肖日傳+羅光明+董麗華+朱玉野+朱繼孝+張風(fēng)波+伍珊娜

[摘要] 采用多波長(zhǎng)HPLC-DAD，同時(shí)測(cè)定梔子不同部位去乙酰車葉草酸甲酯、羥異梔子苷、梔子苷、綠原酸、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ和竹節(jié)參皂苷Ⅳa 7種化合物的含量，比較各成分在梔子不同部位的分布。結(jié)果表明梔子中各成分在各部位分布不同，且含量存在較大差異，其中梔子苷主要分布在果實(shí)和葉中，竹節(jié)參皂苷IVa主要分布于根和莖中，西紅花苷類成分主要存在于果實(shí)中，綠原酸以葉和莖含量較高，羥異梔子苷在葉和根中含量較高，去乙酰車葉草酸甲酯在根和莖中含量較高。通過分析梔子不同部位化學(xué)成分含量差異，為梔子資源綜合開發(fā)利用和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 多波長(zhǎng)高效液相色譜； 梔子； 不同部位； 化學(xué)成分

[Abstract] Seven compounds（deacetylasperulasidic acid methyl ester， gardenoside， chlorogenic acid， geniposide， crocin-Ⅰ， crocin-Ⅱ， chikusetsu saponin Ⅳa）were determined simultaneously by multiple wavelength HPLC with diode array detector（DAD） in different parts of Gardenia jasminoides. The results showed that these components in different parts of G. jasminoides had a different distribution， and there was a large difference in content of each component. Geniposide was mainly distributed in fruits and leaves； chikusetsu saponin Ⅳa was mainly distributed in roots and stems； crocus glycosides existed mainly in fruits； chlorogenic acid had a higher distribution in leaves and stems； gardenoside had a higher distribution in leaves and roots， while ceacetylasperulasidic acid methyl ester had a higher distribution in roots and stems. Based on the analysis of the chemical composition and content difference in different parts of G. jasminoides， the basis for the comprehensive utilization and quality evaluation of resources of G. jasminoides was provided.

[Key words] multiple wavelength HPLC； Gardenia jasminoides； different parts； chemical composition

梔子為茜草科植物梔子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果實(shí)。主產(chǎn)于江西、湖南、湖北等地，性苦寒，有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒之功效[1]，外用消腫止痛，梔子的主要活性成分為環(huán)烯醚萜類、有機(jī)酸類、西紅花苷類等[2]，現(xiàn)代藥理研究表明梔子果實(shí)具有護(hù)肝、利膽、抗炎、抗菌、解熱、鎮(zhèn)痛和降血脂等作用。國內(nèi)外對(duì)梔子藥材的研究主要集中在傳統(tǒng)用藥部位果實(shí)上，而其他部位的研究則鮮有報(bào)道，據(jù)《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[3]和《浙江省中藥飲片炮制規(guī)范》[4]記載，梔子除果實(shí)可入藥外，其根部也可入藥，在少數(shù)民間應(yīng)用廣泛，主要含有齊墩果酸醋酸酯、齊墩果酸和竹節(jié)參皂苷Ⅳa等化學(xué)成分[5-6]，可用于治療黃疸型肝炎；鄭麗花等[7]對(duì)狹葉梔子的莖部位進(jìn)行了化學(xué)成分的分離研究，從中鑒定出11種化合物，而王雪芬等[8]同時(shí)從梔子的根和莖中分離得到了相同的3種成分；對(duì)于梔子葉的研究，李運(yùn)等[9]從該部位分離鑒定出8種化合物，表明梔子的其他部位均有一定的利用價(jià)值。

目前，有關(guān)梔子藥材含量測(cè)定的報(bào)道很多，2015年版《中國藥典》僅以梔子苷作為唯一檢測(cè)的指標(biāo)性成分，相關(guān)文獻(xiàn)在此基礎(chǔ)上亦測(cè)定去乙酰車葉草酸甲酯、羥異梔子苷、京尼平龍膽二糖苷等環(huán)烯醚萜類成分[1]，綠原酸成分和西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ等西紅花苷類成分[2]，以便更全面地評(píng)價(jià)和反映梔子藥材的內(nèi)在品質(zhì)；而梔子其他部位的含量測(cè)定研究則報(bào)道較少，李紅等[10]以梔子根中齊墩果酸醋酸酯水解后的齊墩果酸為測(cè)定指標(biāo)探索梔子根的最佳采收時(shí)間和生長(zhǎng)期，相關(guān)學(xué)者則認(rèn)為由于梔子根中含有部分游離型齊墩果酸，故水解后的齊墩果酸不能準(zhǔn)確完全地反映藥材質(zhì)量，而竹節(jié)參皂苷Ⅳa在鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤等方面表現(xiàn)出一定的生理活性，作為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)更為合理[11]；此外，梔子莖、葉部位的含量測(cè)定仍屬空白。因此綜合梔子果實(shí)的主要化學(xué)成分和其他部位的含量測(cè)定研究，本實(shí)驗(yàn)采用多波長(zhǎng)高效液相色譜法，首次建立同時(shí)測(cè)定梔子果實(shí)、根、莖、葉各部位中去乙酰車葉草酸甲酯、羥異梔子苷、梔子苷、綠原酸、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ 和竹節(jié)參皂苷Ⅳa 7種化學(xué)成分的含量測(cè)定方法，系統(tǒng)地比較梔子不同部位化學(xué)成分含量差異，分析不同部位各類成分的分布特征，為梔子不同部位的質(zhì)量評(píng)控和梔子藥材資源的綜合開發(fā)利用提供理論支持。

1 材料

Waters e2695高效液相色譜儀，四元泵及自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)，2998PDA檢測(cè)器，美國Waters公司；DFY-400搖擺式中藥粉碎機(jī)，浙江溫嶺市林大機(jī)械有限公司；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；GZX-9070 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；色譜甲醇，美國ACS公司；色譜乙腈，美國ACS公司；Milli-Q超純水（18.2 Ω），江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與民族藥中心；其余試劑為分析純。endprint

去乙酰車葉草酸甲酯（批號(hào)111786-201603）、梔子苷（批號(hào)110749-201614）、綠原酸（批號(hào)110753-201514）、西紅花苷Ⅰ（批號(hào)111588-201602）、西紅花苷Ⅱ（批號(hào)111589-201604）對(duì)照品均購自中國食品藥品檢定研究院；羥異梔子苷（批號(hào)PJM0324RB16）購自上海源葉生物科技有限公司；竹節(jié)參皂苷Ⅳa（批號(hào)MUST-17030201）購自成都曼斯特生物科技有限公司。梔子藥材于2016年10月采自江西九江湖口縣順昌中藥材種植基地，原植物經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源學(xué)科組葛菲教授鑒定為茜草科植物梔子G. jasminoides。取樣時(shí)采挖整株植物，洗凈泥土，將其分為果實(shí)、根、莖、葉4部分，自然干燥，分別粉碎過4目篩，置干燥器中備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Durashell C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫：0～18 min，5%～15% A；18～25 min，15%～23% A；25～40 min，23%～35% A；40～50 min，35%～60% A；50～60 min，60%～95% A。體積流量為1 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)203，238，330，440 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密吸取各對(duì)照品適量，加70%甲醇溶解分別制成含去乙酰車葉草酸甲酯0.015 6 g·L-1、羥異梔子苷0.295 0 g·L-1、梔子苷1.564 0 g·L-1、綠原酸0.139 2 g·L-1、西紅花苷 Ⅰ 0.831 0 g·L-1、西紅花苷Ⅱ 0.122 0 g·L-1、竹節(jié)參皂苷Ⅳa 0.371 0 g·L-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫R用前經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過即得。

2.3 供試品溶液的制備

取梔子果實(shí)、根、莖、葉粉末各0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲提取45 min，放冷后稱重，用70%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻?yàn)V過，取續(xù)濾液，用0.22 μm微孔濾膜濾過即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取2.2項(xiàng)對(duì)照品儲(chǔ)備液1，2，4，6，8，10 μL，分別注入液相色譜儀中，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，回歸方程見表1。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.2項(xiàng)混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算7種成分峰面積的RSD，考察儀器精密度，結(jié)果去乙酰車葉草酸甲酯、羥異梔子苷、梔子苷、綠原酸、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ 和竹節(jié)參皂苷Ⅳa的RSD分別為0.22%，0.37%，0.10%，0.074%，0.16%，0.24%，0.092%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 按2.3項(xiàng)方法平行制備6份供試品溶液，各取10 μL進(jìn)樣，測(cè)定7種成分含量，計(jì)算峰面積的RSD，考察方法重復(fù)性，結(jié)果去乙酰車葉草酸甲酯、羥異梔子苷、梔子苷、綠原酸、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ 和竹節(jié)參皂苷Ⅳa的RSD分別為1.8%，2.2%，0.64%，0.71%，0.68%，0.87%，1.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液10 μL，分別于0，2，4，8，16，24 h進(jìn)樣分析，記錄7種成分峰面積，計(jì)算峰面積的RSD，考察供試品溶液穩(wěn)定性，結(jié)果去乙酰車葉草酸甲酯、羥異梔子苷、梔子苷、綠原酸、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ 和竹節(jié)參皂苷Ⅳa的RSD分別為0.72%，0.88%，1.2%，1.3%，0.65%，0.83%，1.6%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的藥材粉末6份，每份約0.25 g，分別精密加入對(duì)照品溶液適量，按2.3項(xiàng)方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，分別計(jì)算各成分加樣回收率及其RSD。結(jié)果去乙酰車葉草酸甲酯、羥異梔子苷、梔子苷、綠原酸、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ 和竹節(jié)參皂苷Ⅳa的加樣回收率分別為101.3%，96.80%，97.54%，99.06%，103.6%，101.7%，98.96%，RSD分別為2.6%，2.8%，2.1%，1.9%，1.8%，2.3%，2.0%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.5 不同部位各類成分含量比較

取梔子果實(shí)、根、莖、葉各部位的干燥粉末，按供試品制備方法進(jìn)樣操作，以外標(biāo)法計(jì)算同一批次梔子藥材不同部位中去乙酰車葉草酸甲酯、羥異梔子苷、梔子苷、綠原酸、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ 和竹節(jié)參皂苷Ⅳa的色譜圖見圖1～4。含量結(jié)果見表2。

3 討論與分析

3.1 梔子不同部位化學(xué)成分比較

實(shí)驗(yàn)藥材采自江西九江湖口縣梔子GAP種植基地，均為隨機(jī)取樣，具有代表性。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，梔子不同部位各成分種類和含量差異較大，西紅花苷類成分只在果實(shí)中存在，根、莖、葉中均不含；果實(shí)和葉中未檢測(cè)到竹節(jié)參皂苷Ⅳa，而根和莖中含有竹節(jié)參皂苷Ⅳa且根部的含量大于莖；根和莖中未檢測(cè)到梔子苷，而果實(shí)和葉中含有梔子苷且果實(shí)中含量大于葉；有機(jī)酸類成分在各部位均有分布，含量由高到低依次為葉、莖、根、果實(shí)；去乙酰車葉草酸甲酯在根和莖中的含量較高，葉次之，果實(shí)中最低；羥異梔子苷在葉和根中的含量較高，莖次之， 果實(shí)中較低；測(cè)定結(jié)果表明，梔子不同部位各成分含量差異較大。梔子苷作為果實(shí)的指標(biāo)性成分，在果實(shí)中的含量明顯高于其他部位。2015年版《中國藥典》記載梔子果實(shí)為傳統(tǒng)的入藥部位，而根部也作 藥用，為畬族常用藥材，畬醫(yī)稱其為“山里黃根”，在浙江、福建、湖南等地的民間主要用于治療黃疸型肝炎、肝炎后肝纖維化、風(fēng)火牙痛等病癥[12-13]，其臨床應(yīng)用由來已久，1964年，廈門市中醫(yī)院康良石等[14]名老中醫(yī)采用水邊黃梔子根治愈傳染性肝炎病例30例，1975年，廣西中醫(yī)學(xué)院伍紹岐[15]以板藍(lán)根和梔子根湯合用治愈急性黃疸性肝炎病例53例，效果良好，此外，臨床上已有松梔丸、復(fù)方梔子根顆粒、梔子根湯等以梔子根為君藥配伍使用的中藥復(fù)方。竹節(jié)參皂苷Ⅳa作為梔子根中主要的化學(xué)成分之一，表現(xiàn)出一定的抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤作用，陳偉東等[16]endprint

人以金黃色葡萄球菌為試驗(yàn)菌株，研究梔子根的抗菌生物活性與竹節(jié)參皂苷Ⅳa含量的相關(guān)性，結(jié)果表明起抗菌作用的可能不僅僅為該成分，是否為多組分協(xié)同作用，仍有待進(jìn)一步的深入探討。

3.2 色譜條件的選擇

本實(shí)驗(yàn)基于梔子果實(shí)的傳統(tǒng)含量測(cè)定方法梯度洗脫條件并對(duì)其進(jìn)行了改進(jìn)，梔子果實(shí)在35%乙腈梯度之前所有化學(xué)成分均已出峰，而通過前期摸索，發(fā)現(xiàn)梔子根、莖、葉在35%乙腈梯度以后仍有少量成分，故加長(zhǎng)時(shí)間，讓各成分達(dá)到有效分離。考察了不同濃度的磷酸溶液，發(fā)現(xiàn)0.2%磷酸水溶液能獲得較好的峰形。對(duì)于檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇，由于梔子果實(shí)中含有環(huán)烯醚萜類、有機(jī)酸類、西紅花苷類等多類成分，梔子根中含有竹節(jié)參皂苷Ⅳa等三萜皂苷類成分，單一波長(zhǎng)難以全面反映梔子化學(xué)成分組成的全貌，故本實(shí)驗(yàn)采用DAD檢測(cè)器對(duì)梔子樣品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描（190～800 nm），對(duì)各波長(zhǎng)下的色譜圖進(jìn)行分析比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)環(huán)烯醚萜類、有機(jī)酸類、西紅花苷類的最大吸收波長(zhǎng)分別為238，330，440 nm，而三萜皂苷類成分竹節(jié)參皂苷Ⅳa為末端吸收，最大吸收波長(zhǎng)為203 nm，所以本實(shí)驗(yàn)采用203，238，330，440 nm多個(gè)波長(zhǎng)最大可能地獲取色譜組分信息，以分析比較梔子各部位化學(xué)成分的差異。

3.3 提取條件的優(yōu)化

對(duì)影響提取效果的樣品提取溶劑、溶劑濃度、提取時(shí)間和提取方法4個(gè)因素進(jìn)行了考察。采用了50%甲醇、70%甲醇、純甲醇和50%乙醇、70%乙醇、純乙醇提取樣品，通過觀察色譜圖峰形、比較總峰面積，發(fā)現(xiàn)以70%甲醇提取色譜峰較多且吸收大，確定70%甲醇為提取溶劑。采用了回流提取和超聲提取兩種提取方法進(jìn)行考察，結(jié)果表明超聲提取法較簡(jiǎn)便，效率高，回流提取較繁瑣。綜合考慮，選擇超聲提取作為樣品的提取方法。提取時(shí)間采用了30，45，60，75 min，結(jié)果表明45 min為最佳提取時(shí)間，能最有效地提取各成分。

本實(shí)驗(yàn)首次采用多波長(zhǎng)高效液相色譜法對(duì)梔子不同部位各成分進(jìn)行了含量測(cè)定研究，基于中藥材“一體多用”原則，為梔子非傳統(tǒng)藥用部位或新藥用部位的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為梔子各部位質(zhì)量控制評(píng)價(jià)奠定物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)梔子新藥新產(chǎn)品的創(chuàng)制研發(fā)具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

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[責(zé)任編輯 丁廣治]endprint