陶河清 綜述 丁士剛 審校

(北京大學(xué)第三醫(yī)院消化科，北京 100191)

結(jié)直腸腫瘤作為常見的消化道惡性腫瘤，其早期發(fā)現(xiàn)和治療可有效改善患者預(yù)后。內(nèi)鏡技術(shù)的發(fā)展使得多數(shù)結(jié)直腸腫瘤在早期即可得到診斷及治療，然而受限于內(nèi)鏡預(yù)約時(shí)間長(zhǎng)、患者體驗(yàn)差以及對(duì)術(shù)者資質(zhì)的要求等，我國(guó)很多地區(qū)難以大規(guī)模開展內(nèi)鏡下結(jié)直腸腫瘤的篩查。腫瘤標(biāo)志物尤其是腫瘤血清學(xué)標(biāo)志物所具有的創(chuàng)傷小、便于開展大規(guī)模篩查的優(yōu)勢(shì)對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸腫瘤有著重要意義。

雙腎上腺素樣激酶1(double cortin-like kinase 1，DCLK1)最初被認(rèn)為是微管相關(guān)蛋白基因家族成員，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、神經(jīng)細(xì)胞的遷移以及外向生長(zhǎng)過程中起著重要作用[1]。DCLK1編碼的蛋白在細(xì)胞中存在2種形式：DCLK1-L和DCLK1-S。DCLK1-L蛋白存在2個(gè)N端結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C端結(jié)構(gòu)域，DCLK1-S只有一個(gè)C端結(jié)構(gòu)域。N端結(jié)構(gòu)域中氨基酸序列和double cortin有70%的同源性，后者被證實(shí)在神經(jīng)起源過程中起重要作用；而位于C端的酪氨酸/絲氨酸激酶區(qū)則與鈣離子依賴的蛋白激酶(calmodulin-dependent protein kinase 1，CaMK1)高度相似[2]，因此也有部分研究將DCLK1稱為DCAMKL-1。

然而近年來越來越多的研究者開始關(guān)注DCLK1在結(jié)直腸腫瘤起源中的意義，最初的研究顯示DCLK1+細(xì)胞多能性基因、促存活基因的表達(dá)明顯較多，且表現(xiàn)出較強(qiáng)的自我更新能力[3]，懸浮培養(yǎng)基培養(yǎng)單個(gè)腸道DCLK1陽(yáng)性成熟細(xì)胞誘導(dǎo)其形成球狀體，將后者注射入裸鼠體內(nèi)形成結(jié)節(jié)，分析顯示結(jié)節(jié)內(nèi)DCLK1陽(yáng)性細(xì)胞可表達(dá)原有組織早期分化標(biāo)志，并可分化為原有組織的不同細(xì)胞[4]；這些實(shí)驗(yàn)提示腸組織中DCLK1陽(yáng)性細(xì)胞具有干細(xì)胞或祖細(xì)胞的潛能。然而DCLK1作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志和結(jié)直腸惡性腫瘤發(fā)病之間的關(guān)系是十分復(fù)雜的。本文主要對(duì)DCLK1在結(jié)直腸惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用進(jìn)行綜述。

1 DCLK1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的生物學(xué)作用

DCLK1和結(jié)直腸腫瘤的關(guān)系最初是作為腸隱窩叢細(xì)胞的特異性分化抗原而被人熟知的。生理狀態(tài)下叢細(xì)胞壽命較長(zhǎng)并且處于靜止?fàn)顟B(tài)，即使APC基因突變也不會(huì)導(dǎo)致這些靜止期細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞發(fā)展，但在突變基礎(chǔ)上的炎癥刺激或組織損傷即可激活叢細(xì)胞并促發(fā)結(jié)腸癌[4]，這表明DCLK1+的叢細(xì)胞對(duì)于結(jié)腸癌的發(fā)生具有重要意義。Nakanishi等[5]研究顯示，DCLK1的表達(dá)可促進(jìn)ApcMin/+小鼠體內(nèi)腺瘤增生，使用他莫昔芬和白喉毒素毒殺DCLK1+細(xì)胞抑制腫瘤增長(zhǎng)的同時(shí)不影響正常腸組織，提示DCLK1可能是腫瘤干細(xì)胞而非正常干細(xì)胞的標(biāo)志。DCLK1+細(xì)胞在健康人結(jié)腸組織中很少被檢測(cè)到，而其在結(jié)腸癌患者的健康結(jié)腸黏膜或處于早期病變的黏膜中卻呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)，表明腫瘤起源的早期階段即可存在DCLK1的高表達(dá)[6]。miRNA-137可以在mRNA水平與DCLK1結(jié)合抑制后者表達(dá)，使用表達(dá)抗miRNA-137的慢病毒與人原始結(jié)腸細(xì)胞共培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組DCLK1的表達(dá)水平明顯升高且類器官體積顯著增大[7]。DCLK1+的Apc突變小鼠體內(nèi)β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、Notch和NFk促存活信號(hào)表達(dá)相比于DCLK1-小鼠明顯較高，抑制Notch和RELA可以降低結(jié)腸癌細(xì)胞增殖速率，敲除DCLK1則可引起Notch、RELA和MAPK下降，更有效地抑制癌細(xì)胞增殖和遷移[8]。協(xié)同使用姜黃素和可以靶向于DCLK1引起DCLK1+細(xì)胞凋亡的DCLK1-siRNA治療對(duì)前者耐藥的結(jié)腸腫瘤時(shí)，其腫瘤體積縮小優(yōu)于任何單一成分[9]。這些研究證實(shí)DCLK1在結(jié)腸腫瘤發(fā)生和促存活過程中發(fā)揮著重要的上游調(diào)控作用，靶向作用于上游的DCLK1可以在整個(gè)細(xì)胞存活通路上抑制腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，這為結(jié)腸癌的治療提供思路。

DCLK1啟動(dòng)子在人類結(jié)直腸癌中多呈現(xiàn)為高度甲基化的狀態(tài)，而在正常黏膜組織中則不表現(xiàn)為甲基化，甲基化狀態(tài)和DCLK1的表達(dá)負(fù)相關(guān)[10]，這與先前在人類結(jié)腸癌中觀察到DCLK1高表達(dá)的結(jié)果不符[11]。進(jìn)一步研究顯示在人類結(jié)腸癌細(xì)胞中DCLK1基因的5’(α)啟動(dòng)子被沉默而通過NF-κB結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)了第5內(nèi)含子啟動(dòng)子[intron 5(β)-promoter]并促進(jìn)其所編碼的DCLK1-S型表達(dá)，進(jìn)一步分析顯示正常的結(jié)腸細(xì)胞主要表達(dá)L型，而人類結(jié)腸癌細(xì)胞則主要表達(dá)S型[12]。相比于表達(dá)S型人類結(jié)腸癌細(xì)胞，L型侵襲能力更弱[13]，人胃癌中的研究也支持上述結(jié)果，正常組織和腸化生區(qū)域中均可見到S型和L型，而晚期胃癌中L型消失[14]，這意味著可能DCLK1-S型才是結(jié)腸癌發(fā)生和發(fā)展中起著決定作用的成分。FOXD3轉(zhuǎn)錄因子可抑制多種腫瘤的發(fā)生，多數(shù)腫瘤組織中FOXD3基因?yàn)槌聊瑺顟B(tài)，其沉默導(dǎo)致EGFR-Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路的激活[15]。正常結(jié)腸黏膜中FOXD3和第5內(nèi)含子啟動(dòng)子結(jié)合并抑制后者表達(dá)，而在結(jié)腸癌組織中FOXD3的沉默使其失去對(duì)DCLK1-S的抑制，敲除正常結(jié)腸組織中FOXD3也會(huì)導(dǎo)致DCLK1高表達(dá)，但表達(dá)水平較低不足以導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[16]。這些研究提示DCLK1促結(jié)腸癌發(fā)生的機(jī)制并不是線性的，可能是一個(gè)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

2 局部腫瘤組織與外周血中DCLK1的表達(dá)

DCLK1在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)升高，并且其升高與腫瘤較差的病理分級(jí)及臨床分期相關(guān)。Mirzaei等[17]選擇58例結(jié)直腸癌以β肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參，2-ΔCt法配合實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)DCLK1進(jìn)行相對(duì)定量測(cè)定，顯示癌組織DCLK1 mRNA表達(dá)水平約是交界區(qū)組織的3.28倍(P<0.001)，腫瘤分化越差，其表達(dá)水平越高(P=0.022)，Ⅲ、Ⅳ期患者比Ⅰ、Ⅱ期患者也同樣升高(P=0.015)。ELISA方法檢測(cè)DCLK1蛋白并通過組織化學(xué)評(píng)分(histochemistry score, H-score)來區(qū)分DCLK1的高表達(dá)和低表達(dá)，結(jié)果顯示83.3%的低分化腫瘤、53.8%的中分化腫瘤、37.5%的高分化腫瘤表現(xiàn)為DCLK1蛋白高表達(dá)(P=0.023)，72.3%的Ⅲ、Ⅳ期腫瘤組織和27.3%的Ⅰ、Ⅱ期腫瘤組織中DCLK1蛋白也明顯高表達(dá)(P=0.014)。

結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)的DCLK1預(yù)示著不良預(yù)后。Gao等[18]對(duì)101個(gè)新鮮結(jié)直腸癌標(biāo)本的研究證實(shí)，利用染色指數(shù)來區(qū)分DCLK1蛋白在組織中的表達(dá)程度顯示合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者其組織內(nèi)DCLK1蛋白高表達(dá)者明顯高于無轉(zhuǎn)移者(P=0.000)，提示DCLK1在腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮著重要作用。推測(cè)其原因可能是DCLK1的高表達(dá)抑制E粘連素表達(dá)的同時(shí)促進(jìn)間充質(zhì)標(biāo)志物ZEB1的表達(dá)，進(jìn)而激活上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)，促進(jìn)腫瘤突破基底膜組織，局部浸潤(rùn)侵入脈管系統(tǒng)，在脈管系統(tǒng)內(nèi)游走播散，轉(zhuǎn)移至新病灶。利用小樣本生存率估計(jì)(Kaplan-Meier分析)DCLK1水平和總存活數(shù)(overall survival，OS)之間關(guān)系，結(jié)果顯示DCLK1高表達(dá)患者5年生存率低于低表達(dá)者(P=0.016)，多變量COX回歸分析提示DCLK1水平是結(jié)直腸癌患者的獨(dú)立預(yù)后影響因素[18]。除了病理證實(shí)的結(jié)直腸癌中DCLK1表達(dá)增加之外，樂安君等[19]的研究顯示在癌前病變結(jié)直腸管狀絨毛狀腺瘤組織中DCLK1高表達(dá)率也高達(dá)45.7%，但目前尚無研究證實(shí)癌前組織內(nèi)高表達(dá)的DCLK1和預(yù)后的關(guān)系。

結(jié)直腸癌患者外周血單核細(xì)胞內(nèi)可以檢測(cè)到DCLK1蛋白。由于其含量相對(duì)較高，因此相比于鄰位連接技術(shù)(proximity ligation assay)和免疫PCR(immune-PCR)兩種敏感度較高的檢測(cè)手段，ELISA方法檢測(cè)血漿DCLK1蛋白的可操作性更強(qiáng)[20]。

Mirzaei等[20]利用ELISA方法檢測(cè)，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組外周血單核細(xì)胞內(nèi)的DCLK1蛋白含量為對(duì)照組的1.74倍(P=0.001)。繪制受試者工作曲線(receiver operating characteristic curve，ROC曲線)描述血漿中DCLK1水平對(duì)于結(jié)直腸癌的診斷價(jià)值，顯示曲線下面積(area under the curve,AUC)為0.766(95%CI：0.680～0.852，P<0.001)。以227 pg/ml為閾值(cut-off value)時(shí)，其對(duì)結(jié)直腸癌的預(yù)測(cè)特異度和敏感度均達(dá)到72.4%，進(jìn)一步分析顯示血漿DCLK1高水平預(yù)示腫瘤分期增加和淋巴結(jié)侵襲(P=0.02，P=0.01)。王敏等[21]涉及78例的研究也同樣證實(shí)了這一點(diǎn)。將血漿中DCLK1表達(dá)水平作為診斷指標(biāo)，其AUC為0.771(95%CI：0.688～0.841，P<0.001)。將閾值定為1.723 ng/ml時(shí)，敏感度和特異度分別為67.95%、97.92%；而同一實(shí)驗(yàn)條件下，以CEA作為診斷指標(biāo)的AUC為0.679(95%CI：0.590～0.759，P=0.0002)。值得一提的是，該研究繼續(xù)證實(shí)了CEA的水平和結(jié)腸癌的病理分期并無明顯相關(guān)性(P>0.05)，而高水平的DCLK1則與較差的病理分期相關(guān)(P=0.003)。而二者聯(lián)合檢測(cè)顯示AUC為0.823(95%CI：0.745～0.886，P<0.0001)，且敏感度和特異度達(dá)到75.64%和95.74%。

3 小結(jié)

DCLK1作為結(jié)直腸腫瘤相關(guān)標(biāo)志物，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用，其在組織中的表達(dá)水平也很大程度上影響著腫瘤的預(yù)后分析。當(dāng)前有部分研究證實(shí)結(jié)直腸腫瘤患者血漿中DCLK1水平升高，且其作為腫瘤血清學(xué)標(biāo)志物的預(yù)測(cè)價(jià)值在小樣本的人群內(nèi)得到驗(yàn)證，但尚需要進(jìn)一步更大樣本的隨機(jī)對(duì)照研究論證其能否得到大規(guī)模的推廣。