王曉娟 答邦明 丁亞文 馮 剛

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院腫瘤科，湖北 武漢 430033)

非小細胞肺癌(NSCLC)約占所有肺癌類型的80%〔1〕。NSCLC的治療策略包括放療、化療及與最新發(fā)展的細胞治療、免疫療法和靶向藥物治療相結(jié)合。新的診療方法提高了NSCLC患者的生存率。但目前早期診斷的NSCLC患者5年生存率為40%～67%，進展期NSCLC患者中位生存期僅有2年〔2〕。多種腫瘤抑制基因的失活或某些致癌基因的超表達在肺癌發(fā)生發(fā)展中起重要調(diào)控作用，本研究初步探討微小RNA分子(miR)-126在體外對NSCLC細胞系A(chǔ)549細胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲性的影響。

1 材料與方法

1.1實驗細胞 正常肺上皮細胞系16-HBE細胞和肺癌細胞系A(chǔ)549細胞購于 American Type Culture Collection(ATCC)，培養(yǎng)于37℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的 DMEM 完全培養(yǎng)基，每3 d換液1次。

1.2主要試劑和儀器 TRIzol購自Invitrogen公司，DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購于Gibco公司，MTT試劑盒購于sigma公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green qPCR Supermix購于全式金公司。miR-126 mimic、inhibitor及其陰性對照購于廣州銳博。

1.3實驗方法

1.3.1實時定量PCR 通過TRIzol提取細胞總RNA，20 ng總RNA逆轉(zhuǎn)錄用來合成cDNA。2.5 μl cDNA、1 μl miR-126特異性引物與SYBR Green qPCR Supermix混合后進行實時定量PCR測定。以小RNA分子U6為內(nèi)參定量miR-126濃度。

1.3.2細胞活性檢測 A549細胞接種于96孔板，每孔200 μl培養(yǎng)基，接種3 000個細胞。細胞培養(yǎng)在37℃ 5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱24～72 h，之后每孔添加20 μl噻唑藍(MTT)。細胞繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸取培養(yǎng)基后，每個孔添加150 μl二甲基亞砜(DMSO)10 min，搖動培養(yǎng)板促進結(jié)晶溶解均勻。酶標(biāo)儀下，570 nm處檢測每個孔光學(xué)密度(OD)值。

1.3.3細胞劃痕試驗 A549細胞種于6孔板，垂直于水平軸在板底劃一條直線，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次洗掉浮起的細胞。添加無血清培養(yǎng)基后在37℃和5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。倒置顯微鏡下分別于0、24、48 h拍照。愈合率=(初始寬度-目前寬度)/初始劃痕寬度×100%。

1.3.4Transwell實驗 A549細胞轉(zhuǎn)染后用無血清培養(yǎng)基制成單細胞懸液。溶解的基底膜基質(zhì)(30 μl)被添加到每個Transwell上層膜上，然后將小室插入24孔板。將細胞懸液加入小室中，培養(yǎng)24 h后刮去膜上層細胞，結(jié)晶紫染色膜下層細胞，顯微鏡下拍攝計數(shù)細胞侵襲數(shù)目。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件進行方差分析及q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1miR-126在A549細胞中的表達 A549細胞株中miR-126水平(0.27±0.05)明顯低于16-HBE細胞(1.00±0.26，P<0.01)。

2.2miR-126對A549細胞增殖能力的影響 MTT結(jié)果表明，與空白組(OD值：0.41±0.07)和對照組(0.43±0.05)相比，miR-126 mimic可明顯降低A549細胞的增殖率(0.27±0.02)，miR-126 inhibitor可明顯增加A549細胞的增殖率(0.61±0.08，P<0.01)。

2.3miR-126對A549細胞遷移的影響 細胞劃痕試驗結(jié)果顯示，miR-126 mimic組劃痕修復(fù)率(37.6%±6.9%)明顯低于對照組(52.3%±10.2%)和空白組(55.7%±94.0%，P<0.01)。miR-126 inhibitor組(69.7%±6.2%)明顯高于對照組和空白組(P<0.05)。

2.4miR-126對A549細胞侵襲性的影響 Transwell實驗結(jié)果顯示，miR-126 mimic組小室膜下細胞數(shù)目〔(216.5±31.2)個〕明顯低于對照組〔(411.0±41.7)個、(425.1±49.5)個，P<0.01〕。miR-126 inhibitor組〔(662.4±94.3)個〕明顯高于對照組和空白組(P<0.01)。

3 討 論

mRNA長度在18～25個核苷酸，通過與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)(UTR)不完全配對結(jié)合對靶基因起到負調(diào)控作用。mRNA在幾乎所有的生理學(xué)和病理生理學(xué)過程如細胞分化、增殖、凋亡及細胞周期中扮演一個至關(guān)重要的角色。在腫瘤中，多種mRNA表達異常，mRNA可能作為一個腫瘤抑制基因或致癌基因在腫瘤的生物學(xué)行為中起到關(guān)鍵調(diào)控作用〔3〕。miR-126是一個與內(nèi)皮細胞功能相關(guān)的mRNA，其基因位于人類9號染色體表皮生長因子(VEGF)基因區(qū)域內(nèi)〔4〕。在高度血管化的組織，包括心、肺、肝或人類臍靜脈內(nèi)皮細胞中miR-126呈高水平表達，促進血管生成和維護血管完整性〔5〕。miR-126在多種腫瘤組織中表達明顯減少。本研究提示miR-126對肺癌的生物學(xué)行為可能有重要的調(diào)控作用。

miR-126在不同類型癌癥的具體作用仍存在爭議。腫瘤細胞的增殖、遷移及侵襲是腫瘤發(fā)展的主要幾種生物學(xué)行為，是影響惡性腫瘤患者預(yù)后的重要因素，受到多種基因調(diào)控。既往研究顯示，miR-126可通過下調(diào)VEGF-A的表達抑制食道癌的轉(zhuǎn)移〔6〕。miR-126還可通過抑制BCL2L2促進宮頸癌細胞的凋亡〔7〕。此外，miR-126還可通過不同的靶點對肝癌、慢性淋巴癌和腎細胞癌等多種惡性腫瘤起到抑制作用〔8～10〕。本研究結(jié)果表明，miR-126可明顯抑制A549細胞體外增殖、遷移和侵襲能力。

通過生物信息學(xué)手段可發(fā)現(xiàn)PIK3R2可能是miR-126的潛在靶基因。PIK3R2編碼的蛋白質(zhì)是構(gòu)成磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的重要組成部分，PI3K/絲氨酸/蘇氨酸激酶信號通路是一個重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可以調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡和細胞周期〔11〕。既往研究顯示，miR-126可以通過調(diào)控PIK3R2對滑膜成纖維細胞增殖、膀胱癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移起到調(diào)控作用〔12，13〕。miR-126可能通過靶向PIK3R2調(diào)控PI3K信號途徑對A549細胞體外增殖、遷移和侵襲能力起到抑制作用。

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