張旭暉 吳元媛 汪貴斌 曹福亮* 李岱龍 王文文

(1.南京林業(yè)大學南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，林學院，南京 210037；2.山東永春堂集團有限公司，泗水 273200)

隨著我國居民生活水平的不斷提高，人們對肉類食品的質量要求也越來越高。豬肉作為我國居民的日常消費產(chǎn)品，其品質安全在很大程度上取決于飼料的安全狀況。飼糧中添加抗生素可以顯著提高豬的生產(chǎn)性能和對營養(yǎng)物質的利用率[1]，但也會帶來豬肉產(chǎn)品抗生素殘留和環(huán)境污染等問題[2]。因此，開發(fā)一類無污染、無殘留、具有防病和促生長等作用的飼料或飼料添加劑來代替抗生素，對提高豬肉品質安全等問題具有重要的現(xiàn)實意義。

近年來，為減少抗生素的使用，微生物發(fā)酵植物飼料是國內外養(yǎng)殖領域研究的重點。許多豬和雞的試驗表明，微生物發(fā)酵植物中含有促進動物生長的生物活性成分，該活性成分可提高飼料轉化率，增加飼糧適口性[3]，改善動物腸道菌群結構[4]、肌肉脂肪酸組成和肉品質，延長貨架期[4-6]等。元寶楓是槭樹科槭樹屬的落葉喬木，元寶楓葉營養(yǎng)成分豐富，氨基酸含量高達11.79%，屬優(yōu)質蛋白質資源；并含有總黃酮、綠原酸、有機酸、鞣質、強心甙、萜和酚等生物活性成分，其中總黃酮和綠原酸含量較高[7]。目前，動物營養(yǎng)領域中有關元寶楓葉生物飼料的研究應用比較少。因此，可在充分利用元寶楓葉優(yōu)良蛋白質資源的同時，利用其中特有的黃酮、綠原酸和多糖等天然活性物質，從而改善動物的肉品質。本試驗首次探討在育肥豬飼糧中添加發(fā)酵無寶楓葉(fermentedAcertruncatumleaves，F(xiàn)A)對其生產(chǎn)性能、肉品質及腸道菌群的影響，并將其與未發(fā)酵元寶楓葉(unfermentedAcertruncatumleaves，UFA)進行比較，以期為元寶楓葉生物飼料在育肥豬中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵元寶楓葉的制備及其有效成分分析

發(fā)酵元寶楓葉的主要制備步驟：營養(yǎng)鹽溶液的配制、固體培養(yǎng)基的制備、發(fā)酵培養(yǎng)基的準備、產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心菌種庫，ACCC2060)和黑曲霉(AspergillusnigerNL-1，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心菌種庫，ACCC30005)的菌種接種發(fā)酵(2個菌種均由南京林業(yè)大學化工院2304保藏)、干燥粉碎。

1)按每100 mL營養(yǎng)鹽溶液中含有2 g葡萄糖、3 g尿素、2 g磷酸二氫鉀、0.5 g七水合硫酸鎂配制成營養(yǎng)鹽溶液，調pH至5.0。

2)按元寶楓葉粉末∶麩皮∶豆粕=8∶1∶1的比例制備固體培養(yǎng)基。

3)按每10 g固體培養(yǎng)基中加11 mL營養(yǎng)鹽溶液的比例配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，將配制好的發(fā)酵培養(yǎng)基在121 ℃下滅菌50 min。

4)將發(fā)酵培養(yǎng)基首先接種產(chǎn)朊假絲酵母菌種，采用種子液體培養(yǎng)法，28 ℃、150 r/min下振蕩培養(yǎng)，每10 g發(fā)酵培養(yǎng)基接種1.2 mL產(chǎn)朊假絲酵母，(28±1) ℃下培養(yǎng)(12±1) h；之后按同樣的比例接種黑曲霉菌種，(28±1) ℃下培養(yǎng)(36±1) h。按照常規(guī)發(fā)酵方法進行發(fā)酵。

5)在低于40 ℃條件下完成發(fā)酵物料的干燥，粉碎即得發(fā)酵元寶楓葉樣品。

6)隨機抽取4個未發(fā)酵的元寶楓葉樣品及分批次發(fā)酵所制備的4個發(fā)酵元寶楓葉樣品，進行有效成分含量分析。分光光度法以蘆丁為標準品測定總黃酮和綠原酸含量，凱氏定氮法測定粗蛋白質含量，硫酸銅沉淀法測定真蛋白質含量，液相色譜法測定氨基酸含量。

1.2 試驗設計與試驗動物

本試驗采用單因素隨機設計，將48頭胎次、初始體重[(55.20±1.40) kg]、日齡基本一致的“杜×長×大”育肥豬(公母各占1/2，全部去勢)隨機分為3個組，每組4個重復，每個重復4頭豬。對照(CON)組飼喂基礎飼糧，未發(fā)酵元寶楓葉組和發(fā)酵元寶楓葉組飼糧分別在基礎飼糧中用12%未發(fā)酵元寶楓葉和發(fā)酵元寶楓葉粉末替代等量的麩皮。預試期7 d，正試期63 d。

1.3 試驗飼糧與飼養(yǎng)管理

元寶楓葉發(fā)酵前后的代謝能實測值分別為8.87和9.38 MJ/kg?；A飼糧參照NRC(2012)分階段配制成粉料，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

試驗前先對供試豬舍進行消毒，測定試驗豬體重，并編號、分組。按照豬場常規(guī)飼養(yǎng)管理程序進行驅蟲和防疫。試驗期間每天飼喂3次，計量不限量，自由飲水。各組試驗豬飼養(yǎng)在同一豬舍，各重復皆分隔為相同的圈，飼養(yǎng)管理條件一致。試驗期間試驗豬沒有進行免疫接種，全期無死淘。試驗結束前1天進行限飼，最后1天將所有試驗豬稱重后用電擊棒(110 V，5 A)擊暈，懸掛頸動脈放血，整個過程在30 s內完成以確保試驗豬的痛苦降到最低。待試驗豬沒有角膜反射后，進行胴體性狀測定；采集背最長肌樣品，用于肉品質檢測。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

續(xù)表1項目Items組別Groups對照CON未發(fā)酵元寶楓葉UFA發(fā)酵元寶楓葉FA未發(fā)酵元寶楓葉UFA12．00發(fā)酵元寶楓葉FA12．00磷酸氫鈣CaHPO40．800．800．80L-賴氨酸鹽酸鹽L?Lys·HCl0．150．150．15食鹽NaCl0．200．200．20預混料Premix1)1．001．001．00合計Total100．00100．00100．00營養(yǎng)水平Nutrientlevels2)代謝能ME/(MJ/kg)13．1713．2013．26粗蛋白質CP15．7315．5916．73鈣Ca0．711．371．32有效磷AP0．580．710．73賴氨酸Lys0．800．860．87蛋氨酸Met0．270．280．29

1)預混料為每千克飼糧提供 Premix provided the following per kg of diets：VA 6 000 IU，VB12 mg，VB24 mg，VB510 mg，VB631 mg，VB121 mg，VD3800 IU，VE 20 IU，VK32 mg，生物素 biotin 0.02 mg，葉酸 folic acid 20 mg，D-泛酸D-pantothenic acid 11 mg，煙酸nicotinic acid 10 mg，Cu (as copper sulfate) 21 mg，F(xiàn)e (as ferrous sulfate) 100 mg，Mn (as manganese sulfate) 90 mg，Zn (as zinc sulfate) 60 mg，I (as potassium iodide) 1 mg，Se (as sodium selenite) 0.30 mg。

2)營養(yǎng)水平為計算值。Nutrient levels were calculated values.

1.4 指標測定與方法

1.4.1 生產(chǎn)性能

于試驗第1、28和63天早上空腹稱重所有試驗豬，并準確記錄各重復試驗豬的喂料量與余料量，計算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.4.2 胴體性狀

試驗結束時，每個重復選取體重接近平均體重的1頭試驗豬(每組4頭)，采集血樣，稱重后屠宰。放血、燙毛和退毛后進行胴體分割，屠宰率、平均背膘厚的測定參照《瘦肉型種豬性能測定技術規(guī)程》(GB 8467—1987)進行；眼肌面積的測定參照鄔理洋[8]的方法進行[用鉛筆在硫酸紙上畫出眼肌輪廓，測定眼肌的高和寬，根據(jù)公式(高×寬×0.7)計算出眼肌面積]。

1.4.3 肉品質

取胴體左側最后肋骨處背最長肌，吸干表面血液，用自封袋將肉樣保存并做好標記，用于肉品質和肌肉營養(yǎng)成分的測定。

利用testo 205酸度計測定肌肉的pH；Salter剪切力儀測定肌肉的剪切力；允許膨脹壓縮儀PY-1測定肌肉的系水力；色彩色差儀測定肌肉的亮度(L*)、紅度(a*)和黃度(b*)值。

肌肉中粗蛋白質含量參照周貴[9]的方法進行測定；粗脂肪含量按照《豬肌肉品質測定技術規(guī)范》(NY/T 821—2004)[10]的方法進行測定；脂肪酸含量按照《食品中總脂肪、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸的測定》(GB/T 22223—2008)[11]的方法進行測定。

1.4.4 直腸糞樣菌群數(shù)量

試驗豬屠宰后無菌收集直腸糞樣，其中大腸桿菌選用麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、乳酸桿菌選用乳酸細菌培養(yǎng)基(MRS)進行培養(yǎng)，培養(yǎng)后采用平板菌落計數(shù)法進行細菌計數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)用平均值和標準誤表示，采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan氏多重比較法進行顯著性檢驗，差異顯著性水平設為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 元寶楓葉發(fā)酵前后主要營養(yǎng)成分含量的變化

由表2可見，與發(fā)酵前相比，元寶楓葉發(fā)酵后的總黃酮(P>0.05)、綠原酸(P>0.05)和總糖(P<0.05)含量降低，粗纖維含量降低了60.60%(P<0.05)；粗蛋白質、真蛋白質、還原糖、總氨基酸和總必需氨基酸含量分別增加了73.54%、67.63%、131.30%、21.20%和14.74%(P<0.05)。

表2 元寶楓葉發(fā)酵前后主要營養(yǎng)成分含量的變化

同行數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 發(fā)酵元寶楓葉對育肥豬生產(chǎn)性能的影響

由表3可見，與對照組相比，未發(fā)酵元寶楓葉組和發(fā)酵元寶楓葉組育肥豬第1～28天、第29～63天和第1～63天的ADG分別增加了3.03%和2.65%、1.98%和3.63%、2.51%和3.14%(P<0.05)；發(fā)酵元寶楓葉組的ADG與未發(fā)酵元寶楓葉組相比無顯著差異(P>0.05)。各組育肥豬的ADFI和F/G無顯著差異(P>0.05)。

表3 飼糧中添加發(fā)酵元寶楓葉對育肥豬生產(chǎn)性能的影響

2.3 發(fā)酵元寶楓葉對育肥豬肉品質的影響

由表4可見，飼糧中添加發(fā)酵元寶楓葉對育肥豬的屠宰率、平均背膘厚、眼肌面積、肌肉亮度值、黃度值、pH、肌內脂肪和粗蛋白質含量均無顯著影響(P>0.05)。與對照組相比，未發(fā)酵元寶楓葉組和發(fā)酵元寶楓葉組育肥豬肌肉的剪切力顯著降低(P<0.05)，紅度值顯著增加(P<0.05)；發(fā)酵元寶楓葉組的紅度值與未發(fā)酵元寶楓葉組相比顯著增加(P<0.05)。發(fā)酵元寶楓葉組的系水力顯著高于對照組和未發(fā)酵元寶楓葉組(P<0.05)。

表4 飼糧中添加發(fā)酵元寶楓葉對育肥豬肉品質的影響

2.4 發(fā)酵元寶楓葉對育肥豬肌肉脂肪酸含量的影響

由表5可見，與對照組相比，飼糧中添加發(fā)酵元寶楓葉顯著增加了育肥豬肌肉中亞麻酸、花生烯酸、單不飽和脂肪酸(MUFA)、多不飽和脂肪酸(PUFA)的含量和多不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸(PUFA/SFA)(P<0.05)；發(fā)酵元寶楓葉組的亞麻酸和MUFA含量顯著高于未發(fā)酵元寶楓葉組(P<0.05)。與對照組和未發(fā)酵元寶楓葉組相比，發(fā)酵元寶楓葉組肌肉中硬脂酸和花生酸含量顯著降低(P<0.05)。發(fā)酵元寶楓葉組肌肉中飽和脂肪酸(SFA)含量顯著低于對照組(P<0.05)。

表5 飼糧中添加發(fā)酵元寶楓葉對育肥豬肌肉脂肪酸含量的影響

續(xù)表5項目Items組別Groups對照CON未發(fā)酵元寶楓葉UFA發(fā)酵元寶楓葉FA標準誤SEP值P?value亞油酸Linoleicacid(C18∶2)6．137．157．980．660．223亞麻酸Linolenicacid(C18∶3)0．86b0．89b1．43a0．100．043花生酸Arachidicacid(C20∶0)0．42a0．38a0．28b0．030．035花生烯酸Arachidonicacid(C20∶1)0．78b0．93ab1．16a0．090．027飽和脂肪酸SFA40．24a38．31ab34．74b3．430．016單不飽和脂肪酸MUFA52．77b53．65b55．85a4．920．041多不飽和脂肪酸PUFA6．99b8．04ab9．46a0．740．049多不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸PUFA/SFA1．49b1．61ab1．88a0．150．036

2.5 發(fā)酵元寶楓葉對育肥豬直腸內容物菌群的影響

由表6可見，飼糧中添加發(fā)酵元寶楓葉對育肥豬直腸內容物大腸桿菌和乳酸桿菌數(shù)量產(chǎn)生了顯著影響(P<0.05)。與對照組和未發(fā)酵元寶楓葉組相比，發(fā)酵元寶楓葉組育肥豬直腸內容物中大腸桿菌數(shù)量分別降低了14.93%和14.58%(P<0.05)，乳酸桿菌數(shù)量分別增加了19.77%和15.64%(P<0.05)。

表6 飼糧中添加發(fā)酵元寶楓葉對育肥豬直腸內容物微生物菌群的影響

3 討 論

3.1 元寶楓葉發(fā)酵前后主要營養(yǎng)成分含量的變化

微生物發(fā)酵已被確定為一個富有成效的過程，它是一種產(chǎn)生具有健康促進作用的生物物質的有效手段。發(fā)酵過程可以改變中草藥的原始生物活性物質和營養(yǎng)成分，經(jīng)過微生物發(fā)酵處理后的中草藥富含維生素、酶和生長因子[12-13]。元寶楓葉富含總黃酮、多糖、綠原酸等物質，而總黃酮是一類酚類化合物，研究已經(jīng)揭示其生物學作用源于它們的甙元[14-15]，發(fā)酵后黃酮甙元可更容易、更迅速被腸道吸收[16]。本試驗中，元寶楓葉發(fā)酵后的粗蛋白質、還原糖、總氨基酸和總必需氨基酸含量均顯著高于發(fā)酵前。粗蛋白質含量的增加可歸因于細菌的生長和增殖、酶的分泌(所有酶都是蛋白質)和通過分解作用釋放的被螯合或束縛的蛋白質[4]。還原糖含量的增加可能是因為發(fā)酵后碳水化合物含量的增加[17]。然而發(fā)酵后總黃酮含量略有降低，這說明發(fā)酵過程中來源于黑曲霉的β-葡萄糖甙酶可能已經(jīng)將黃酮轉化為甙元，而產(chǎn)生的不同苷類的甙元可能是本試驗中具有有益作用的生物活性組分[18]?？偘被岷涂偙匦璋被岷康脑黾邮怯幸娴模被岬暮亢捅壤菦Q定蛋白質營養(yǎng)價值的主要因素，肌肉中必需氨基酸的含量越高，蛋白質營養(yǎng)價值越高[19]。

3.2 發(fā)酵元寶楓葉對育肥豬生產(chǎn)性能的影響

本試驗中，與對照組相比，飼糧中添加未發(fā)酵元寶楓葉和發(fā)酵元寶楓葉均能顯著增加育肥豬的ADG，生產(chǎn)性能的提高可能是由于添加發(fā)酵元寶楓葉后蛋白質、還原糖、氨基酸等活性物質含量的增加。喬艷明等[2]研究了多菌種發(fā)酵飼糧對育肥豬生產(chǎn)性能的影響，結果發(fā)現(xiàn)，多菌種發(fā)酵飼糧組育肥豬的ADG比另外2個常規(guī)全價飼糧組分別提高了5.3%和5.6%，與本試驗結果基本一致。各組育肥豬的ADFI和F/G無顯著差異，可能是因為各組飼糧的風味和適口性差異不大。

3.3 發(fā)酵元寶楓葉對育肥豬肉品質的影響

豬肉的食用品質往往是消費者和生產(chǎn)者最關心的，肉的嫩度、色澤和保水性等是用來評判豬肉品質的重要指標。豬肉品質的下降大多是由于屠宰后肌肉中大量脂質過氧化物發(fā)生氧化反應，破壞細胞膜，從而造成嫩度下降、肉色變淡和系水力下降等[20]。本試驗結果表明，發(fā)酵元寶楓葉組育肥豬肌肉的系水力顯著高于其他2組，這表明飼糧中添加發(fā)酵元寶楓葉可以提高豬肉的多汁性，口感更好，其原因可能是黃酮通過阻止肌細胞膜上磷脂的氧化，保證了細胞膜的完整性，減少了肌漿液的丟失，從而改善了系水力[21]。豬肉的嫩度反映了肉的質地，肌肉嫩度可通過剪切力來衡量，剪切力越大，肉質越老化，口感就越差[22]。本試驗中，未發(fā)酵元寶楓葉組和發(fā)酵元寶楓葉組育肥豬肌肉的剪切力顯著低于對照組，其中發(fā)酵元寶楓葉組的剪切力更低，說明肉的嫩度得到改善。肉色是消費者對豬肉外觀性狀最直接的選擇標準，通常認為亮紅色的豬肉質量相對較好[23]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵元寶楓葉組的紅度值顯著高于對照組和未發(fā)酵元寶楓葉組。紅度值是鮮肉切塊中肌紅蛋白轉換為高鐵蛋白的標識，黃酮的抗氧化作用能延緩這一反應。

3.4 發(fā)酵元寶楓葉對育肥豬肌肉脂肪酸含量的影響

脂肪酸是構成脂肪的重要化學物質，肌內脂肪的氧化會導致自由基的產(chǎn)生，進而導致肉的酸敗，產(chǎn)生不良氣味[24]。不飽和脂肪酸(UFA)能保證細胞的正常生理功能，改善血液微循環(huán)，增強記憶力和思維能力。隨著人們生活水平的提高，更多的消費者希望從食物中攝入更多的UFA[25]。植物多酚黃酮類作為抗氧化劑是一種主要的具有終止自由基反應的化合物基團之一，參與細胞的抗氧化體系并與其他的細胞抗氧化劑發(fā)揮協(xié)同作用[26]。Havsteen[27]指出，存在于細胞膜中的黃酮類物質能夠像維生素C一樣保護UFA免遭氧化，這一點也支持了本試驗結果。本試驗中，飼糧中添加發(fā)酵元寶楓葉顯著增加了育肥豬肌肉中MUFA、PUFA的含量和PUFA/SFA。SFA含量的降低是由于硬脂酸和花生酸含量的顯著降低所致，而PUFA含量的增加是由于亞麻酸和花生烯酸含量的顯著增加所致，其原因可能與過氧化物酶清除酶的活性有關，該酶能夠降低總不飽和脂肪酸氧化。以上結果說明，飼糧中添加發(fā)酵元寶楓葉可以提高豬肉中UFA的含量，改變豬肉的脂肪酸結構，從而提高了豬肉的品質。

3.5 發(fā)酵元寶楓葉對育肥豬腸道菌群的影響

研究表明，發(fā)酵飼料可以提高飼糧適口性、改善動物胃腸菌群[28]、提高胃腸對飼料營養(yǎng)物質的分解、消化、吸收和利用[29]。已有研究表明，用假絲酵母或米曲霉發(fā)酵藥草能產(chǎn)生大量水解酶(如纖維素酶、麥芽糖酶、蛋白酶等)，增強消化酶活性，改善胃腸道系統(tǒng)以及斷奶仔豬的健康狀況，這將有助于提高營養(yǎng)物質的消化率[30-31]。張娜娜等[32]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵飼料桑粉中粗纖維含量降低，蛋白質含量增加，且發(fā)酵過程可以產(chǎn)生大量益生菌，調節(jié)家畜胃腸道的菌群環(huán)境，提高家畜的免疫機能與抗病能力。這些研究結果也支持了本試驗結果。腸道微生物菌群是消化系統(tǒng)的一個重要組成部分，乳酸桿菌和大腸桿菌常被作為研究仔豬和生長育肥豬腸道菌群的主要代表菌，其活菌含量與豬的健康密切相關；仔豬和育肥豬腹瀉時腸道菌群發(fā)生很大變化，主要表現(xiàn)為大腸桿菌數(shù)量增加，而乳酸桿菌數(shù)量降低[33]；乳酸桿菌能夠增強動物免疫力，是動物體內的有益菌群。本試驗結果顯示，與對照組和未發(fā)酵元寶楓葉組相比，發(fā)酵元寶楓葉組育肥豬直腸內容物中大腸桿菌數(shù)量顯著降低，乳酸桿菌數(shù)量顯著增加。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的可能原因是可發(fā)酵纖維刺激后腸中微生物的發(fā)酵，發(fā)酵生成了乳酸和可揮發(fā)性脂肪酸，抑制了一些腸道病原體如大腸桿菌和沙門氏菌的生長[34]。此外，梁英等[35]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩黃酮對肉仔雞腸道中大腸桿菌和沙門氏菌有顯著抑制作用，對乳酸桿菌有促進作用，這也支持了本次試驗的結果。發(fā)酵元寶楓葉通過對育肥豬腸道菌群的調節(jié)，提高了育肥豬的免疫機能和抗病能力，從而改善了生產(chǎn)性能。

4 結 論

飼糧中添加發(fā)酵元寶楓葉能夠改善育肥豬肌肉的脂肪酸組成和腸道菌群，并在一定程度上改善其生產(chǎn)性能、肉品質和腸道健康。

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*Corresponding author, professor, E-mail: zhlx @sdau.edu.cn