陳 楠，李曉莉，張 巖

(1. 上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院脊柱病研究所，上海 200032；2. 教育部“筋骨理論與治法”重點實驗室，上海 200032；3. 上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院，上海 200093)

骨質疏松癥(osteoporosis, OP)是一種以骨量減少或(和)骨微結構破壞為特征，造成骨脆性增加，容易發(fā)生骨折的全身代謝性骨病。目前，世界衛(wèi)生組織已將OP、糖尿病、阿爾茨海默病列為危害中老年人健康的三大殺手。隨著人口老齡化現(xiàn)象的出現(xiàn)，OP的發(fā)病率也不斷增加。全世界范圍內(nèi)，每3 s會發(fā)生1例骨質疏松性骨折。我國是全球OP患者最多的國家，40歲以上人群約有1.12億患者，發(fā)病率高達19.74%[1]。目前，臨床針對OP的治療藥物并不多，且大多不良反應比較嚴重，不能滿足現(xiàn)階段臨床需要。因此，從中草藥中尋找和開發(fā)新型抗OP藥物已經(jīng)成為熱門研究課題，并具有重要臨床意義。

女貞子為木犀科常綠喬木植物女貞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果實，最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，謂其能“主補中，安五臟，養(yǎng)精神，除百病，久服肥健，輕身不老”，故列為上品?，F(xiàn)代研究表明，女貞子藥理作用主要包括降血糖、調(diào)血脂、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護、抗炎抑菌、抗細胞凋亡、保肝等[2]。近些年的基礎研究不斷深入，尤其在女貞子防治OP方面的研究取得突破進展[3]。本文依據(jù)國內(nèi)外文獻，對女貞子及其所含主要活性成分防治OP可能的作用途徑與機制進行綜述，為女貞子的進一步開發(fā)與臨床應用奠定基礎。

1 女貞子防治OP的作用途徑

1.1調(diào)控鈣代謝-維生素D系統(tǒng)維生素D2和維生素D3是與人類健康緊密相關的維生素D(vitamin D, VD)的兩種營養(yǎng)分子，但這兩種成分體內(nèi)并無生物活性，需連續(xù)經(jīng)過肝臟25-羥化酶、腎臟1α-羥化酶(1-OHase)的作用，轉化為VD生物活性形式1,25-雙羥維生素D[1,25-(OH)2D]，可增加腸道鈣吸收，減少尿鈣排泄，維持體內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，增強肌力，改善平衡。

Zhang等[4]發(fā)現(xiàn)，女貞子可以促進活性維生素D3生物合成、調(diào)控維生素D受體(vitamin D receptor, VDR)和鈣結合蛋白表達，促進腸鈣吸收，抑制高尿鈣排泄，提高老年♀大鼠、老年去卵巢大鼠[5]皮質骨的骨礦含量(bone mineral content, BMC)、骨密度(bone mineral density, BMD)[6]，提高糖尿病小鼠松質骨BMD[7]。據(jù)最近的兩篇綜述報道[8-9]，Zhang等是首次從中藥及天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)并系統(tǒng)研究了女貞子調(diào)控鈣代謝平衡、維生素D內(nèi)分泌代謝的研究團隊。隨后，Dong等[10]研究發(fā)現(xiàn)，女貞子提取物給藥后的假手術組大鼠、去卵巢(ovariectomized, OVX)組大鼠血清1,25(OH)2D3含量均明顯提高，同時提高了假手術組大鼠腎臟1-OHase和VDR的蛋白、mRNA表達，以及OVX大鼠腎臟1-OHase的蛋白表達；體外實驗中，女貞子提取物可以提高原代培養(yǎng)腎小管細胞1-OHase mRNA表達和活性，從而提高活性維生素D的生物合成，提高血液1,25(OH)2D3水平[7]，達到治療OP的作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，女貞子提取物可以上調(diào)處于生長期的♂大鼠[11]、♀大鼠[12]十二指腸黏膜鈣主動轉運蛋白，如鈣結合蛋白表達，從而提高腸鈣吸收，增加骨量，改善骨的性能。

1.2調(diào)控OPG-RANKL-RANK通路骨保護蛋白(osteoprotegerin, OPG)、核因子-κB受體活化因子(receptor activator of NF-κB, RANK)和核因子-κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand, RANKL)系統(tǒng)是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的調(diào)控破骨細胞分化的通路，介導破骨細胞參與的骨吸收作用和骨重建過程。在調(diào)控成熟破骨細胞生成過程中，當破骨前體細胞膜的RANK與成骨細胞分泌的RANKL結合后，在腫瘤壞死因子受體相關因子的參與下，啟動下游級聯(lián)信號傳導，最終誘導破骨細胞分化成熟，并且抑制破骨細胞凋亡。骨髓間充質細胞和成骨細胞在產(chǎn)生RANKL的同時，也產(chǎn)生了OPG干擾RANKL信號傳導。OPG作為可溶性誘餌受體，競爭性地與RANKL結合，使其失去結合RANK的活性，負性調(diào)節(jié)RANKL-RANK的相互作用，從而抑制破骨細胞前體分化、存活與融合，誘導破骨細胞凋亡，使骨吸收與骨形成達到一個相對平衡的狀態(tài)。因此，OPG-RANKL-RANK信號系統(tǒng)相互制約，綜合調(diào)控著骨密度和骨強度。

Lyu等[12]給大鼠分別喂飼具有女貞子提取物不同含量(0.40%、0.65%、0.90%)的AIN-93G飼料，16周后發(fā)現(xiàn)，女貞子提取物明顯降低血清骨吸收標志物CTX-I的含量，同時降低RANKL/OPG比值。有研究人員通過對RAW264.7小鼠巨噬細胞的體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，女貞子提取物可以通過抑制RANKL通路來減少破骨細胞，降低RANKL/OPG比值，達到抗骨質疏松的作用[13]。Li等[14]使用女貞子水提取物處理MC3T3-E1成骨細胞，發(fā)現(xiàn)女貞子對成骨細胞存活率不僅存在著濃度依賴性，還存在時間依賴性，此外，通過ERK、p38、Akt等信號通路，調(diào)控MC3T3-E1細胞OPG、RANKL分子的表達，從而影響破骨細胞的成熟。

1.3調(diào)控CaSR-PTH軸甲狀旁腺激素(parathyroid hormone, PTH)是維持血鈣平衡的重要激素之一，可以促進鈣的重吸收，減少鈣從尿液中排泄，間接提高腸道對鈣的吸收，提高骨密度、骨強度和改善骨的微結構。PTH的合成與分泌受位于甲狀旁腺的鈣敏受體(calcium-sensing receptor, CaSR)所調(diào)控，而CaSR的活性取決于血循環(huán)中Ca2+的濃度變化。Dong等[15]將4月齡成熟♀SD大鼠隨機分組，分別喂飼鈣含量為0.1%、0.6%、1.2%的低鈣、中鈣、高鈣飼料，發(fā)現(xiàn)女貞子水提物有效升高中鈣組、高鈣組大鼠血清PTH水平，減少尿鈣、糞鈣含量，維持體內(nèi)鈣平衡。Zhang等[7]發(fā)現(xiàn)，女貞子水提物可明顯糾正糖尿病小鼠鈣代謝失衡，并將血清PTH水平提高46%，同時，通過調(diào)控腎臟CaSR的mRNA、蛋白表達，提高腎小管對鈣的重吸收能力。

1.4調(diào)控骨髓間充質干細胞定向分化女貞子可以促進成骨細胞的增殖，增加骨形成，改善骨代謝，發(fā)揮抗骨質疏松的作用。通過女貞子水提取物對老年大鼠骨保護作用的機制研究[16]，發(fā)現(xiàn)女貞子能夠刺激骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向成骨細胞分化[17]，抑制其向脂肪細胞和破骨細胞分化。通過對女貞子的體內(nèi)、體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，女貞子可能是通過增加MSCs細胞外基質、增加基質蛋白質合成、促進生長因子相關信號通路等途徑，促進MSCs向成骨細胞分化。隨后研究采用檢測堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性和礦化作用來評價MSCs的成骨分化能力，結果發(fā)現(xiàn)，女貞子可以明顯刺激ALP活性，縮短MSCs增殖分化時間，同時MSCs向成骨細胞分化過程中的部分調(diào)控因子表達也出現(xiàn)上調(diào)，最終發(fā)揮抗骨質疏松作用。

1.5抗氧化作用氧化應激是人體內(nèi)的正常現(xiàn)象，參與體內(nèi)氧化-還原平衡的各種酶系統(tǒng)維持了生理狀態(tài)低水平活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平。ROS作為細胞內(nèi)的氧化-還原信號分子，參與調(diào)控骨代謝，包括RANKL依賴的破骨細胞的分化。Wang等[18]將♀大鼠雙側卵巢切除后，按照大鼠重量每千克給予3.5 g女貞子水提物，灌胃處理12周，發(fā)現(xiàn)血清總抗氧化能力(total antioxidant capacity, TAC)和一氧化氮水平增加，血清、脛骨、子宮丙二醛和8-羥基脫氧鳥嘌呤(8-OHdG)水平下降，而且脛骨和子宮腔內(nèi)的NOX4、NF-κB p65、p-IκBα的表達下調(diào)，這些實驗數(shù)據(jù)都表明女貞子具有一定的體內(nèi)抗氧化作用。在骨組織，女貞子可能通過抑制NOX4/ROS/NF-κB信號通路，達到抗骨質疏松的作用，從而提供了另一條女貞子防治OP的可能作用途徑。

2 女貞子在復方中的應用

中成藥二至丸，由女貞子和墨旱蓮兩味藥組成，其中女貞子為君藥，墨旱蓮為臣藥，各占50%，滋腎養(yǎng)肝，治療因肝腎陰虛導致的頭暈耳鳴、腰膝酸痛、失眠多夢等。Cheng等[19]對60只3月齡OVX大鼠進行隨機分組處理，結果發(fā)現(xiàn)，二至丸可以明顯抑制大鼠卵巢切除后引起的骨丟失和骨小梁微結構改變，提高OVX大鼠血鈣、血磷水平。此外，二至丸能在一定程度上促進圍絕經(jīng)期婦女成骨細胞增殖分化。有學者基于UPLC/Q-TOF-MS技術，采用PCA和OPLS-DA方法分析了二至丸中女貞子與墨旱蓮配伍前后化學成分的變化，研究表明二者配伍前后成分含量差異明顯，主要的指標性成份含量明顯升高，而且女貞子中的三萜類、環(huán)烯醚萜類、苯醇類成分，以及墨旱蓮中的三萜皂苷類、黃酮類、有機酸類成分在兩藥配伍后溶出量增加，這對機體的吸收發(fā)揮重要作用，從化學成分含量變化的角度，初步揭示了女貞子與墨旱蓮藥對配伍的科學內(nèi)涵。

根據(jù)中醫(yī)藥理論，骨健康與腎功能密切相關，而腎虛被認為是骨骼和骨關節(jié)相關疾病的根源。由于女貞子通常被用作補足腎陰虛，所以會和補足腎陽虛的淫羊藿組成復方，該復方可以通過減緩骨代謝來減輕骨質疏松大鼠病理癥狀，并且提高骨礦含量和力學性能。Yang等[20]將女貞子和淫羊藿兩種藥材以3 ∶4的比例混合，對糖皮質激素性骨質疏松大鼠給藥8周，與對照組相比，復方藥物能明顯增加血清骨源性堿性磷酸酶(B-ALP)、血清骨γ羧基谷氨酸蛋白、血清骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2等骨代謝標志物，降低血清抗酒石酸酸性磷酸酶和I型膠原羧基末端肽交聯(lián)含量，抑制骨吸收和增加骨密度，改善骨的力學特性。

含淫羊藿(E)、女貞子(L)和補骨脂(P)三味藥的傳統(tǒng)復方制劑ELP已被證明能明顯抑制老年去勢♀骨質疏松大鼠脊柱BMD丟失。對3月齡SD大鼠進行尾懸吊法建立廢用性骨質疏松模型，將女貞子、淫羊藿以及補骨脂按照生藥材重量比4 ∶5 ∶1的比例混合、浸泡、蒸餾，制成復方水提物，發(fā)現(xiàn)復方ELP可以明顯抑制大鼠后肢的BMD流失[21]。進一步實驗研究發(fā)現(xiàn)，ELP提取物明顯上調(diào)MSCs的ALP基因表達，可以促進成骨細胞活性。另有研究將復方ELP的3種單味藥進行排列組合，將復方ELP與其他組合比較，以考證復方ELP抗骨質疏松作用。從各組合不同藥物代謝動力學參數(shù)可以明顯發(fā)現(xiàn)，ELP組合更加有效，在抗骨質疏松方面3種草藥出現(xiàn)協(xié)同增效作用。

3 女貞子活性成分抗骨質疏松作用研究

女貞子化學成分包括三萜類、黃酮類、環(huán)烯醚萜類、苯乙醇苷類等化合物，根據(jù)中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺收錄，女貞子中所含化合物超過200種之多，其中女貞子主要活性成分是齊墩果酸、熊果酸、紅景天苷、苷元酪醇等。

3.1齊墩果酸(oleanolicacid,OA) OA屬于五環(huán)三萜類化合物，常以游離體和配糖體存在于女貞子等多種植物中。OA具有多種生物學作用，如抗病毒、消炎、抗氧化等，且細胞毒性較低。隨著對OA的不斷深入研究，目前已經(jīng)證明，OA在動物實驗中提高去卵巢和更年期大鼠體內(nèi)雌二醇水平；提高絕經(jīng)期婦女的外周血清雌激素受體表達水平。3月齡小鼠去卵巢造模1周后，經(jīng)OA治療3個月，發(fā)現(xiàn)OA能夠明顯抑制OVX小鼠破骨細胞活性，增強骨密度。Shu等[22]進一步揭示了OA對MSCs向成骨細胞分化的影響，發(fā)現(xiàn)OA在誘導MSCs分化過程中，ALP染色明顯增強，且存在劑量依賴性，表明OA可誘導體外骨髓基質干細胞成骨。為了尋找可能參與這一過程的調(diào)控分子，通過RT-PCR定量鑒定了幾種成骨標記物基因。相比于對照組，早期成骨細胞標記物I型膠原(COL1A1)、ALP、轉錄因子Runx2的表達增加，而晚期成骨標記物OC和OPN保持不變，這表明OA主要在MSCs成骨分化的起始階段起作用。

3.2紅景天苷(salidroside,SAL) SAL屬于酚苷類化合物，可以從天然植物中提取，也可以人工合成，主要藥理作用包括抗腫瘤、保護心肌缺血損傷、保肝護腎等。SAL體內(nèi)、外具有較好的抗氧化應激作用。低氧誘導因子1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)在骨生成和骨的發(fā)育中起著至關重要的作用。有研究報道[23]，小鼠源成骨細胞MC3T3-E1經(jīng)H2O2刺激后，相較于模型組，SAL能明顯提高細胞存活率，提高ALP活性、鈣沉積，降低細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，上調(diào)ALP、COL1A1、OC的轉錄水平，并下調(diào)誘導破骨細胞分化的細胞因子如RANKL、IL-6表達，通過降低骨吸收因子和減少氧化損傷來達到防治骨質疏松作用。Li等[24]以人成骨樣細胞MG-63和新生大鼠顱骨成骨細胞(rat osteoblastic cell，ROB)為研究模型，體內(nèi)以OVX大鼠為模型，研究細胞中常氧和低氧狀態(tài)下，SAL對HIF-1信號通路的調(diào)控作用。結果表明，SAL預處理能明顯減輕細胞缺氧所導致的活力下降、凋亡，下調(diào)HIF-1的表達，但是HIF-1的轉錄活性增加，從而上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子；體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，SAL改善了OVX大鼠骨小梁結構，增加股骨遠端骨密度。

4 小結

一系列基礎研究與臨床研究結果顯示，女貞子及其復方都具有較好的抗骨質疏松作用[25]。已有的藥理研究揭示女貞子可通過多種作用途徑發(fā)揮抗骨質疏松作用，這為女貞子的藥物開發(fā)與綜合利用，尤其是抗骨質疏松中藥研發(fā)提供了堅實的實驗基礎。女貞子所含的某些活性成分也顯示具有抗骨質疏松作用，對其藥理作用機制還有待深入研究，尤其是哪些活性成分具有調(diào)控維生素D代謝、CaSR-PTH軸等的生物學作用，需要后續(xù)進一步探索。