杜翊+章燕珍+譚小釘

摘 要 目的：運(yùn)用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（DOE）方法優(yōu)化抗體偶聯(lián)藥物（ADC）處方篩選，以得到適用于該ADC藥物的較優(yōu)處方。方法：利用JMP 10軟件進(jìn)行DOE，考察蛋白濃度、pH、蔗糖和吐溫20濃度等因素對(duì)ADC藥物穩(wěn)定性的影響。結(jié)果：經(jīng)過DOE方法的優(yōu)化，得到了蛋白濃度（10 mg/ml）、pH （5.0）、蔗糖濃度[6%（w/v）]和吐溫20濃度[0.02%（w/v）]的優(yōu)選組合。結(jié)論：DOE方法能優(yōu)化處方，提高ADC藥物的穩(wěn)定性，為其他ADC藥物的處方篩選提供了借鑒。

關(guān)鍵詞 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) ADC藥物 處方篩選

中圖分類號(hào)：R927.11； R979.19 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2018）01-0071-05

Application of design of experiment in the formulation screening of antibody drug conjugate

DU Yi， ZHANG Yanzhen， TAN Xiaoding*

（Central Research Institute， Shanghai Pharmaceuticals Holding Co.， Ltd.， Shanghai 200237， China）

ABSTRACT Objective： To optimize the formulation screening of antibody drug conjugate （ADC） by a method of design of experiment （DOE） so as to obtain a superior formulation for the ADC drug. Methods： DOE was performed by a software JMP 10 to investigate the effects of the concentrations of protein， sucrose and polysorbate 20 and pH value on the stability of ADC drug. Results： A preferred combination including 10 mg/ml protein， 6% （w/v） sucrose and 0.02% （w/v） polysorbate 20 and pH 5.0 was obtained by optimization of DOE method. Conclusion： DOE can optimize the formulation and improve the stability of ADC drug. This study can also provide a reference for the screening of other ADC drugs.

KEY WORDS design of experiment； ADC drugs； formulation screening

在過去的幾十年中，抗腫瘤藥物研發(fā)取得巨大進(jìn)展，尤其是生物制品的出現(xiàn)，使臨床可選的抗腫瘤藥物品種顯著增加。傳統(tǒng)小分子化療藥物具有非特異性，容易引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)；具有靶向性的單克隆抗體選擇性較強(qiáng)，不良反應(yīng)較輕，但是由于單克隆抗體靶向治療的有效率并不高，且存在耐藥與療效問題，因此，抗體-藥物偶聯(lián)物（antibody-drug conjugate，ADC）作為一種新型藥物結(jié)合了抗體的靶向性和小分子藥物的細(xì)胞毒作用[1-2]。ADC藥物進(jìn)入體內(nèi)后，通過單抗的導(dǎo)向作用與靶細(xì)胞表面的抗原結(jié)合，進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)，然后通過化學(xué)或酶促作用釋放小分子藥物而殺滅靶細(xì)胞[3]。

ADC藥物制劑處方開發(fā)的目標(biāo)是確保為患者提供質(zhì)量穩(wěn)定可靠的產(chǎn)品。與傳統(tǒng)單抗藥物相比，在安全、質(zhì)量和療效等方面，ADC藥物具有其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)。其質(zhì)量屬性通?？梢苑譃槿悾号c抗體本身相關(guān)、與小分子藥物相關(guān)及與抗體-小分子偶聯(lián)形式相關(guān)。如抗體本身相關(guān)的聚體，可影響藥物的免疫原性[4]及藥代動(dòng)力學(xué)特性；游離小分子會(huì)影響藥物的安全性；抗體藥物偶聯(lián)比可影響藥物安全性和藥代動(dòng)力學(xué)特性[5]。這些關(guān)鍵屬性都可能因處方的不同而改變，因此，篩選出好的處方對(duì)于ADC藥物保持良好的穩(wěn)定性和安全性具有重要意義。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（DOE）是以數(shù)理統(tǒng)計(jì)和概率論為基礎(chǔ)、合理安排實(shí)驗(yàn)的方法論，研究如何制定實(shí)驗(yàn)方案，以提高效率，縮小誤差，高效且經(jīng)濟(jì)地獲取數(shù)據(jù)，并進(jìn)行分析處理，最后得出正確的結(jié)論。傳統(tǒng)的多數(shù)設(shè)計(jì)是先追求目標(biāo)值，通過篩選不同因素來(lái)減少波動(dòng)，結(jié)果只能得到單因素的最優(yōu)化，但是由于參數(shù)搭配不佳而整體性能不穩(wěn)定。田口方法則是先追求產(chǎn)品的穩(wěn)定性，通過分析質(zhì)量特性與不同元素之間的非線性關(guān)系（交互作用），找出穩(wěn)定性的最佳水平組合[6-7]。隨著DOE的廣泛使用，越來(lái)越多的DOE軟件得到開發(fā)和應(yīng)用，如SPSS、Minitab、JMP等。其中，JMP是賽仕軟件公司（Statistical Analysis System）推出的一種交互式可視化統(tǒng)計(jì)分析軟件，其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)內(nèi)容豐富，實(shí)驗(yàn)設(shè)置靈活，分析功能強(qiáng)大，可大大提高實(shí)驗(yàn)效率[8-10]。因此，本研究應(yīng)用JMP 10.0軟件進(jìn)行田口實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果并找出最佳參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 ADC藥物

本研究中的ADC藥物為注射用重組抗HER2人源化單克隆抗體-MCC-DM1偶聯(lián)劑，是一種由氨基酸序列和曲妥珠單抗（赫賽汀，herceptin）相同的抗體與細(xì)胞毒類藥物美登素衍生物（DM1）通過不可裂解的硫醚連接橋偶聯(lián)而成的制劑，連接分子（linker）為SMCC。由上海醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司中央研究院生物藥物室制備。endprint

1.2 主要儀器和試劑

BSA822電子天平（賽多利斯公司）；Akta avant蛋白純化系統(tǒng)（GE）；1260高效液相色譜儀（安捷倫公司）；SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀及SoftMax分析軟件（美國(guó)Molecular Devices）；PA 800 plus毛細(xì)管電泳儀（貝克曼公司）；紫外分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific）。琥珀酸、吐溫20（J. T. Baker）；蔗糖、氫氧化鈉（湖南爾康制藥股份有限公司）；超純水（自制）。

1.3 處方DOE設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取蛋白濃度、pH、蔗糖濃度及吐溫20濃度用于DOE試驗(yàn)。利用JMP 10.0進(jìn)行DOE設(shè)計(jì)，其中蛋白濃度選取3水平、pH為2水平、蔗糖濃度為3水平、吐溫20濃度為3水平，共設(shè)計(jì)18個(gè)試驗(yàn)組（表1）。

1.4 緩沖液置換及穩(wěn)定性考察

稱取適量的蔗糖、琥珀酸和吐溫20溶解于超純水中，用3 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH，配制成表1中的不同蔗糖濃度、不同pH和不同吐溫20濃度的處方緩沖溶液。

使用Akta avant蛋白純化系統(tǒng)連接分子篩將適量的ADC藥物樣品置換至上述配制好的處方溶液中。置換好后的溶液無(wú)菌過濾并分裝至6 ml的滅菌西林瓶中，壓塞，

加鋁塑蓋，在25 ℃條件下進(jìn)行加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，考察時(shí)間為3個(gè)月。

2 質(zhì)量指標(biāo)

方法均為企業(yè)自行開發(fā)并驗(yàn)證。

2.1 尺寸排阻色譜法（SEC）純度分析

色譜柱：TSKgel G3000SWXL（7.8 mm×300 mm，5 mm）；流動(dòng)相：（20 mmol/L 磷酸二氫鉀+0.25 mol/L氯化鉀，pH=6.95±0.05）-異丙醇=85∶15；流速：0.5 ml/min；上樣量：100 mg；柱溫：室溫；樣品池溫度：8 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm。用Agilent 1260高效液相分析系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用面積歸一化法計(jì)算純度。

2.2 CE-SDS純度分析

將樣品用純水稀釋至5.0 mg/ml，將20 ml 樣品、75 ml SDS-MW樣品緩沖液、2 ml內(nèi)標(biāo)和 5 ml 0.25 mol/L碘乙酰胺（非還原CE-SDS）混勻后，65 ℃孵育4 min，冷卻至室溫，取100 ml，采用Beckman PA800 plus毛細(xì)管電泳系統(tǒng)上樣分析， 于15 kV分離，毛細(xì)管溫度及樣品傳送帶溫度均為20 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。

2.3 游離小分子分析

色譜柱：Agilent ZORBAX 300SB-C18（4.6 mm×100 mm，3.5 mm）；流動(dòng)相：0.02% TFA水溶液（流動(dòng)相A），0.02% TFA乙腈溶液（流動(dòng)相B）；流速：1.0 ml/min；上樣量：20 ml；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：252 nm。用Agilent 1260高效液相分析系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用面積歸一化法計(jì)算游離小分子的量。

2.4 體外生物學(xué)活性分析

0.25% Trypsin-EDTA消化BT-474細(xì)胞，用 DMEM/ F12完全培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，調(diào)整活細(xì)胞密度至1.5×105 cells/ml，100 ml/孔加入96孔板，37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4 h。用DMEM/F12完全培養(yǎng)基將抗體稀釋至5 mg/ml，再用稀釋液2倍系列稀釋（共9個(gè)梯度），50 μl/孔加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，以DMEM/F12完全培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，以參比品作為陽(yáng)性對(duì)照。37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，加入CCK-8染色液，每孔25 ml。5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6 h。以450 nm讀取酶標(biāo)儀上吸光度值。結(jié)果計(jì)算：利用SoftMax軟件分析數(shù)據(jù)，以抗體濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)吸光度值為縱坐標(biāo)，選用四參數(shù)方程回歸模型，擬合抗體劑量效應(yīng)曲線。按下式計(jì)算生物學(xué)活性：

3 結(jié)果

3.1 處方篩選SEC、CE-SDS、游離小分子及體外生物學(xué)活性結(jié)果

本研究中采用SEC聚體、CE-SDS小分子片段、游離小分子含量及體外生物學(xué)活性進(jìn)行后續(xù)的分析，結(jié)果如圖1所示。

25 ℃加速條件放置下，SEC聚體、CE-SDS小分子片段和游離小分子3個(gè)月與0個(gè)月的差值越小表示處方前后變化越小，越穩(wěn)定。圖1初步顯示：可以看出高濃度蛋白的處方SEC聚體變化明顯高于低濃度蛋白的處方。低、中濃度蛋白組的體外生物學(xué)活性整體高于高濃度蛋白組。

3.2 處方DOE數(shù)據(jù)分析

選擇SEC聚體、CE-SDS小分子片段、游離小分子25 ℃加速3個(gè)月與0個(gè)月時(shí)的變化值和3個(gè)月時(shí)各處方的體外生物學(xué)活性為響應(yīng)值，應(yīng)用JMP 10.0軟件對(duì)田口正交表L18（21×33）中的處方進(jìn)行預(yù)測(cè)刻畫，刻畫結(jié)果如圖2所示，各處方的刻畫意愿如表2所示。

圖2顯示pH較低時(shí)，處方的意愿增高；蛋白濃度10 mg/ml和20 mg/ml對(duì)于整體意愿的影響比30 mg/ml??；10 mg/ml時(shí)的最佳處方意愿值0.76，20 mg/ml時(shí)的最佳處方意愿值為0.71，30 mg/ml時(shí)最佳處方意愿值僅0.51。因此為了保證ADC藥物的穩(wěn)定，處方蛋白濃度應(yīng)該低于30 mg/ml。表2顯示處方B和處方H的意愿值分別為0.76和0.71，二者的意愿值相差不大，為了后續(xù)工藝的可行性及臨床使用的方便性和安全性，最終選擇蛋白濃度為20 mg/ml，即最后選擇的 ADC藥物的較優(yōu)處方為處方H，即pH 5.0、蛋白濃度 20 mg/ml、蔗糖含量6%（w/v）及吐溫20含量0.02%（w/v），并對(duì)該處方的一批成品進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察。endprint

3.3 長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察結(jié)果

對(duì)上述處方下的一批成品進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察。長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)溫度定為2～8 ℃，考察12個(gè)月。分別在試驗(yàn)期第0、3、6、9、12個(gè)月末取樣分析SEC純度、游離小分子藥物、DAR和生物活性等相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果如圖3所示。

圖3表明成品在2～8 ℃條件下放置12個(gè)月期間，SEC純度、CE-SDS純度、生物學(xué)活性、游離小分子和DAR均無(wú)明顯變化。說明在優(yōu)化處方（處方H）下，樣品在2～8 ℃條件放置12個(gè)月后質(zhì)量穩(wěn)定性良好。

4 討論

本研究通過對(duì)蛋白濃度、pH、蔗糖濃度和吐溫20濃度的優(yōu)化，篩選出優(yōu)化處方H，即20 mg/ml ADC藥物、6%（w/v）蔗糖、0.02%（w/v）吐溫20和pH 5.0。在該處方下，樣品在25℃加速3個(gè)月后，聚體、小分子片段及游離小分子的變化較小，體外生物學(xué)活性較高，經(jīng)JMP 10.0預(yù)測(cè)刻畫后，意愿值較高。經(jīng)長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察，ADC藥物的各項(xiàng)理化性質(zhì)保持良好的穩(wěn)定性，表明該處方適合此ADC藥物。

抗體偶聯(lián)藥物的處方研發(fā)與傳統(tǒng)藥物類似，盡管如此，當(dāng)將小分子與偶聯(lián)藥物的質(zhì)量屬性一起考慮時(shí)，制劑處方開發(fā)將變得更加復(fù)雜，需要考慮的因素更多。聚體是由天然或變性單體組成的高分子量蛋白質(zhì)，是導(dǎo)致免疫原性的重要因素之一[11-13]；聚體和小分子片段為樣品中的大小變異體，影響樣品整體的純度；樣品中游離小分子的含量則影響安全性，若樣品中存在較高的游離小分子藥物，將對(duì)正常細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p傷[14-15]。生物學(xué)活性測(cè)定是生物測(cè)定的重要內(nèi)容，因此，本研究采用SEC聚體、CE-SDS小分子片段、游離小分子和體外生物學(xué)活性作為刻畫的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，得到了使ADC藥物穩(wěn)定的優(yōu)化處方。表明這四個(gè)關(guān)鍵質(zhì)量屬性適合用于ADC藥物處方篩選的DOE刻畫。此DOE方法達(dá)到了預(yù)期的優(yōu)化效果，且具有較好的穩(wěn)定性。本研究將田口正交法用于ADC藥物處方篩選設(shè)計(jì)中，通過較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)，獲取優(yōu)化后的設(shè)計(jì)參數(shù)，提高設(shè)計(jì)效率，降低了設(shè)計(jì)成本，為其他ADC藥物的處方篩選提供了借鑒。

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