。隨著人們生活水平提高，逐漸對豬肉的品質(zhì)有更高的需求，如瘦肉率、肌內(nèi)脂肪、酸堿度和肉色等性狀。需求的增加導(dǎo)致越來越多的豬育種人員及大型養(yǎng)殖企業(yè)采用基因編輯豬育種，以滿足市場和人們的需求。豬與人的親緣關(guān)系近，體型大小和生理病理等特征與人相似，是比較合適的醫(yī)療模型和器官移植供體。因此，世界各地的科研工作者不斷地利用基因編輯技術(shù)制備基因編輯豬。而我國是制備基因編輯豬最多的國家，已經(jīng)在豬育種，醫(yī)療模型上取得了突破的進(jìn)展。文章將結(jié)合基因編輯豬在各領(lǐng)域的應(yīng)用狀況，存在的問題及潛在的應(yīng)用前景進(jìn)行闡述。

2 新型基因編輯技術(shù)

在科研人員的不斷努力下，基因編輯技術(shù)迅速發(fā)展，從傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)發(fā)展到新型基因編輯技術(shù)，技術(shù)體系被不斷地完善。從傳統(tǒng)的效率低、成本高、周期長和操作繁瑣到新型的效率高、成本低、周期短和操作簡單，使得基因編輯技術(shù)趨于簡單化，規(guī)?；?，在制備基因編輯動物方面也變得輕而易舉。如今，全球多家大型育種公司和企業(yè)均已利用新型基因編輯技術(shù)制備規(guī)模化的基因編輯豬進(jìn)行育種。各科研院所也制備了數(shù)十種基因編輯動物模型。

2.1 鋅指核酸酶技術(shù)在基因編輯豬上的應(yīng)用

鋅指核酸酶（Zincfingerproteins，ZFPs）又稱鋅指蛋白核酸酶（ZFPNs），是第一代人工合成的核酸內(nèi)切酶。由鋅指蛋白識別DNA與靶標(biāo)結(jié)合，通過FokI內(nèi)切酶對靶標(biāo)進(jìn)行切割，最終導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂[1]。ZFN技術(shù)是第一種能夠誘導(dǎo)非同源末端連接或同源重組途徑的基因敲除或基因敲入技術(shù)，該技術(shù)打破了無法制備對特定基因進(jìn)行編輯的基因編輯豬。2010年，Watanabe等用ZFN技術(shù)成功制備了基因編輯豬，這是首次利用ZFN技術(shù)得到的基因編輯豬[2]。2011年，Yang等利用ZFN技術(shù)制備了敲除PPAR-γ基因豬模型用來研究人的心血管疾病[3]。2013年，Kwon等利用ZFN技術(shù)制備了CMP-Neu5Ac基因編輯豬，為異種器官移植提供了一個良好的模型。在鋅指核酸酶技術(shù)問世之初，曾被大量的優(yōu)化和改造[4]，但由于構(gòu)建步驟比較繁瑣，耗時長，成本高，最終應(yīng)用到基因編輯動物方面應(yīng)用較少。

2.2 類轉(zhuǎn)錄激活因子核酸酶技術(shù)在基因編輯豬上的應(yīng)用

類轉(zhuǎn)錄激活因子核酸酶技術(shù)（Transcriptionactivatorlikeeffectornucleases,TALENs）， 俗稱TALEN，是第二代人工合成核酸內(nèi)切酶。它是由可識別靶標(biāo)的TAL效應(yīng)因子與FokI內(nèi)切酶組合而成，可對靶標(biāo)實行定點修飾[5]。與ZFN技術(shù)累似，通過蛋白識別DNA序列，利用FokI內(nèi)切酶對基因組進(jìn)行剪切。相比ZFN技術(shù)，TALEN技術(shù)應(yīng)用更為廣泛，且效率高[6]。因此，TALEN技術(shù)在豬上的應(yīng)用相對較多。2012年，Carlson利用TALEN技術(shù)獲得了LDL受體基因編輯豬，為家族性高膽固醇血癥提供了醫(yī)療研究模型[7]。2014年，Huang等利用TALEN技術(shù)制備了RAG1/2基因敲除豬，成功制備了重癥免疫缺陷豬模型[8].2014年，賴良學(xué)實驗室人員利用TALEN技術(shù)在Rosa26位點成功制備了基因敲入工豬模型，用以追蹤豬細(xì)胞譜系[9]。雖然TALEN技術(shù)相比ZFN技術(shù)構(gòu)建容易，但TAL蛋白無法識別一些特定的序列，且工作量較大，這使得TALEN技術(shù)在制備基因編輯豬上有一定的限制。

2.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因編輯豬上的應(yīng)用

CRISPR/Cas9是第三代人工核酸內(nèi)切酶，與ZFN技術(shù)和TALEN技術(shù)最大區(qū)別在于識別靶標(biāo)不同，CRISPR/Cas9是通過向?qū)NA與靶標(biāo)互補(bǔ)配對，招募Cas9蛋白對基因組進(jìn)行切割[10]。CRISPR/Cas9自2003年問世以來，被世界各地大小實驗室廣泛使用，相比ZFN和TALEN，CRISPR/Cas9系統(tǒng)操作更為簡單快速、成本低和效率高，很有可能完全取代ZFN技術(shù)和TALEN技術(shù)。經(jīng)過幾年的發(fā)展和改進(jìn)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)猶如“上帝的手術(shù)刀”，在農(nóng)業(yè)，醫(yī)療和臨床等諸多領(lǐng)域都體現(xiàn)出是一種前所未有的分子生物學(xué)研究手段的革新技術(shù)。

2.3.1 基因編輯豬應(yīng)用到豬育種

基因編輯豬育種能夠?qū)ωi進(jìn)行快速的遺傳改良，短時間內(nèi)就能夠獲得自然狀態(tài)下經(jīng)過長期自然選擇才能獲得的表型。2015年，Wang等利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得了MSTN基因敲除豬，陽性豬出現(xiàn)了明顯的雙肌臀表型[11]。MSNT基因突變表現(xiàn)雙肌臀的現(xiàn)象在自然環(huán)境中需要經(jīng)過長期的自然選擇才能獲得，然而通過基因編輯技術(shù)，在短短的幾個月就能獲得大量的突變?nèi)后w，極大地縮短了豬育種進(jìn)程。2017年，Burkard等人利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除豬藍(lán)耳病受體CD163基因的一個結(jié)構(gòu)域，最終實驗證明敲除豬能夠抵抗豬藍(lán)耳病毒的感染[12]。自此之后，多家育種公司和科研院所開啟了抗豬藍(lán)耳病基因編輯豬育種，并成功獲得了抗豬藍(lán)耳病豬群體。2017年，Zhang等利用CRISPR/Cas9技術(shù)培育出了基因編輯抗寒豬，研究人員將小鼠的UCP1基因定點敲入到豬的基因組中，實現(xiàn)了UCP1基因在豬白色脂肪組織的特異表達(dá)，減少脂肪沉積，增加瘦肉率，同時提高了豬的抗寒能力[13]。2018年，周琪院士和王皓毅研究員團(tuán)隊利用CRISPR-Cas9技術(shù)制備了IGF2基因第三個內(nèi)含子一個保守的SNP位點編輯巴馬豬。與野生型巴馬豬相比，IGF2基因編輯豬表現(xiàn)出體重、胴體重和瘦肉率等方面都顯著提高[14]。2018年，Zhang等利用CRISPR/Cas9技術(shù)將四個來自微生物的酶類基因轉(zhuǎn)入豬基因組中，培育出污染顯著減少、節(jié)約糧食且生長快速的基因編輯豬[15]。

2.3.2 基因編輯豬應(yīng)用到醫(yī)療模型

基因編輯豬疾病模型的建立主要是為了研究人類疾病。除了豬以外，模式動物小鼠也是一種很好的人類疾病模型。與小鼠相比，豬的習(xí)性，器官和組織等與人類具有較高的相似性，因此豬作為疾病模型研究人類疾病是比較理想的模型。2014年，Hai等利用CRISPR/Cas9技術(shù)制備了vWF基因敲除豬，獲得了血友病基因編輯模型豬[16]。同年，Peng等利用CRISPR/Cas9技術(shù)將人白蛋白基因定點敲入豬的基因組中，從而達(dá)到能夠從豬的血清中獲得人的白蛋白[17]。2015年，Chen等利用該技術(shù)獲得了B細(xì)胞缺陷型基因編輯豬[18]。2018年，Yan等首次利用CRISPR/Cas9技術(shù)和體細(xì)胞核移植技術(shù)，成功培育出世界首例亨廷頓舞蹈病基因敲入豬。它能精準(zhǔn)地模擬出人類神經(jīng)退行性疾病，為治療“亨廷頓舞蹈病”、老年癡呆等疾病提供了理想的動物模型[19]。

2.3.3 基因編輯豬應(yīng)用到異種器官移植

與其他模式動物相比，豬的生理特征更與人類相似，尤其是器官大小與功能非常接近。因此通過制備基因編輯豬，對異種器官移植研究具有重要價值。2014年，Sato等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除豬的α-GalT基因，消除了豬和人的異種器官移植的排斥問題，為人類器官移植探究提供了很好的模型[20]。2015年，哈佛大學(xué)和eGenesis公司的Yang等研究人員利用CRISPR/Cas9技術(shù)，敲除了豬內(nèi)源的PERVs基因，解決了豬器官用于人體移植的重大難題[21]。

3 問題與展望

基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)是現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的一大飛躍，每一代新的核酸內(nèi)切酶的出現(xiàn)都會帶來極大的突破，使得制備基因編輯動物的主要困難不再受技術(shù)因素的制約。如今，科研人員很容易能夠獲得理想的基因編輯動物模型，從模式動物的小鼠到豬，羊和牛等大的哺乳動物，甚至靈長類的基因編輯猴子。然而，一個強(qiáng)大的技術(shù)往往都伴隨有致命的缺點，限制基因編輯動物發(fā)展的最大缺點是脫靶問題。所謂脫靶就是在對靶基因進(jìn)行剪切的同時，往往可能在生物體基因組的未知區(qū)域進(jìn)行剪切，而且很難進(jìn)行檢測，最終可能造成細(xì)胞毒性。若是基因編輯動物出現(xiàn)脫靶現(xiàn)象，可能對動物個體造成無法預(yù)測的表型。迄今為止，制備的基因編輯豬均沒有進(jìn)行過系統(tǒng)的脫靶檢測，即使外觀，生理生化指標(biāo)等檢測正常，但基因組某些區(qū)域是否被剪切仍是未知。

制備基因編輯豬最常用到的是體細(xì)胞核移植技術(shù)，目前該技術(shù)最大的缺點仍然是效率很低。雖然通過直接注射受精卵的效率相對較高，但是獲得的F0代基因編輯豬大多數(shù)都是嵌合體，為了獲得純合子，需要經(jīng)過配種擴(kuò)群。因此，制備基因編輯豬的成本仍然是很高的，制約了規(guī)模化養(yǎng)殖的進(jìn)程。

轉(zhuǎn)基因食品安全性是制約基因編輯動物推廣的最大制約因素。理論上基因編輯動物不屬于轉(zhuǎn)基因范疇，很多基因編輯動物是模仿自然突變，只是通過人為手段較快地獲得突變個體。近幾年，轉(zhuǎn)基因三文魚和基因編輯蘑菇相繼上市，說明了人們對轉(zhuǎn)基因食品逐漸變得越來越認(rèn)可。各個國家也根據(jù)本國的國情制定了相應(yīng)的評價標(biāo)準(zhǔn)和體系，相信在不久的將來轉(zhuǎn)基因食品都能被公眾所認(rèn)可。

基因編輯技術(shù)革新了分子生物學(xué)的研究手段，為動物育種，疾病治療和臨床應(yīng)用帶來了前所未有的希望。在科研人員的不斷探索和努力下，基因編輯技術(shù)體系會不斷地得到完善，新的基因編輯技術(shù)也會相繼被挖掘，希望最終能夠使基因編輯技術(shù)被廣泛應(yīng)用到多種領(lǐng)域中。

參考文獻(xiàn)略。（如有需要請與作者聯(lián)系。）