彭燦陽(yáng) 郭松長(zhǎng) 柳 序 徐明明 曲湘勇

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，長(zhǎng)沙 410128)

烏骨雞因具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及藥用價(jià)值而深受消費(fèi)者青睞，消費(fèi)者一般以烏骨雞烏色度的深淺來(lái)評(píng)判其品質(zhì)的優(yōu)劣，而烏骨雞機(jī)體黑色素沉積的程度決定其烏色度的深淺。也有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，烏骨雞的滋補(bǔ)作用主要基于其黑色素含量[1]。除了一般常規(guī)經(jīng)濟(jì)性狀外，烏骨雞烏色度，即黑色素的沉積是選育工作的核心目標(biāo)。黑色素是由黑色素細(xì)胞合成并運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外，并在其附近組織中沉積。脊椎動(dòng)物黑色素細(xì)胞源自于神經(jīng)嵴，在胚胎發(fā)育早期成黑色素細(xì)胞由神經(jīng)嵴細(xì)胞分化、遷移至體節(jié)中胚層，并進(jìn)入外胚層形成表皮黑色素細(xì)胞，使得黑色素細(xì)胞在胚胎內(nèi)能夠廣泛分布[2]。烏骨雞黑色素的沉積是受多因子共同調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程。本文綜述了烏骨雞黑色素的發(fā)生、沉積規(guī)律及其候選基因的研究進(jìn)展，以期為今后的相關(guān)研究工作提供參考。

1 成黑色素細(xì)胞的分化及遷移

在早期原腸胚階段神經(jīng)系統(tǒng)形成時(shí)期，神經(jīng)嵴細(xì)胞經(jīng)背側(cè)途徑，沿體節(jié)和外胚層遷移，分化為成黑色素細(xì)胞，最后進(jìn)入外胚層，在真皮層甚至表皮層形成黑色素細(xì)胞；后續(xù)研究又發(fā)現(xiàn)神經(jīng)嵴干細(xì)胞分化為雪旺細(xì)胞前體，通過(guò)腹側(cè)途徑遷向皮膚，最終發(fā)育分化為黑色素細(xì)胞[3-4]。禽類(lèi)軀干部神經(jīng)細(xì)胞體外的培養(yǎng)結(jié)果表明，具有成黑色素潛質(zhì)的神經(jīng)嵴細(xì)胞要在6 h后才逐漸遷移[5]。雞胚胎發(fā)育第12～13期，神經(jīng)嵴細(xì)胞開(kāi)始遷移，在胚胎第20期，成黑色素細(xì)胞從神經(jīng)嵴出發(fā)，開(kāi)始背側(cè)遷移[6]。神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移途徑、分化趨勢(shì)會(huì)受到其他各種因子的調(diào)控影響，繼而影響黑色素細(xì)胞的生成及在組織中的分布。某些因子對(duì)黑色素細(xì)胞的生成、遷移具有抑制作用。叉頭框(fork head box，F(xiàn)ox)家族成員之一FOxD3，是一種干細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能調(diào)控神經(jīng)嵴細(xì)胞的生成、遷移和分化；研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxD3在雞神經(jīng)管中異位表達(dá)，能抑制神經(jīng)嵴和神經(jīng)嵴分化衍生物的形成[7]，F(xiàn)oxD3還能抑制黑色素原的形成。Kos等[8]曾報(bào)道，F(xiàn)oxD3抑制神經(jīng)嵴細(xì)胞向成黑色素細(xì)胞分化，并抑制成黑色素細(xì)胞的遷移。而黑色素細(xì)胞的生成及遷移也會(huì)受機(jī)體其他因子的促進(jìn)；小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(microphthalmia transcription factor，Mitf)調(diào)控成黑色素細(xì)胞分化、發(fā)育，是神經(jīng)嵴細(xì)胞定向發(fā)育分化成黑色素細(xì)胞發(fā)生標(biāo)志之一；研究發(fā)現(xiàn)，Mitf通過(guò)其螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈(basic helix-loop-helix leucine zipper，bHLHZip)結(jié)構(gòu)識(shí)別位于靶基因啟動(dòng)子區(qū)上高度保守的E盒子(E-box)或M盒子(M-box)序列，啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄而參與黑色素細(xì)胞分化與發(fā)育[9]。配對(duì)框3(paired box，Pax3)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)黑色素細(xì)胞的遷移、分化、抗凋亡等過(guò)程中也起到了重要的調(diào)控作用，神經(jīng)細(xì)胞黏著分子1(neuralcell adhesion molecule 1，NCAM1)的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞間的黏附，而Pax3能直接抑制NCAM1的表達(dá)或間接使NCAM1在合成后迅速磷酸化后失去黏附功能，促進(jìn)細(xì)胞的遷移[10-11]。Pax3與性別決定基因同源盒基因10(SRY-box containing gene 10，Sox10)協(xié)同作用促進(jìn)Mitf的表達(dá)，促使黑色素細(xì)胞的分化；在胚胎期，Pax3通過(guò)抑制p53依賴(lài)性細(xì)胞凋亡，以保證黑色素細(xì)胞完成發(fā)育[12]。

成黑色素細(xì)胞的分化及遷移主要發(fā)生在胚胎期，黑色素細(xì)胞在動(dòng)物機(jī)體的分布情況在一定程度上決定了動(dòng)物機(jī)體黑色素的沉積量。田穎剛等[13]對(duì)泰和烏骨雞皮膚和肌肉組織進(jìn)行切片、染色觀察發(fā)現(xiàn)，皮膚組織中黑色素細(xì)胞在真皮層分布密度大于表皮層；肌肉組織中黑色素細(xì)胞主要分布在肌外膜及部分肌束膜中，肌纖維中黑色素細(xì)胞分布較少，使得泰和烏骨雞胸肌肌肉外側(cè)比內(nèi)部黑。蔣明[14]在廣西烏骨雞上也有同樣的發(fā)現(xiàn)。烏骨雞不同個(gè)體間烏色度的差異、不同組織中黑色素沉積量的差異，可能是由于黑色素細(xì)胞數(shù)量的差異所造成。影響機(jī)體中黑色素細(xì)胞數(shù)量的因素較多，其選育空間也較大，而烏骨雞黑色素細(xì)胞的增殖、衰老及不同生長(zhǎng)周期組織中黑色素細(xì)胞的分布情況未見(jiàn)報(bào)道，有必要進(jìn)行深入的研究，以期找到影響烏骨雞黑色素細(xì)胞分布的關(guān)鍵分子標(biāo)記物，加快烏骨雞烏色度選育進(jìn)程。

2 黑色素的合成及轉(zhuǎn)運(yùn)

2.1 合成

黑色素小體是成熟的黑色素細(xì)胞合成與儲(chǔ)存黑色素的特定細(xì)胞器，包括合成黑色、棕色的真黑色素小體與合成紅色、黃色、褐色的偽黑色素小體。酪氨酸(tyrosine，Tyr)是黑色素合成的主要前體物質(zhì)，在酪氨酸酶(tyrosinase，TYR)的作用下，催化形成多巴醌，再經(jīng)一系列氧化、聚化反應(yīng)形成多巴色素，多巴色素在酪氨酸相關(guān)蛋白2(tyrosinase-related proteins2，TYRP2)的作用下被羥化為5，6-二羥基吲哚-2-羧酸(5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid，DHICA)。DHICA有2種反應(yīng)途徑，一是被酪氨酸相關(guān)蛋白1(tyrosinase-related protein 1，TYRP1)催化形成5，6-吲哚醌羧酸，5，6-吲哚醌羧酸是一種中等可溶的褐色物質(zhì)；二是脫羧成5，6-二羥基吲哚(5,6-dihydroxyindole，DHI)，DHI再經(jīng)過(guò)TYR的催化下快速氧化、聚合，形成5，6-吲哚醌，5，6-吲哚醌是一種高分子質(zhì)量的可溶性暗褐色或黑色多聚物。5，6-吲哚醌羧酸和5，6-吲哚醌都是真黑色素。偽黑色素是一種含硫物質(zhì)，與真黑色素合成不同，半胱氨酸(cysteine，Cys)或谷胱甘肽(glutataione，GSH)參與進(jìn)來(lái)與多巴醌結(jié)合，經(jīng)一系列反應(yīng)生成偽黑色素[15]。

黑色素的合成要經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的反應(yīng)過(guò)程，受到多種信號(hào)分子調(diào)控。TYR是黑色素合成的第一限速酶，TYR活性決定著黑色素合成的速度與產(chǎn)量，TYR活性低，會(huì)使過(guò)量的GSH參與黑色素的合成，形成大量偽黑色素。TYRP1和TYRP2與TYR有40%同源，在黑色素合成過(guò)程中也發(fā)揮重要的功能作用[16]。腺苷酸環(huán)化酶(adenylatecyclase，AC)通路是黑色素合成過(guò)程中的重要信號(hào)通路，α-黑色素細(xì)胞刺激素(α-melanocyte stimulating hormone，α-MSH)與黑色素皮質(zhì)素受體1(melanocortin-1 receptor，MC1R)結(jié)合激活A(yù)C通路，使環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)含量提高，進(jìn)而提高黑色素細(xì)胞TYR活性，促進(jìn)黑色素合成[17-18]。鼠灰色蛋白(agouti signaling protein，ASIP)是MC1R拮抗劑，能與a-MSH競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合MC1R，導(dǎo)致cAMP含量降低，TYR活性下降，偽黑色素生成量增多[19-20]。Mitf也能與TYR、TYRP1、TYRP2基因啟動(dòng)子結(jié)合，刺激基因的表達(dá)，促進(jìn)黑色素的合成。烏骨雞烏色度的深淺也由真黑色與偽黑色素的量決定，由此可知，提高TYR、TYRP1及TYRP2活性，可促進(jìn)真黑色的生成量，提高烏骨雞烏色度。

2.2 轉(zhuǎn)運(yùn)

黑色素細(xì)胞通過(guò)其樹(shù)突和細(xì)胞-細(xì)胞結(jié)構(gòu)與周?chē)?0多個(gè)角質(zhì)形成細(xì)胞相互接觸形成1個(gè)黑色素單位，并向其輸送黑色素。黑色素的運(yùn)輸實(shí)質(zhì)是黑色素小體的轉(zhuǎn)運(yùn)，包括細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞間的轉(zhuǎn)運(yùn)。細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)指黑色素小體從細(xì)胞核周?chē)貥?shù)突運(yùn)送至外圍活性區(qū)域，并將黑色素固定在細(xì)胞膜附近，此過(guò)程需要微管、微絲以及馬達(dá)蛋白的協(xié)同作用下完成[21]。微絲馬達(dá)蛋白首先要與黑色素小體固定，肌球蛋白利用水解三磷酸腺苷(ATP)產(chǎn)生的能量與微絲結(jié)合并向其鉤狀末端短程移動(dòng)，三磷酸鳥(niǎo)苷結(jié)合蛋白(RAB27A)、肌球蛋白5a(myosin 5a，MYO5A)和黑素親和素(melanophilin，MLPH)形成復(fù)合結(jié)構(gòu)連接肌球蛋白和黑色素小體，協(xié)助黑色素小體的轉(zhuǎn)運(yùn)[22-24]。研究發(fā)現(xiàn)在這3種基因發(fā)生突變的小鼠體內(nèi)，其黑色素細(xì)胞中黑色小體集聚在核周?chē)?，無(wú)法達(dá)到細(xì)胞膜附近[25]。黑色素小體到達(dá)細(xì)胞膜附近后才能被轉(zhuǎn)運(yùn)至周?chē)琴|(zhì)細(xì)胞，關(guān)于黑色素小體在細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)的形態(tài)和機(jī)制研究很少，其可能的方式有3種。第1種是基底角質(zhì)細(xì)胞通過(guò)吞噬黑色素細(xì)胞的突出末端來(lái)獲得黑色素；第2種是黑色素細(xì)胞分泌黑色素胞及角質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用；第3種是2種細(xì)胞相互融合，形成共同通道轉(zhuǎn)運(yùn)[26-27]，而有相關(guān)報(bào)道，黑色素小體轉(zhuǎn)運(yùn)方式并不是單一的，而是幾種機(jī)制共同存在[28]。大量研究表明，黑色素運(yùn)輸機(jī)制的障礙也是導(dǎo)致動(dòng)物皮膚、被毛著色稀釋的主要原因[29-31]。Xu等[32]研究發(fā)現(xiàn)，安義瓦灰雞具有“五灰”表現(xiàn)型，即灰羽、灰腳、灰皮、灰喙和灰冠，此外其肌肉顏色和骨膜也呈現(xiàn)灰色，通過(guò)對(duì)“五灰”機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)其主要原因是MLPH基因突變導(dǎo)致的黑色素轉(zhuǎn)運(yùn)障礙。烏骨雞皮膚、肌肉黑色素深淺會(huì)直接影響其品質(zhì)，而關(guān)于黑色素轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)烏骨雞皮膚、肌肉黑色素沉積影響的報(bào)道還較少，有待進(jìn)一步深入研究。

3 影響黑色素的相關(guān)基因

3.1 TYR基因家族

TYR、TYRP1、TYRP2和前黑色素小體蛋白17(pre-melanosomal prtein17，Pmel17)是TYR基因家族的4個(gè)成員，均來(lái)源于1個(gè)共同祖先基因。研究發(fā)現(xiàn)，家禽黑色羽毛中TYR基因的表達(dá)量顯著高于白色羽毛[33-34]。雞TYR基因是復(fù)等位基因，位于1號(hào)染色體的長(zhǎng)臂4區(qū)4帶[35]。鄭嫩珠等[36]研究報(bào)道，在白絨烏骨雞皮膚、肌肉及內(nèi)臟組織中，TYR基因的表達(dá)量與黑色素的含量呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明TYR基因的過(guò)度表達(dá)有利于黑色素的沉積。TYR基因在我國(guó)地方雞品種，尤其是烏骨雞中具有豐富的變異資源。陳志強(qiáng)等[37]在雞TYR基因上游調(diào)控區(qū)序列-641～-2 125 bp發(fā)現(xiàn)3個(gè)單核苷酸多態(tài)(SNP)位點(diǎn)，與雞的脛色和皮膚顏色顯著相關(guān)。TYRP1基因所編碼的TYRP1是一種跨膜糖蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成并轉(zhuǎn)運(yùn)至黑色素細(xì)胞內(nèi)部。在人類(lèi)研究中，TYR基因在黑膚色類(lèi)型人的黑色素細(xì)胞中表達(dá)與白膚色類(lèi)型人無(wú)顯著差異，而TYRP1基因的表達(dá)量有明顯提高[38]。Li等[39]研究發(fā)現(xiàn)TYRP1基因在黑馬中的表達(dá)量是灰馬6.54倍；劉薇[40]研究發(fā)現(xiàn)，在絲毛烏骨雞胚胎除眼睛外的組織中，黑色素可見(jiàn)的時(shí)間都晚于組織中TYRP1開(kāi)始表達(dá)的時(shí)間。由此可見(jiàn)，TYRP1對(duì)黑色素的合成起重要作用。TYRP2又稱(chēng)多巴色素異構(gòu)酶(DT)，能使多巴色素轉(zhuǎn)化為DHICA，控制黑色素細(xì)胞中DHICA和DHI的比例，加速真黑色素的合成，是影響動(dòng)物毛色的重要蛋白[41]。Pmel17基因編碼的蛋白質(zhì)與TYR基因家族其他3個(gè)成員編碼的蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)非常相似,故也將它作為T(mén)YR基因家族的第4個(gè)成員，參與黑色素生成途徑終末步驟的調(diào)節(jié)。Pmel17是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成的Ⅰ型跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)糖蛋白，轉(zhuǎn)運(yùn)到黑色素小體內(nèi)，經(jīng)前蛋白轉(zhuǎn)化酶及一系列酶參與的解朊作用裂解并組成淀粉樣纖維結(jié)構(gòu)，促進(jìn)黑色素小體結(jié)構(gòu)的形成[42-43]，以利于黑色素的合成和沉積。Pmel17基因含11個(gè)外顯子，研究發(fā)現(xiàn)小鼠Pmel17基因1個(gè)終止密碼子突變[44]，以及1個(gè)單核苷酸插入造成額外12個(gè)氨基酸的突變[45]都可產(chǎn)生銀色毛表現(xiàn)型。馬Pmel17基因p.Arg618Cys位點(diǎn)突變也可產(chǎn)生銀色毛表型[46]；雞Pmel17基因p.R618C位點(diǎn)突變產(chǎn)生紅褐色羽毛表型、第10外顯子一個(gè)9 bp片段的插入會(huì)產(chǎn)生顯性白色羽毛表型[47]。Pmel17基因突變會(huì)影響黑色素小體的成熟，導(dǎo)致黑色素合成、沉積障礙，關(guān)于Pmel17基因?qū)豕请u皮膚、肌肉組織中黑色素沉積的影響還未見(jiàn)報(bào)道，進(jìn)一步的深入研究對(duì)了解烏骨雞黑色素沉積原理具有重要意義。

3.2 MC1R基因

雞MC1R基因由擴(kuò)展黑色(extendeds black，E)位點(diǎn)所編碼[48]，是調(diào)節(jié)黑色素合成的關(guān)鍵基因。MC1R是位于黑色素細(xì)胞表面的G蛋白耦合受體，有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，為最小的G蛋白耦合受體，在AC通路中作為α-MSH的受體，對(duì)黑色素合成發(fā)揮重要作用[49]。鄭嫩珠等[33]研究MC1R基因在半番鴨和番鴨黑白羽中表達(dá)差異，結(jié)果顯示，MC1R基因在半番鴨黑羽中表達(dá)量是白羽的9.08倍，在番鴨黑羽中表達(dá)量是白羽中的3.13倍，而且差異都達(dá)到了極顯著的程度。杜曉明[50]研究相同日齡、生長(zhǎng)環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)狀況下的黑色邊雞和灰白色邊雞皮膚、肝臟和羽髓組織中的MC1R基因的表達(dá)的情況，結(jié)果表明該基因在黑色邊雞中的以上各組織中表達(dá)量均顯著高于灰白雞。楊永升等[51]在雞MC1R基因的編碼區(qū)檢測(cè)到3個(gè)SNP，發(fā)現(xiàn)與膚色、肉色、脛色顯著相關(guān)；研究發(fā)現(xiàn)，雞MC1R基因的E92K和M7IT 2個(gè)位點(diǎn)突變會(huì)使雞產(chǎn)生全黑的羽毛，H215P位點(diǎn)突變會(huì)抑制黑色素沉積[52]。遲良等[53]利用反轉(zhuǎn)錄PCR克隆烏骨雞MC1R基因，結(jié)果顯示烏骨雞MC1R基因全長(zhǎng)945 bp，編碼314個(gè)氨基酸，有4個(gè)明顯的突變位點(diǎn)，分別為M71T、E92K、S124G和H215P，推測(cè)S124G位點(diǎn)突變是造成烏骨雞烏皮、烏肉、烏骨，而具有純白色羽毛的原因，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3.3 Mitf基因

Mitf基因是黑色素合成通路中的關(guān)鍵調(diào)控基因，不但影響黑色素細(xì)胞的分化和發(fā)育，還直接調(diào)控酪氨酸基因家族的表達(dá)，影響黑色素的生成[54]。Zhu等[55]研究發(fā)現(xiàn)Mitf基因在羊駝棕色被毛皮膚組織中的表達(dá)量顯著高于白色被毛皮膚；在鳥(niǎo)類(lèi)中，Mitf基因表達(dá)量與羽色具有一定相關(guān)性。Li等[56]研究發(fā)現(xiàn)Mitf基因在鴨子的黑色毛球中有比較高的表達(dá)量，而在白色毛球中幾乎不表達(dá)；Minvielle等[57]研究發(fā)現(xiàn)，Mitf基因突變會(huì)導(dǎo)致純合子的日本鵪鶉表現(xiàn)為銀白羽色。Wang等[58]也發(fā)現(xiàn)Mitf基因編碼區(qū)1 109 bp位點(diǎn)上的堿基突變與浙東白鵝白羽性狀高度相關(guān)。鄭嫩珠等[59]克隆了白絨烏雞Mitf基因的cDNA序列，長(zhǎng)度為1 431 bp，編碼468個(gè)氨基酸，并且發(fā)現(xiàn)，在白絨烏骨雞不同組織中，Mitf基因的表達(dá)量與黑色素含量呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明Mitf基因表達(dá)有助于烏骨雞黑色素沉積。

3.4 MLPH基因

MLPH參與黑色素細(xì)胞中成熟黑色素小體的轉(zhuǎn)運(yùn)，使黑色素小體在黑色素細(xì)胞樹(shù)突末梢聚集，調(diào)控動(dòng)物皮膚和被毛的顏色。MLPH基因的突變會(huì)導(dǎo)致色素沉著減少，出現(xiàn)被毛稀釋表現(xiàn)型。國(guó)內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)，貓、狗、兔子、鵪鶉和美國(guó)水貂MLPH基因的突變，都導(dǎo)致毛色變淡，出現(xiàn)毛色稀釋表型[30-31，60-62]。劉杰等[63]研究發(fā)現(xiàn)，MLPH基因在20周齡浙東白鵝母鵝中的表達(dá)存在組織特異性，在黑化部位眼睛中表達(dá)量最高，在背部皮膚、腹部皮膚及腳蹼中表達(dá)量較低，而在心臟、肝臟等部位未檢測(cè)到表達(dá)，這種表達(dá)規(guī)律與鵝的黑色素沉著規(guī)律一致，進(jìn)一步證明了MLPH基因與黑色素沉積有關(guān)。

4 小 結(jié)

烏骨雞是我國(guó)特有的地方雞品種，其最大的經(jīng)濟(jì)與藥用價(jià)值在于黑色素的沉積。黑色素性狀的常規(guī)選育主要通過(guò)觀察(肉眼)烏色度深淺，進(jìn)展較為緩慢，利用分子標(biāo)記輔助選育十分必要。關(guān)于動(dòng)物被毛黑色素沉積機(jī)理方面已有大量研究，在此基礎(chǔ)上，研究與烏骨雞黑色素沉積相關(guān)的基因具有重要意義。從黑色素細(xì)胞的發(fā)生、遷移，黑色素的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)，以及黑色素在組織中是否會(huì)發(fā)生降解等多個(gè)方面去研究影響烏骨雞烏色度的主要因素，探明基因調(diào)控黑色素沉積的具體機(jī)制，尋找影響烏骨雞黑色素沉積的主效基因及分子標(biāo)記物，并在生產(chǎn)中利用分子標(biāo)記物對(duì)黑色素性狀進(jìn)行早期選擇，提高烏骨雞烏色度，加快選育進(jìn)度。

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*Corresponding author, professor, E-mail: quxy99@126.com