李 爽,李曉敏,李芳柏* (1.中國(guó)科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所,廣東 廣州 510640；.廣東省生態(tài)環(huán)境技術(shù)研究所,廣東 廣州 510650；3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

氮元素是生物圈中最主要的基本組成元素之一,其中硝酸鹽(NO3-)可以作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被植物和微生物吸收利用,還可以作為電子受體參與一些細(xì)菌、古菌甚至真核微生物的能量代謝和生長(zhǎng)過(guò)程[1].在氮元素生物地球化學(xué)循環(huán)過(guò)程中,厭氧條件下微生物驅(qū)動(dòng)的反硝化過(guò)程是其中一條比較普遍且重要的分支[2-3].微生物驅(qū)動(dòng)的反硝化過(guò)程為：NO3-→NO2-→NO→N2O→N2.其中 nar基因編碼的細(xì)胞膜硝酸鹽還原酶和 nap基因編碼的周質(zhì)硝酸鹽還原酶在 NO3-還原成亞硝酸鹽(NO2-)的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用;在 NO2-還原成為氧化氮(NO)的過(guò)程中,銅亞硝酸鹽還原酶(nirK)和含細(xì)胞色素 cd1的亞硝酸還原酶(nirS)起著重要作用;norBC基因和nosZ基因編碼的NO還原酶和N2O還原酶在NO和N2O的還原中起著重要作用[1,4].目前已有很多文獻(xiàn)報(bào)道不同生境中反硝化微生物群落的研究,比如：酸性泥炭土中narG、nirK/nirS、nosZ-反硝化微生物豐度及群落組成[5];草地土壤環(huán)境中narG-硝酸鹽還原微生物群落的組成[6];河流沉積物中nirS-亞硝酸鹽還原微生物的群落特征[7].

鐵(Fe)是地殼中含量第 4高的元素,也是紅壤中重要的氧化還原元素[8-9].Fe的氧化還原轉(zhuǎn)化對(duì)環(huán)境中許多元素轉(zhuǎn)化起著至關(guān)重要的作用,比如：N 的生物地球化學(xué)循環(huán)[8,10],重金屬和類(lèi)金屬鈍化固定[11-12],有機(jī)污染物的脫毒和降解[13].由于人為活動(dòng)在稻田環(huán)境中施加大量的化肥,導(dǎo)致稻田土壤中NO3-濃度增高,進(jìn)而使稻田環(huán)境中微生物介導(dǎo)的NO3-還原過(guò)程活躍[14-15].目前關(guān)于厭氧稻田環(huán)境中 NO3-與亞鐵(Fe(II))耦合過(guò)程的研究也有報(bào)道,主要集中在參與該過(guò)程的微生物群落組成,且研究表明Geothrix、Sunxiuqinia、Vulcanibacillus、 Azospira、 Zoogloea和Dechloromonas等是該過(guò)程的優(yōu)勢(shì)微生物[16-17],然而對(duì)于厭氧稻田中硝酸鹽還原過(guò)程中的功能基因的含量以及功能微生物的研究較為缺乏.深入了解Fe(II)的存在對(duì)稻田環(huán)境中反硝化功能微生物豐度及其功能群落多樣性組成的影響,有利于揭示Fe(II)對(duì)稻田環(huán)境中反硝化過(guò)程的影響機(jī)制,對(duì)調(diào)節(jié)稻田環(huán)境中 Fe-N循環(huán)具有重要意義.本研究以華南地區(qū)的水稻土作為研究對(duì)象,在實(shí)驗(yàn)室模擬中性厭氧培養(yǎng)條件下,設(shè)置了添加或者未添加Fe(II)/NO3-的不同處理,研究了其N(xiāo)O3-還原以及 Fe(II)氧化的動(dòng)力學(xué)變化,并通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)分析了參與反硝化過(guò)程的功能基因的含量以及功能優(yōu)勢(shì)微生物群落結(jié)構(gòu)與相對(duì)豐度的變化情況,進(jìn)而探討了 Fe(II)對(duì)稻田土壤中反硝化功能基因及其微生物群落的影響.

1 材料與方法

1.1 樣品采集與理化分析

用于本實(shí)驗(yàn)的稻田土壤采集于廣州市的中國(guó)科學(xué)院華南植物園水稻實(shí)驗(yàn)田(23°10'38.26"N, 113°21'10.12"E).采集時(shí)的水稻田處于淹水狀態(tài),土壤樣品的采集采用四分法.采集的土壤樣品除去其中的動(dòng)植物殘?bào)w等雜物,一部分放置于厭氧袋中于 4℃的冰箱中保存待用,一部分置于干燥通風(fēng)陰涼處自然風(fēng)干.風(fēng)干后的樣品通過(guò)研磨過(guò)篩(100目)收集,并利用同位素鈷60Co釋放出來(lái)的高能γ射線對(duì)土壤進(jìn)行滅菌,滅菌后的土壤用于實(shí)驗(yàn)中滅菌對(duì)照實(shí)驗(yàn).土壤理化特性的測(cè)定參考《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》[18],其中供試土壤pH值約為6.0,有機(jī)碳含量為 41.0g/kg,總鐵含量約 27.9g/kg,總氮含量約258mg/kg.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)了 5個(gè)處理組,包括滅菌非生物對(duì)照(Sterilized soil+Fe(II)+NO3-),生物對(duì)照組(Soil、Soil+NO3-、Soil+Fe(II))以及實(shí)驗(yàn)組(Soil+Fe(II)+NO3-).本實(shí)驗(yàn)采用 100mL西林瓶作為反應(yīng)器,培養(yǎng)基包括：30mmol/L NaHCO3溶液作為緩沖溶液(通過(guò)通入 CO2氣體后緩沖液的 pH值為 7.0),5mmol/L乙酸鈉作為碳源,10mmol/L NaNO3,5mmol/L FeCl2,微量元素(1mL/L)和維生素溶液(1mL/L)為微生物提供生長(zhǎng)所必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì).所有處理水土比為100：1(mL/g),通入 N2：CO2混合氣(80：20)30min使體系中保持充分厭氧狀態(tài),然后快速加蓋橡膠塞和鋁蓋,置于 30℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng),在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣.本實(shí)驗(yàn)采取破壞取樣,每個(gè)處理的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置 3個(gè)重復(fù),西林瓶中的液體搖勻取出一定量的懸濁液用于 Fe的測(cè)定,然后再取西林瓶中的懸濁液用0.22μm 的水系濾膜過(guò)濾,濾液保存至-40℃用于NO3-、NO2-和 NH4+的測(cè)定.剩余的懸液經(jīng)過(guò)離心,棄去上清液,將固體保存至-40℃用于DNA的提取.

1.3 分析方法

NO3-、NO2-和NH4+的測(cè)定采用流動(dòng)分析儀(Skalar SAN++,荷蘭)進(jìn)行定量測(cè)定[19].由于還原所生成的 NO2-可以和 Fe(II)發(fā)生化學(xué)反應(yīng),因此取樣后要將樣品充分暴露于空氣中,使體系中的 Fe(II)充分氧化,避免對(duì) NO2-含量測(cè)定的影響.N2O 采用氣相色譜(GC-7900,上海,天美)進(jìn)行定量測(cè)定,用1mL的取樣針抽取1mL西林瓶中的頂空氣體注入進(jìn)樣口進(jìn)行測(cè)定,采用的是ECD檢測(cè)器,柱箱溫度 50℃;ECD 檢測(cè)器溫度 250℃;進(jìn)樣口溫度 200℃.溶解態(tài)和提取態(tài)亞鐵的測(cè)定使用鄰菲羅啉比色法[20].其中提取態(tài)亞鐵用40mmol/L氨基磺酸(用HCl將pH值調(diào)至1.8)作為提取液[21].

1.4 微生物群落組成和多樣性分析

土壤樣品(濕樣 0.25g)總 DNA 的提取采用MO BIO公司生產(chǎn) PowerSoilTMDNA Isolation Kit試劑盒.提取的DNA保存-40℃待用.

1.4.1 微生物和功能基因的定量 微生物和功能基因的定量采用熒光染料 SYBR Green,用MyiQTM 2Optics Module熒光定量?jī)x(BIORAD,USA)對(duì)總細(xì)菌(16S rRNA)、硝酸鹽還原基因(narG、napA)、亞硝酸鹽還原基因(nirS)、N2O還原基因(nosZ)進(jìn)行定量測(cè)定.總細(xì)菌的定量分析用引物Eub338F/Eub518R進(jìn)行擴(kuò)增,反硝化功能基因的定量分別采用引物 NarG1960m2F/NarG2050m2R、NapAV17m/NapA4r、NirSCd3aF/NirSR3cd、NosZ2F/NosZ2R 進(jìn)行擴(kuò)增.PCR 擴(kuò)增需要的引物以及擴(kuò)增條件參照表1.

表1 定量PCR擴(kuò)增引物序列及相應(yīng)的擴(kuò)增程序Table 1 Primers and programs for the PCR amplification of the real-time qPCR

1.4.2 高通量和克隆文庫(kù)分析 高通量和克隆文庫(kù)分析采用細(xì)菌通用引物 515F/806R對(duì) 16S rRNA基因的V4高變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增.亞硝酸鹽還原基因和氧化亞氮還原基因的擴(kuò)增分別采用引物NirSCd3aF/NirSR3d 和 NosZF/NosZ1622R.反向引物 806R、NirSR3d、NosZ1622R都帶有識(shí)別不同樣品的標(biāo)簽序列(barcode).擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用純化試劑盒(QIAquick Gel Extraction Kit)進(jìn)行純 化,純 化 后 的 PCR 產(chǎn) 物 用 Qubit?3.0Fluorometer測(cè)定濃度后以等摩爾混勻,樣品合格后在 Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序. PCR擴(kuò)增的具體條件如表2所示.

完成高通量測(cè)序后,所有的原始序列都要質(zhì)量控制,過(guò)濾去除低質(zhì)量的序列.將高質(zhì)量的序列通過(guò)特有的barcode標(biāo)簽分配到每個(gè)樣品中,16S rRNA基因、nirS基因、nosZ基因分別按照97%、80%、82%的序列相似性進(jìn)行OUT的分配挑選.使用QIIME和RDP將每個(gè)樣品中的所有序列劃分到不同的物種分類(lèi)等級(jí)(門(mén)、綱、目、科、屬、種),統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的群落結(jié)構(gòu)組成和相對(duì)豐度.測(cè)試序列提交至 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù),分別獲得 16S rRNA、nirS、nosZ基因序列登陸號(hào)為SRP109611、SRP108801、SRP108746.

由于硝酸鹽還原基因(narG、napA)的基因片段較長(zhǎng),無(wú)法采高通量測(cè)序分析,所以采用克隆文庫(kù)來(lái)分析硝酸鹽還原功能微生物的組成.其所用引物和 PCR擴(kuò)增的具體條件如表 2所示.其中Soil和 Soil+Fe(II)實(shí)驗(yàn)處理沒(méi)有成功擴(kuò)增出napA基因.通過(guò)藍(lán)白斑篩選出陽(yáng)性克隆子進(jìn)行測(cè)序,并將測(cè)試序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù),分別獲取narG和napA序列登陸號(hào)為 MF626620-MF627322、MF626402-MF626619.目標(biāo)序列采用 Mothur軟件進(jìn)行OTU聚類(lèi),并建立相應(yīng)的克隆文庫(kù).

表2 高通量和克隆文庫(kù)PCR擴(kuò)增引物序列及相應(yīng)的擴(kuò)增程序Table 2 Primers and programs for the PCR amplification of the High-throughput sequencing and clone libraries

2 結(jié)果與討論

2.1 硝酸鹽還原及其產(chǎn)物生成

圖1 不同處理中NO3-, NO2-和N2O濃度隨反應(yīng)時(shí)間的變化Fig.1 Changes of NO3-, NO2- and N2O concentrations with time dependence in different treatments

從NO3-的濃度變化(圖1A)可見(jiàn),在Soil+ NO3-和Soil+Fe(II)+NO3-處理中,NO3-的濃度隨著時(shí)間變化逐漸降低;其中在 Fe(II)存在的條件下,的還原出現(xiàn)了延滯,在第 4d后才出現(xiàn)大量的還原.這可能是 Fe(II)的加入對(duì)土壤中的微生物有一定的毒害作用[30,32].而在Sterilized soil+Fe(II)+NO3-處理中,NO3-沒(méi)有發(fā)生明顯的還原,說(shuō)明在 Soil+Fe(II)+NO3-處理中 NO3-的還原主要是由微生物介導(dǎo)的.微生物介導(dǎo)的完整的硝酸鹽還原過(guò)程包括反硝化作用(NO3-→NO2-→ NO→N2O→N2)和異化硝酸鹽還原成銨(NO3-→ NO2-→NH4+)[4].在所有實(shí)驗(yàn)處理中都未檢測(cè)到 NH4+的存在,所以在本文所研究的稻田土壤中微生物驅(qū)動(dòng)的 NO3-還原過(guò)程主要以反硝化過(guò)程為主.前人研究發(fā)現(xiàn)在稻田環(huán)境中即使存在異化硝酸鹽還原成銨這個(gè)過(guò)程,與反硝化過(guò)程相比該過(guò)程也是較為緩慢的,并不起主導(dǎo)作用[17,32].在Soil+NO3-和Soil+Fe(II)+NO3-處理中,隨著時(shí)間的變化均有NO2-生成,分別在第1d和第4d后NO2-才有明顯的積累,經(jīng)檢測(cè)在NO3-還原過(guò)程中生成 NO2-的濃度分別高達(dá) 3.7,0.6mmol/L(圖1B).在Soil+Fe(II)+NO3-處理中,NO2-濃度明顯低于Soil+NO3-處理.造成這種現(xiàn)象的主要原因可能是在Fe(II)存在時(shí),NO2-可以與Fe(II)發(fā)生快速的化學(xué)反應(yīng)(其反應(yīng)式為：2NO2-+4Fe2++5H2O→4FeOOH+N2O+6H+)[21],從而致使NO2-不能在體系中大量積累,這與之前的研究結(jié)果比較相似[16].培養(yǎng)2d后,在Soil+NO3-和 Soil+Fe(II)+ NO3-處理中都有N2O生成,并且Soil+Fe(II)+NO3-處理中N2O的增長(zhǎng)幅度比Soil+NO3-處理要大,在第8d時(shí)它們的濃度分別為 0.3,0.6mmol/L(圖 1C).而在對(duì)照處理 Soil和 Soil+Fe(II)中,均未測(cè)到 NO3-、NO2-和N2O的存在.

2.2 亞鐵的氧化

圖2顯示,在Soil+Fe(II)處理中,溶解態(tài)Fe(II)和氨基磺酸提取態(tài)Fe(II)的濃度均沒(méi)有發(fā)生明顯變化,說(shuō)明在厭氧條件下土壤中的 Fe(II)不容易發(fā)生氧化[33].在 Soil+Fe(II)+NO3-處理中,溶解態(tài)Fe(II)和氨基磺酸提取態(tài)Fe(II)的濃度在第4d后明顯降低,在第8d時(shí)80%以上的Fe(II)被氧化;而在Sterilized soil+Fe(II)+NO3-處理中 Fe(II)也不發(fā)生氧化,說(shuō)明微生物以及 NO3-對(duì) Fe(II)的氧化起著重要的驅(qū)動(dòng)作用[33].

圖2 不同處理中溶解態(tài)Fe(II)和氨基磺酸提取態(tài)Fe(II)濃度隨反應(yīng)時(shí)間的變化Fig.2 Changes of dissolved Fe(II) and sulfamic acid-ext Fe(II) concentrations with time dependence in different treatments

2.3 16S rRNA和功能基因的豐度變化

從圖 3A可知,在 Soil和 Soil+Fe(II)處理中,細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)隨時(shí)間變化并沒(méi)有出現(xiàn)明顯的增長(zhǎng);在 Soil+NO3-處理中,細(xì)菌 16S rRNA基因拷貝數(shù)從第1d后開(kāi)始出現(xiàn)明顯的增長(zhǎng);在Soil+Fe(II)+NO3-處理中,細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)的增長(zhǎng)延滯到第4d后才開(kāi)始;在Soil+NO3-和Soil+Fe(II)+NO3-處理中,細(xì)菌 16S rRNA基因拷貝數(shù)在第 8d時(shí)增長(zhǎng)了約一個(gè)數(shù)量級(jí),從1010copies/g soil增長(zhǎng)到1011copies/g soil.

如圖 3B 所示,在 Soil、Soil+Fe(II)和 Soil+Fe(II)+NO3-處理中,細(xì)胞膜硝酸鹽還原基因narG的拷貝數(shù)隨時(shí)間變化沒(méi)有明顯的變化;而在Soil+NO3-處理中narG基因的拷貝數(shù)在第一天后隨時(shí)間變化出現(xiàn)明顯增長(zhǎng),從第 1d的106copies/g soil增長(zhǎng)到第8d的107copies/g soil.如圖3C所示,在Soil和Soil+Fe(II)處理中,周質(zhì)硝酸鹽還原基因napA拷貝數(shù)隨時(shí)間變化沒(méi)有明顯的變化;在Soil+NO3-處理中,napA拷貝數(shù)從第1d后開(kāi)始顯著增加;在Soil+Fe(II)+NO3-處理中,napA拷貝數(shù)從第4d后才開(kāi)始顯著增加;第8d時(shí),napA拷貝數(shù)在Soil+和Soil+Fe(II)+處理中均達(dá)到 107copies/g soil.由此可見(jiàn),在Soil+NO3-處理中, NO3-還原主要發(fā)生在細(xì)胞膜和周質(zhì)中;而Fe(II)存在的條件下,NO3-還原主要發(fā)生在周質(zhì)中.

圖3 不同處理中16S rRNA、narG、napA、nirS和(nosZ基因拷貝數(shù)隨反應(yīng)時(shí)間的變化(copies/g soil)Fig.3 Copy numbers of (A)16S rRNA, (B) narG, (C) napA, (D) nirS and (E) nosZ genes with time dependence in different treatments

對(duì)于nirS和nosZ基因拷貝數(shù)(圖3D和圖3E),在 Soil和 Soil+Fe(II)處理中,兩者隨著時(shí)間的變化基因拷貝數(shù)沒(méi)有出現(xiàn)明顯的增長(zhǎng).在 Soil+NO3-處理中,nirS和nosZ基因拷貝數(shù)均從第 1d后開(kāi)始出現(xiàn)明顯的增長(zhǎng).在Soil+Fe(II)+NO3-處理中,nirS和nosZ基因拷貝數(shù)均從第4d后才開(kāi)始出現(xiàn)明顯的增長(zhǎng).與 Soil+NO3-處理相比,Soil+Fe(II)+NO3-處理中nirS和nosZ基因拷貝數(shù)增長(zhǎng)較為顯著,在第 8d時(shí)均達(dá)到 108copies/g soil,同時(shí)Soil+NO3-處理中的拷貝數(shù)只有 107copies/g soil.由此表明,Fe(II)的加入提高了亞硝酸鹽還原基因和氧化亞氮還原基因的豐度,進(jìn)而促進(jìn)了NO2-和 N2O的進(jìn)一步還原,這與圖 1B中 Soil+Fe(II)+處理的濃度顯著低于Soil+處理的結(jié)果一致.

2.4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成及相對(duì)豐度變化

從微生物群落在門(mén)水平的組成(圖 1A)得知,作為接種物的原始土壤在門(mén)水平主要以Betaproteobacteria(20%)為主.隨著時(shí)間變化其微生物群落組成發(fā)生明顯變化,Gammaproteobacteria成為Soil處理中的優(yōu)勢(shì)菌群,其豐度在第4d達(dá)到最高(52%),造成這種結(jié)果的原因可能在該處理中添加了乙酸鹽作為碳源,影響了微生物群落結(jié)構(gòu)組成.前人報(bào)道在厭氧條件 下,向 被 hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine污染的地下水中加入碳源乙酸鹽,會(huì)造成群落結(jié)構(gòu)改變,促使高達(dá) 90%以上的Betaproteobacteria的富集[34].在 Soil+Fe(II)處理中,微生物群落組成隨時(shí)間的變化呈現(xiàn)較穩(wěn)定水平,說(shuō)明 Fe(II)的加入并沒(méi)有明顯改變微生物在門(mén)水平的群落結(jié)構(gòu)組成[17].在 Soil+NO3-和Soil+Fe(II)+NO3-處理中, Betaproteobacteria在群落中的相對(duì)豐度隨著時(shí)間變化呈現(xiàn)明顯的增長(zhǎng)趨勢(shì)：其中在 Soil+NO3-處理中,在第 2d Betaproteobacteria的相對(duì)豐度就達(dá)到 82%;在Soil+Fe(II)+NO3-處理中,Betaproteobacteria的相對(duì)豐度在第4d開(kāi)始增長(zhǎng),并在第8d時(shí)達(dá)到最高的 93%.上述結(jié)果與前人研究相一致,即 NO3--N的存在(不管 Fe(II)存在與否)會(huì)促進(jìn)Betaproteobacteria的富集[17,32].研究表明,大部分的反硝化微生物都屬于 Proteobacteria的 alpha和 beta綱[1],而本文所研究的體系中則主要促進(jìn)了Betaproteobacteria反硝化菌的富集.

Soil和 Soil+Fe(II)處理在屬水平中均以Belliinea、Thermodefovibrio、Geobacter和vogesella的相對(duì)豐度較高,且隨著時(shí)間的變化它們的相對(duì)豐度保持較為穩(wěn)定水平(≤7%)(圖 4B).這說(shuō)明Fe(II)的加入對(duì)原始土壤的微生物群落組成沒(méi)有明顯的影響.在 Soil+NO3-處理中,主要的優(yōu)勢(shì)菌屬為Pseudogulbenkiania(1.7%～34%)、Vogesella(2.8%～25%)和Dechloromonas(1.3%～12%)(圖 4B).這 3種菌屬均具有硝酸鹽還原功能[35-37].在Soil+Fe(II)+NO3-處理中,主要的優(yōu)勢(shì)菌屬為Rhodocyclus(0.1%～52%)和Dechloromonas(1.3%～39%)(圖 4B).據(jù)報(bào)道,Rhodocyclus在微氧條件下具有 Fe(II)氧化功能, 而Dechloromonas則具有硝酸鹽還原型亞鐵氧化功能[16,38].由此可見(jiàn),在 Soil+NO3-和Soil+ Fe(II)+NO3-處理中的優(yōu)勢(shì)微生物及其相對(duì)豐度有著明顯的差異,說(shuō)明Fe(II)的加入對(duì)稻田土壤中微生物群落的組成有明顯的影響.

2.5 反硝化功能微生物群落組成

圖5A中narG-硝酸鹽還原功能微生物群落組成可知,富集培養(yǎng)到第 8d時(shí),Dechlorosomas agitata(11%)和Pseudogulbenkiania ferrooxidans(6.4%)是Soil+NO3-處理中主要的narG-細(xì)胞膜硝酸鹽還原優(yōu)勢(shì)微生物,說(shuō)明上述 2種菌屬是本文所研究的稻田土壤中通過(guò)細(xì)胞膜酶還原硝酸鹽的功能優(yōu)勢(shì)微生物.由于本實(shí)驗(yàn)未能擴(kuò)增出Soil和Soil+Fe(II)處理中napA基因用于克隆文庫(kù)分析,因此圖 5B中只展示了 Soil+NO3-和Soil+Fe(II)+NO3-處理在第8d時(shí)napA基因的克隆文庫(kù)結(jié)果. 在Soil+NO3-處理中,主要的 napA-周質(zhì)硝酸鹽還原功能微生物包括Dechloromonas denitrificans-1(44%)、Dechloromonas agitata-1(20%)和Dechloromonas denitrificans-2(16%),三者的相對(duì)豐度總和高達(dá) 80%,表明Dechloromonas是本實(shí)驗(yàn)稻田土壤中具有周質(zhì)硝酸鹽還原基因的優(yōu)勢(shì)菌屬.在 Soil+NO3-處理中,不管是發(fā)生在細(xì)胞膜還是周質(zhì)中的硝酸鹽還原過(guò)程,其主要功能微生物菌屬均為Dechloromonas,由此可見(jiàn)該菌在稻田土壤中對(duì)NO3-的還原起著重要作用.盡管對(duì)于單個(gè)微生物來(lái)說(shuō)一個(gè)基因組可能攜帶高達(dá)3個(gè)narG基因拷貝而僅擁有一個(gè)napA基因拷貝[39],然而本文結(jié)果表明,在Fe(II)存在的條件下,napA基因拷貝數(shù)明顯高于narG基因拷貝數(shù),說(shuō)明在加入 Fe(II)后,napA在厭氧稻田環(huán)境中起主導(dǎo)作用.

圖4 不同處理中細(xì)菌群落在門(mén)水平和屬水平隨反應(yīng)時(shí)間的變化Fig.4 Changes in bacterial communities with time dependence at the (A) phyla level and (B) genus level detected in different treatments僅顯示相對(duì)豐度大于5%的微生物群落

在Soil+Fe(II)+NO3-處理中,相對(duì)豐度較高的napA-周質(zhì)硝酸鹽還原功能微生物為Azonexus hydrophilus(34%)、Dechloromonas denitrificans-1(27%)和Azospira oryzae(17%).與上述Soil+NO3-處理的結(jié)果相比,Fe(II)的加入顯著影響厭氧稻田土壤中napA-硝酸鹽還原功能微生物群落的結(jié)構(gòu)組成.目前關(guān)于 Fe(II)對(duì)硝酸鹽還原功能微生物群落組成的影響尚未有報(bào)道.根據(jù)narG和napA基因定量結(jié)果,與 Soil+NO3-處理相比較,Fe(II)的存在降低了 Soil+Fe(II)+NO3-處理中narG基因的拷貝數(shù)(圖3B),而提高了napA基因的拷貝數(shù)(圖 3C),也就是說(shuō)Azonexus、Dechloromonas和Azospira是Fe(II)存在的情況下NO3-還原的主要功能微生物.Azonexus、Dechloromonas和Azospira均屬于Proteobacteria,其中Dechloromonas和Azospira都屬于硝酸鹽還原型亞鐵氧化菌,在還原 NO3-的同時(shí)還可以氧化Fe(II)[35,40].Nar和Nap這兩種異化硝酸鹽還原酶的主要區(qū)別是它們?cè)谖⑸锛?xì)胞中所處的位置不同,分別位于細(xì)胞膜和周質(zhì)中[4].Nar通常存在于 Proteobacteria、Frmicutes、Actinobacteria、甚至于Archaea中,而Nap僅存在于 Proteobacteria[41-42].與 Nar相比,目前關(guān)于Nap在微生物中的生理地位尚不清楚.根據(jù)現(xiàn)有的報(bào)道,Nap在不同微生物中的功能是不同的,比如：在光合細(xì)菌Rhodobacter capsulatus和Rhodobacter sphaeroides中Nap的主要作用就是催化NO3-的還原來(lái)重新平衡電子循環(huán)傳輸[44];而對(duì)于厭氧微生物在反硝化過(guò)程中利用 Nap會(huì)減少能量的消耗[42].還有文獻(xiàn)報(bào)道提出,在厭氧條件下Nap可以取代Nar作為一種可供選擇的代謝方式[44-45].

圖5 反應(yīng)結(jié)束時(shí)(第8d)基于硝酸鹽還原基因narG和napA構(gòu)建的克隆文庫(kù)中每個(gè)OUT在不同處理中的物種相對(duì)豐度Fig.5 Relative abundance of OTUs identified to be nitrate-reducing bacteria based on narG (A) and napA (B) gene DNA clone library sequencing in different treatments at the end of incubation (Day 8)僅顯示相對(duì)豐度大于1%的OTU

圖 6亞硝酸鹽還原功能微生物群落組成表明,在Soil和Soil+Fe(II)處理中,主要的亞硝酸鹽還原優(yōu)勢(shì)微生物是Dechloromonas、Sideroxydans、Chloroflexi和Oceanithermus,它們的相對(duì)豐度低于9%.在Soil+NO3-處理中,優(yōu)勢(shì)的亞硝酸鹽還原微生物包括Dechloromonas(33%)、Vogesella(6.6%)和Pseudogulbenkiania(6.0%).在Soil+Fe(II)+NO3-處理中,Dechloromonas(29%)和Dechlorospirillum(13%)是主要的亞硝酸鹽還原優(yōu)勢(shì)微生物.Dechloromonas和Dechlorospirillum都具有Fe(II)氧化功能,Dechloromonas是硝酸鹽依賴(lài)亞鐵氧化菌,Dechlorospirillum在微好氧條件下能夠氧化 Fe(II)[35,46].因此,Fe(II)的存在能夠改變稻田境中的微生物群落結(jié)構(gòu)并促使稻田環(huán)境中亞鐵氧化菌的富集.

圖 7中氧化亞氮還原功能微生物群落組成顯示,Bradyrhizobium和Thiobacillus是 Soil、Soil+Fe(II)、Soil+NO3-和Soil+Fe(II)+NO3-處理中的 N2O還原優(yōu)勢(shì)微生物,Fe(II)的添加對(duì)稻田環(huán)境中的氧化亞氮還原微生物并沒(méi)有明顯的影響.文獻(xiàn)報(bào)道Bradyrhizobium和Thiobacillus在氮循環(huán)中起著重要作用,分別具有固氮和脫氮功能[47-48].

圖6 反應(yīng)結(jié)束時(shí)(第8d)不同處理中nirS基因編碼的亞硝酸鹽還原微生物在屬水平的分布Fig.6 Relative abundance (%) of nirS-encoding nitritereducing bacteria at the genus level detected in different treatments at the end of incubation (Day 8)僅顯示相對(duì)豐度高于1%的屬

圖7 反應(yīng)結(jié)束時(shí)(第8d)不同處理中nosZ基因編碼的氧化亞氮還原微生物在屬水平的分布Fig.7 Relative abundance (%) of nosZ encoding nitrous oxide-reducing bacteria at the genus level detected in different treatments at the end of incubation (Day 8)僅顯示相對(duì)豐度高于1%的屬

3 結(jié)論

3.1 在中性厭氧稻田中, Fe(II)的存在延滯了NO3-的還原,但促進(jìn)了NO2-的進(jìn)一步還原和N2O的生成.

3.2 Fe(II)存在的情況下,降低了細(xì)胞膜硝酸鹽還原基因narG的拷貝數(shù),但提高了亞硝酸鹽還原基因nirS和N2O還原基因nosZ的拷貝數(shù),其硝酸鹽還原過(guò)程主要發(fā)生在基于napA基因的周質(zhì)上.

3.3 Fe(II)影響了基于16S rRNA的微生物群落組成,其中 Soil+NO3-處理的優(yōu)勢(shì)菌屬為Pseudogulbenkiania、Vogesella和Dechloromonas,而 Soil+Fe(II)+NO3-處理的優(yōu)勢(shì)菌屬為Dechloromonas和Rhodocyclus.

3.4 Fe(II)的加入改變了napA-周質(zhì)硝酸鹽還原微生物群落的組成結(jié)構(gòu),降低了Dechloromonas的相對(duì)豐度,提高了Azonexus和Azospira的相對(duì)豐度;并提高了nirS-亞硝酸鹽還原優(yōu)勢(shì)菌Dechlorospirillum的相對(duì)豐度;對(duì)narG-細(xì)胞膜硝酸鹽還原菌和nosZ-氧化亞氮還原菌的群落組成沒(méi)有明顯影響.

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