續(xù)國強，衛(wèi)佳寧，宋國華

(山西醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物與人類疾病動物模型山西省重點實驗室，太原　030001)

口腔癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤。有關(guān)研究報道，口腔癌中約有90%為鱗狀細胞癌[1]。由于存在預后較差、易轉(zhuǎn)移、復發(fā)率高[2]且口腔鱗狀細胞癌(OSCC)發(fā)生、發(fā)展的具體病理機制尚未充分明確等問題，使得臨床上OSCC的治療效果仍未有明顯改善。因此，建立一種較為完善的動物模型對人類口腔癌的預防、發(fā)生、轉(zhuǎn)移及預后的研究十分重要。目前，許多學者建立了化學誘導、移植腫瘤及基因修飾等口腔癌動物模型，在抗腫瘤藥物的藥代動力學、實驗性治療方法的評價及部分原癌、抑癌基因的作用等方面進行了研究。本文就口腔癌動物模型研究進展進行綜述。

1　自發(fā)性口腔癌動物模型

該模型中動物腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程與人類腫瘤的過程很相似，但由于自發(fā)性動物模型存在飼養(yǎng)量大、周期長、耗資大的缺點，目前還未有關(guān)自發(fā)性口腔癌動物模型的報道。因此，在實際操作過程中我們常用誘發(fā)動物模型來展開相應研究。

目前，我國對北極的研究相對滯后，更多還關(guān)注在自然科學方面，我國1999年才啟動北極考察，比南極考察晚了整整14年，隨著北極發(fā)生重大變化，中國對北極的研究短板凸顯。

2　誘發(fā)性口腔癌動物模型

2.1　化學誘導口腔癌動物模型

2.1.1利用二甲基苯并蒽(9, 10-dimethyl-1, 2-benzanthracene，DMBA)誘導

二甲基苯并蒽為黃色粉末，是一種直接致癌劑，會使黏膜上皮細胞的遺傳物質(zhì)突變，黏膜細胞異常增生進而發(fā)生癌變。使用DMBA誘導建立口腔癌動物模型時，有涂抹法、直接注射法及DMBA局部植入三種方法?；矢Ρ萚3]將0.5% DMBA丙酮溶液以每周3次的頻率用小頭棉簽涂抹于中國地鼠雙側(cè)頰囊，第6周時發(fā)生非典型增生，第9周時有炎癥反應并產(chǎn)生潰瘍，第12周誘發(fā)原位癌，第15周便產(chǎn)生了鱗狀細胞癌和浸潤癌。Vijayalakshmi等[4]將0.5%的DMBA石蠟溶液涂抹于金黃色敘利亞地鼠頰囊，以每周三次的頻率持續(xù)涂抹14周。與對照組相比，涂抹DMBA的地鼠全部成瘤且具有高腫瘤體積，腫瘤負荷以及突變型p53，PCNA和細胞周期蛋白D1的過度表達等特點。全知怎等[5]將DMBA溶液涂抹于地鼠頰黏膜，持續(xù)14周后誘癌組30只地鼠全部產(chǎn)生了鱗狀細胞癌組織。李志革等[6]將DMBA丙酮溶液依次配置成0.1%～0.5% 5個濃度梯度后分別注射入五組金黃色地鼠的頰囊黏膜下，每周2次連續(xù)注射12周，最終0.3%組的誘瘤率最高。曹選平等[7]將DMBA含量為2%、體積為1 mm3的明膠海綿塊植入SD大鼠的頜下腺進行口腔癌誘發(fā)實驗，誘瘤率為42%。

利用DMBA誘導的動物模型腫瘤位置比較淺、重復性好、切取穩(wěn)定且易于觀察，與人類口腔腫瘤的生物學行為和生長特性很相似，也與人類口腔黏膜上皮癌變的病理變化過程很相似。正因如此，諸多學者認為DMBA誘導建立的口腔癌動物模型是目前較為理想的口腔癌實驗動物模型之一。

2.1.2利用4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquino-line-1-oxide, 4NQO)誘導

與DMBA致癌模型相比，4NQO模型的誘癌過程避免了在用藥初期引起的黏膜壞死和炎癥，但局部涂抹4NQO溶液誘癌方式不自然，誘癌過程中會伴隨有涂抹所產(chǎn)生的機械刺激且勞動強度相對較大。

2.2　移植性口腔癌動物模型

建立移植性口腔癌動物模型常用的實驗動物有裸鼠以及新西蘭大白兔等；常用的細胞株系有Tca8113人舌癌細胞系、CAL-27人舌鱗狀癌細胞系、SCC9細胞系和VX2細胞系等。Zhao等[12]將100 μL培養(yǎng)基中的Tca8113細胞(2×106)以1560 r/min常溫消化5 min，采用60只SPF級的BALB/cnu/nu雌性小鼠，皮下注射于小鼠足背，最終所有小鼠全部成瘤。Chen等[13]將200 μL生長培養(yǎng)基中的2×106個CAL-27細胞，皮下注射于6～8周齡時體重約20 g的雌性BALB/c-nude小鼠的背部皮膚中，結(jié)果顯示，所有BALB/c-nude小鼠背部均成功誘瘤。Wu等[14]將熒光標記的SCC9細胞分為CD44+，CD44-和CD44±三組，并將它們分別注入隨機分成三組的NOD/SCID小鼠舌側(cè)緣；20 d后對所有小鼠進行分析并處死，接種CD44+細胞的小鼠在注射部位的成瘤率為100%，而在CD44-組中則為80%。此外，CD44+組中80%的小鼠發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而CD44-組中只有30%的小鼠表現(xiàn)出頸部轉(zhuǎn)移。李方龍等[15]利用中國海洋大學醫(yī)藥學院提供的VX2細胞系和低溫凍存的VX2腫瘤組織塊成功建立VX2荷瘤兔模型；并將該荷瘤兔的腫瘤用改良的穿刺植入法植入實驗兔的舌體左側(cè)建立兔VX2舌癌移植瘤模型。

與體型較小的嚙齒類動物相比，用體型較大的新西蘭大白兔建立口腔癌動物模型有明顯優(yōu)勢，對于研究口腔癌的浸潤及轉(zhuǎn)移機制、影像學表現(xiàn)、發(fā)病機制、生物學特性以及評價實驗性治療方法的療效等方面具有重要價值。與其它細胞株系相比，VX2腫瘤細胞株具有誘導所需時間短、種植成功率高、生物學性質(zhì)穩(wěn)定、轉(zhuǎn)移與侵襲性強、在新西蘭大白兔體內(nèi)成瘤率高等優(yōu)點。因此，目前有許多學者嘗試采用這種細胞來研究口腔癌。

3　基因修飾動物模型

基因修飾動物模型是上世紀90年代新發(fā)展起來的將外源基因?qū)雽嶒瀯游锷臣毎?、胚胎干細胞或早期胚胎后，在受體細胞染色體基因組中穩(wěn)定地整合并表達和傳遞給后代的一類動物模型。轉(zhuǎn)基因技術(shù)可通過在發(fā)育過程中精確激活、沉默等位基因，將基因表達控制在各個發(fā)育階段。盡管長期以來大多數(shù)常見的腫瘤都出現(xiàn)了多種基因修飾動物模型，但發(fā)生于頭頸部的腫瘤基因修飾動物模型卻很罕見，而且是在最近才逐漸興起[16]。全球第一例口腔癌的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒瀯游锬Ｐ汀∈罂谇弧彻馨嶒瀯游锬Ｐ褪怯蒓liver等[17]將啟動子Epstein-Barr virus ED-L2與細胞周期素D1的cDNA 相結(jié)合并使用顯微注射法將外源基因?qū)胧芫训男墼耍S后又利用回交純化基因來建立的。在K14-CreERtam/LSL-K-rasG12D轉(zhuǎn)基因鼠中將基因ras激活、基因p53失活后口腔黏膜上產(chǎn)生了不繼續(xù)惡化癌變的乳頭狀瘤；但當該轉(zhuǎn)基因鼠與基因p53表達缺陷的轉(zhuǎn)基因鼠雜交后，產(chǎn)生的子代轉(zhuǎn)基因鼠被化學藥物他莫昔芬連續(xù)處理14 d后便會產(chǎn)生口腔癌[18]，從而成功建立他莫昔芬誘導的口腔癌變模型。Ocadiz-Delgado等[19]研究表明，牛角蛋白6介導形成的Tg轉(zhuǎn)基因鼠在27周齡左右時位于其舌中部的上皮發(fā)生增生；并預測在此基礎上輔以如化學致癌劑等其他外界致癌因素刺激會建立一種新型的口腔癌實驗動物模型。近期，佘佐亞等[20]采用單獨4NQO誘導和4NQO聯(lián)合檳榔堿共同誘導的方式分別誘導Babl/c和C57BL/6綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生口腔癌，并比較這兩品系小鼠對4NQO的敏感性以及它們在不同時間段時的各項病理變化；這種綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠口腔癌模型成為了活體熒光影像系統(tǒng)的一種重要的動物模型。

目前，新型的CRISPR/Cas9技術(shù)以一段RNA序列為導向來識別靶基因與傳統(tǒng)的編輯技術(shù)相比，該系統(tǒng)定位更加準確、操作更加簡潔、可控性更高，而且得到的突變可遺傳給下一代。2017年P(guān)ing等[21]用張峰教授開發(fā)的在線工具(http://crispr.mit.edu/)選擇合適的靶位點后，利用新型的CRISPR/Cas9技術(shù)在舌鱗狀癌細胞系SCC-9中產(chǎn)生p75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(p75NTR)基因組缺失的突變體，來研究p75NTR基因被敲除后對SCC-9細胞生物學功能的影響，從而為人類口腔癌在基因?qū)用娴闹委熀头烙峁┝艘粋€新的潛在靶標。Ping等雖然只是在細胞水平上利用CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建了口腔癌的細胞模型，但這也提示我們，可以將細胞水平的基因編輯模型和移植模型結(jié)合起來，通過CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建口腔癌細胞，利用手術(shù)將其移植到符合要求的實驗動物體內(nèi)，建立基因編輯的移植性口腔癌動物模型。還可將該技術(shù)應用于合適的實驗動物受精卵中或直接在實驗動物體內(nèi)，利用該技術(shù)進行基因編輯以建立更符合需要的基因修飾口腔癌實驗動物模型。

轉(zhuǎn)基因口腔癌實驗動物模型不但可以在整體組織器官水平上對動物進行研究，而且可以深入研究腫瘤在分子水平和細胞水平上的發(fā)生發(fā)展機制，為口腔癌臨床治療研究、治療藥物篩選以及口腔癌發(fā)病機制研究提供了一個理想的實驗體系。利用轉(zhuǎn)基因法建立的口腔癌動物模型，可以準確地增強或失活某些基因的表達，可在分子水平上研究口腔癌形成過程中的各種病變。但利用轉(zhuǎn)基因法建立實驗動物模型時，被導入的外源基因在宿主基因組中的行為難控制、表達混亂，甚至不表達、轉(zhuǎn)錄效率低、無法遺傳給后代、轉(zhuǎn)基因鼠不能形成多個突變以及成活率不高等缺點。新一代的 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)雖然操作性更強、可控性更高，但在實際應用的過程中也具有“脫靶”等問題亟待我們解決。

4　幾種模型的比較

口腔癌動物模型主要有自發(fā)性口腔癌動物模型、誘發(fā)性口腔癌動物模型、基因修飾口腔癌動物模型。其中自發(fā)性口腔癌動物模型由于其耗資巨大、費時且過程繁瑣，故而現(xiàn)今還未有該模型的相關(guān)報道。

目前，較為成熟且使用較多的是誘發(fā)性口腔癌動物模型?；瘜W誘導口腔癌動物模型具有可嚴格控制各種條件，在較短的時間能復制出大量的口腔癌動物模型，能夠較好地模擬人類口腔癌的發(fā)生過程等優(yōu)點。但同時也具有動物意外死亡率較高，進行局部治療性實驗比較困難，與人類口腔癌的某些特征有較大差異，不適合在進展研究及腫瘤治療等領(lǐng)域應用的缺點。其中DMBA涂抹法誘瘤率接近100%，DMBA直接注射法由于注射濃度的不同其誘瘤結(jié)果也不同，最高為87%，最低為25%。移植性口腔癌動物模型適用于短時間內(nèi)需要得到大量相同腫瘤模型的實驗，這種模型所產(chǎn)生的腫瘤具有個體差異較小、移植部位選擇靈活、生長速率較一致、可觀察到腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移過程、保留人類口腔癌部分病理學、生物學特性以及高接種成活率等優(yōu)點。但該方法也存在每次接種耗時較長、需無菌條件、對實驗動物創(chuàng)傷較大、術(shù)后感染率較高以及無法研究組織由正常狀態(tài)逐漸發(fā)展為癌癥的完整過程等不足。該法的誘瘤率也接近于100%，其中VX2腫瘤細胞株與其它口腔癌細胞株系相比在誘導時間，成功率，穩(wěn)定性等方面有著獨到優(yōu)勢。

基因修飾口腔癌動物模型既可在整體組織器官水平對動物進行研究，又可在分子和細胞水平深入研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制；可較為完整的觀測腫瘤的浸潤、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程，是目前構(gòu)建口腔癌動物模型的發(fā)展趨勢。但在基因敲除的所有細胞中以及在轉(zhuǎn)基因的許多細胞中都存在突變，而在人腫瘤發(fā)展期間，突變僅在由正常細胞包圍的少數(shù)腫瘤細胞中出現(xiàn)，并且早期遺傳改變可能影響胚胎發(fā)育，從而混淆腫瘤的發(fā)生。轉(zhuǎn)基因小鼠和敲除小鼠通常不具有多重突變，也不發(fā)展轉(zhuǎn)移，而這正是人類腫瘤發(fā)生的標志。此外，該模型也存在轉(zhuǎn)錄效率低或外源基因表達效率低、基因?qū)胛恢貌环€(wěn)定、脫靶問題較為嚴重等問題。

5　展望

動物模型不僅是研究疾病的發(fā)生發(fā)展、預防以及治療的重要材料，而且是測試臨床新技術(shù)的重要平臺。目前，化學誘導口腔癌動物模型的研究已步入相對成熟的階段，特別是4NQO模型和DMBA模型已經(jīng)被廣泛應用于癌變以及癌前病變等研究中。近年來因CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)設計簡潔高效、使用方便快捷以及適用范圍廣等優(yōu)勢被快速地應用于各種基因修飾動物模型的建立中[22]。在未來的研究中，將高通量測序技術(shù)與新型的CRISPR基因編輯技術(shù)相結(jié)合，可以更加高效的利用所構(gòu)建的動物模型來深入研究口腔癌的發(fā)病機制、探索新的治療方案，有利于將實驗研究結(jié)果快速轉(zhuǎn)化到臨床應用中，具有廣闊的發(fā)展前景。

參考文獻：