張慧+吳媛媛+黃晨曄+張曉靜+顏繼忠

[摘要] 該文研究了戈米辛D與α-葡萄糖苷酶的相互作用。以PNPG作為底物測定戈米辛D的抑制率，戈米辛D的IC50為0.59 mmol·L-1，略高于阿卡波糖的IC50 1.95 mmol·L-1，其抑制類型為可逆非競爭性抑制，抑制常數(shù)Ki=4.026 g·L-1。通過AutoDock Vina分子對接研究了戈米辛D與α-葡萄糖苷酶的結合模式，結果顯示，戈米辛D與α-葡萄糖苷酶的結合能量值為-7.7 kcal·mol-1，優(yōu)于阿卡波糖的能量值-6.6 kcal·mol-1，且戈米辛D作用的氨基酸殘基數(shù)目超過了阿卡波糖。經(jīng)紫外光譜分析，發(fā)現(xiàn)戈米辛D與α-葡萄糖苷酶結合之后改變了酶二級構象中的芳香族殘基微環(huán)境，使其極性減小。

[關鍵詞] 戈米辛D； α-葡萄糖苷酶； 分子對接； 抑制率； 相互作用

[Abstract] This paper describes a study exploring the interaction between gomizine D and α-glucosidase. The inhibitory activity of α-glucosidase by gomizine D was determined using PNPG as substrates Gomizine D gave the IC50 value of 0.59 mmol·L-1， which was higher than that of acarbose （1.95 mmol·L-1）. Gomizine D was a reversible and non-competitiveα-glucosidase inhibitor with an inhibition constant Ki=4.026 g·L-1. The binding mode between gomizine D and α-glucosidase was analyzed by AutoDock Vina molecular docking software. The lowest energy of Gomizine D binding to α-glucosidase was -7.7 kcal·mol-1， which was lower than that of acarbose （-6.6 kcal·mol-1）. After binding with gomizine D， UV spectroscopy analysis displayed that the microenvironment of aromatic residue in the secondary structure of α-glucosidase was changed， and the polarity of protein was reduced.

[Key words] gomizine D； α-glucosidase； molecular docking； inhibition rate； interaction

研究小分子與靶蛋白的相互作用對揭示藥物發(fā)揮療效的實質有著重要意義。α-葡萄糖苷酶是一類能夠從含有α-糖苷鍵底物的非還原端催化水解α-葡萄糖基酶的物質總稱[1-3]，它位于小腸刷狀細胞表面，是人體中水解多糖的關鍵酶類。目前臨床上廣泛使用的α-葡萄糖苷酶抑制劑類降糖藥主要包括阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇[4-5]，然而，西藥在有效降低血糖的同時也存在諸多的安全性問題和不良反應，因此，尋找安全、有效的降糖新藥一直是研究熱點。

參芪降糖顆粒是由人參、黃芪、五味子等傳統(tǒng)中藥材組成的復方制劑，臨床上主要治療Ⅱ型糖尿病患者的氣陰兩虛證，屬于國家二級中藥保護品種[6-7]。課題組前期利用超濾-質譜法從參芪降糖顆粒中篩選出一系列的降糖活性小分子，其中，戈米辛D，見圖1，是五味子的一種木脂素類成分，對α-葡萄糖苷酶具有較強的抑制作用。為了進一步探討戈米辛D的降糖分子機制，本文從抑制率、抑制類型、分子對接、紫外光譜等多個方面對戈米辛D與α-葡萄糖苷酶的相互作用進行了研究，以期開發(fā)新一代的降糖藥物。

1 材料

小型高速離心機（艾本德中國有限公司），超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），恒溫水浴鍋（上海亞榮生化器廠），酶標儀（Tecan company），電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

α-葡萄糖苷酶和阿卡波糖均購自Sigma公司，戈米辛D購自成都曼斯特生物科技有限公司，PNPG購自北京雅安達生物技術有限公司，碳酸鈉購自太倉美達試劑有限公司，乙酸銨購自溫州市化學用料廠，均為分析純。

2 方法

2.1 測定戈米辛D的抑制率 以PNPG為底物，96孔板為反應載體，測定阿卡波糖和戈米辛D對α-葡萄糖苷酶的抑制率。用2 mmol·L-1戈米辛D稀釋到不同濃度，加入0.2 U·mL-1α-葡萄糖苷酶，在37 ℃水浴下反應15 min，再加入2.5 mmol·L-1 PNPG溶液20 μL，37 ℃下反應15 min，加入0.01 mol·L-1碳酸鈉溶液100 μL終止反應，在405 nm下測定吸光度值，并計算抑制率。

酶活性抑制率=[（A陰性- A空白）-（A樣品- A樣品對照）]/（A陰性- A空白）×100%

式中，A陰性為不加樣品抑制劑酶和PNPG完全反應吸光；A樣品為加樣品抑制劑后酶和PNPG反應的吸光；A樣品對照為只加樣品和PNPG的吸光；A空白為乙酸銨緩沖液吸光。

樣品組設定6 個濃度梯度，每組設3個平行對照，以抑制率為縱坐標，樣品濃度為橫坐標，繪制得到抑制率曲線。

2.2 戈米辛D對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學研究 在上述實驗條件下，固定α-葡萄糖苷酶的濃度，測定不同戈米辛D濃度條件下，底物濃度對α-葡萄糖苷酶催化速率的影響，每組設3個平行對照，以吸光度為表征反應速率v，底物濃度為s，1 / [v]為縱坐標，1 / [s]為橫坐標根據(jù)Lineweaver Burk 雙倒數(shù)作圖[8-9]，計算并評估戈米辛D對α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型。endprint

2.3 Auto-Docking分子對接 用AutoDock Vina軟件模擬戈米辛D對α-葡萄糖苷酶的分子對接情況。根據(jù)文獻報道本文選擇α-葡萄糖苷酶晶體結構的PDB ID為2QLY[10]，三維晶體結構見圖1。用ChemBio Draw畫出戈米辛D和阿卡波糖的結構式，導入ChemBio 3D將兩者的三維結構能量分別降至最低。采用遺傳算法（genetic algorithm，GA）計算與蛋白質結合的藥物分子的可能構象。在對接過程中，最多考慮了化合物的10個構象，取結合自由能最低的構象用來做進一步的分析。

2.4 紫外光譜法 配制戈米辛D不同濃度分別為0.25，0.5，1.25，2.5，5.0 μmol·L-1。 α-葡萄糖苷酶濃度稀釋至0.5 mg·L-1。100 μL不同濃度戈米辛D溶液加900 μL酶溶液混合裝于1.5 mL EP管中，以乙酸銨緩沖液作為對照，用紫外分光光度儀掃描并觀察戈米辛D與α-葡萄糖苷酶相互作用前后的紫外光譜圖[11]。

3 結果與討論

3.1 α-葡萄糖苷酶反應體系的優(yōu)化 為了小分子與酶蛋白在適宜條件下反應，實驗前期先對α-葡萄糖苷酶的反應條件進行了優(yōu)化，包括反應時間、緩沖液pH以及水浴溫度等。結果顯示，戈米辛D的抑制率與反應時間呈現(xiàn)良好的線性關系，隨著時間延長，戈米辛D的抑制率增加，當反應時間在15 min之后，上升趨勢變緩。，當緩沖液pH為6.7時，抑制率達到最高值，見圖2B。圖2C顯示反應溫度對抑制率的影響也較大，37 ℃為α-葡萄糖苷酶的最佳反應溫度。綜上確定戈米辛D與α-葡萄糖苷酶的最佳反應條件如下：水浴溫度為37 ℃，pH 6.7，反應時間為15 min，后續(xù)實驗均在此反應條件下進行。

3.2 測定戈米辛D的酶抑制活性 阿卡波糖是臨床上常用的一種α-葡萄糖苷酶抑制劑，本實驗選擇阿卡波糖作為陽性藥[12]。基于上述最佳反應條件，平行檢測阿卡波糖與戈米辛D對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。阿卡波糖的抑制率與濃度呈線性相關，隨著阿卡波糖濃度不斷上升，其對α-葡萄糖苷酶的抑制率不斷增加，當濃度為9 mmol·L-1時，對α-葡萄糖苷酶的抑制活性高達82.73%，經(jīng)計算得阿卡波糖的IC50為1.95 mmol·L-1，見圖3A。相比于阿卡波糖，戈米辛D的酶抑制活性最高，IC50為0.59 mmol·L-1，戈米辛D對α-葡萄糖苷酶的抑制曲線見圖3B。

3.3 戈米辛D對α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型 首先通過對α-葡萄糖苷酶中加入戈米辛D和不加戈米辛D的反應溶液檢測吸光度的變化，計算反應速度，以濃度為橫坐標，反應速度為縱坐標作圖得到兩條直線，對比兩條直線的變化，在橫坐標中沒有平移，可以判斷戈米辛D對α-葡糖苷酶的抑制是可逆的。

在此基礎上，進一步研究戈米辛D對α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型為非競爭性抑制，通過以1/[s]為橫坐標，1/[v]為縱坐標雙倒數(shù)作圖。固定α-葡萄糖苷酶的濃度，分別用0，400，800 μmol·L-1的戈米辛D與α-葡萄糖苷酶相互作用，得出3條雙例數(shù)曲線分別是：Y=0.169X+1.103，Y=0.158X+1.035，Y=0.151X+0.997。由雙倒數(shù)曲線圖可見戈米辛D 對α-葡萄糖苷酶的抑制時典型的非競爭性抑制，并且由X軸的截距可求出戈米辛D的表觀速率常數(shù)Km=0.153 0 mol·L-1，由Y軸截距數(shù)據(jù)可求出戈米辛D的抑制常數(shù)Ki=4.026 g·L-1，見圖4。

3.4 紫外光譜研究 紫外-分光光譜法是檢測小分子與蛋白質是否形成復合物的有效方法，可以研究戈米辛D對α-葡萄糖苷酶二級結構的影響。在190～400 nm的波長下，通過測定并觀察其紫外圖譜，可以得到蛋白質的主鏈結構信息。不同濃度的戈米辛D與α-葡萄糖苷酶結合后的紫外光譜變化，見圖5。

戈米辛D與α-葡萄糖苷酶的反應體系在波長 220 nm，280 nm處有2個明顯的吸收峰，在280 nm處的紫外吸光度可以反映出蛋白質的芳香族的氨基酸殘基變化。隨著戈米辛D濃度的增加，體系的吸光度下降，說明戈米辛D與α-葡萄糖苷酶存在相互作用。而且隨著戈米辛D濃度增大，280 nm處的峰形有輕微紅移，說明戈米辛D和α-葡萄糖苷酶結合后改變了α-葡萄糖苷酶的芳香族殘基的微環(huán)境，使其極性減小，即戈米辛D與α-葡萄糖苷酶的結合改變了α-葡萄糖苷酶的構象。

3.5 戈米辛D對α-葡萄糖苷酶的分子對接 本實驗采用AutoDock Vina軟件研究戈米辛D與α-葡萄糖苷酶的分子對接模式，對接圖見圖6。AutoDock軟件顯示配體-受體的相互作用模式，圖6A和6C分別表示在最低能量下，阿卡波糖和戈米辛D結合在α-葡萄糖苷酶的同一個活性疏水口袋。圖6B和6D螺旋微觀模型表示α-葡萄糖苷酶活性位點氨基酸殘基，中間棍狀模型分別是阿卡波糖和戈米辛D。從圖中可以看出，阿卡波糖與α-葡萄糖苷酶的ARG-471，GLY-210，LYS-195，TRP-43等氨基酸殘基有相互作用，戈米辛D與α-葡萄糖苷酶的TYR-605，GLY-604，LEU-499，ASP-474，THR-205，ASP-542等氨基酸殘基有相互作用，兩者之間的虛線表示配體-蛋白中的氫鍵相互作用。并且從圖中可以看出戈米辛D與α-葡萄糖苷酶上的結合位點數(shù)目超過了阿卡波糖。

根據(jù)文獻報道，阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制類型為非競爭性與競爭性抑制混合型，而戈米辛D為非競爭性抑制劑。比對兩者的分子對接結果表明，兩者結合的活性口袋一致，但是結合的氨基酸殘基有所區(qū)別，相互作用力則主要為氫鍵作用。

4 小結

糖尿病是一類嚴重的疾病，且患者人數(shù)眾多，嚴重威脅著人們的生命健康，我國以碳水化合物為主食，所以α-葡萄糖苷酶抑制劑在糖尿病的治療過程中能發(fā)揮更好的效果[13]。本文的研究對象——戈米辛D，是從傳統(tǒng)中藥方劑參芪降糖顆粒中篩選得到的一種α-葡萄糖苷酶抑制劑，研究表明其與α-葡萄糖苷酶之間存在可逆型非競爭性抑制，兩者主要以氫鍵的形式相互作用，結合之后可改變α-葡萄糖苷酶的二級構象。在前期篩選結果中，與戈米辛D結構類似的潛在α-葡萄糖苷酶抑制劑，還有戈米辛J、五味子醇甲、五味子醇乙等木脂素類化合物，經(jīng)初步實驗結果推測，這些化合物與α-葡萄糖苷酶之間都存在一定的相互作用。本文研究進一步確證了參芪降糖顆粒在體內(nèi)可對α-葡萄糖苷酶產(chǎn)生一定的抑制作用，從而起到較好的降糖效果。綜上所述，研究戈米辛D與α-葡萄糖苷酶的相互作用，一方面有助于開發(fā)新的降糖候選藥物，另一方面對闡明參芪降糖顆粒的藥效物質基礎有一定的意義。endprint