賈 碩，孫 艷，張穎宏，王宏竹，盛春華*

(1.解放軍第208醫(yī)院細(xì)胞治療中心，吉林 長春130062；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院，湖南 長沙410011；3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 腫瘤血液科，吉林 長春130000)

原發(fā)性肝癌是我國常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率位居惡性腫瘤第四位,病死率居第二位,號稱“癌中之王”，具有發(fā)病隱匿、易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及預(yù)后差等特征[1]。研究證實(shí)，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療耐藥和容易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的根本原因在于患者體內(nèi)存在腫瘤干細(xì)胞(Cancer stem cells，CSCs)[2]。腫瘤干細(xì)胞雖然數(shù)量很少，但很難殺滅,常規(guī)放化療只能去除腫瘤組織中大多數(shù)增殖細(xì)胞，不能去除腫瘤干細(xì)胞[3]。在殺滅大部分普通腫瘤細(xì)胞后(手術(shù)、放療、化療后)，再予以腫瘤干細(xì)胞的靶向治療，將可能是腫瘤治療的新方案。肝癌手術(shù)后，殘存在血液、淋巴循環(huán)及組織中的肝癌干細(xì)胞是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源[4]。CD133是目前比較明確的肝癌干細(xì)胞的表面標(biāo)志[5]，本研究篩選CD133+肝癌干細(xì)胞,以肝癌干細(xì)胞為靶點(diǎn)，體外誘導(dǎo)擴(kuò)增DC和CTL細(xì)胞，研究肝癌干細(xì)胞抗原致敏的DC-CTL細(xì)胞對肝癌干細(xì)胞的殺傷作用,為肝癌干細(xì)胞的臨床靶向治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

GTT-551、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、人AB血清(Gibco公司)；細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、IL-1α、IL-4、GM-CSF、TNF-α(美國Peprotech公司)；抗人CD3單克隆抗體、CD8單克隆抗體、小鼠抗人單克隆抗體CD133-PE(美國BD公司)；ClinicMacs流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter公司)，酶標(biāo)儀、全自動磁性細(xì)胞分選儀(德國Miltenyi公司)。

1.2肝癌干細(xì)胞的分選

明確診斷肝細(xì)胞性肝癌患者手術(shù)后取肝癌組織，用生理鹽水加入慶大霉素(100 u/ml)清洗，剪切組織塊，加入胰蛋白酶液置于37℃孵箱中消化，并間斷用攪拌棒攪拌，消化4小時，用200目濾篩過濾，重新制備成單細(xì)胞懸液，加生理鹽水離心800 rpm 10分鐘，2次，應(yīng)用高糖DMEM培養(yǎng)基加8%人AB血清接種于6孔板中，密度2×106/ml。嚴(yán)格應(yīng)用磁珠分選系統(tǒng)說明書進(jìn)行細(xì)胞分選操作。制備肝癌單細(xì)胞懸液，與CD133抗體磁珠進(jìn)行交聯(lián)后過分離柱進(jìn)行分選，收集CD133+細(xì)胞，制備成肝癌干細(xì)胞單細(xì)胞懸液備用。

1.3流式細(xì)胞技術(shù)測定肝癌干細(xì)胞

取分選前的肝癌細(xì)胞懸液和分選后的CD133+細(xì)胞懸液，分別加入2 ml圓底離心管中，離心1 500 rpm，5 min，棄上清液。加入PBS 1 ml離心洗滌1次，棄上清。調(diào)整細(xì)胞濃度，加入Fc受體封閉劑,4℃避光反應(yīng)10 min。離心，棄上清液。用PBS 1 ml洗滌1次，離心。分別加入CD133-PE抗體，將上述2份細(xì)胞放在冰盒里避光孵育30 min，用1 ml含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清PBS洗滌2次，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析測定CD133+細(xì)胞。

1.4肝癌干細(xì)胞和肝癌細(xì)胞抗原的獲得

分別收集肝癌干細(xì)胞和肝癌細(xì)胞，用PBS調(diào)整密度為5×106/ml，細(xì)胞被反復(fù)凍融(-196℃度至37℃)，循環(huán)4次。細(xì)胞裂解物經(jīng)12 000 rpm離心5分鐘，取上清經(jīng)濾器除菌后按Bradford蛋白濃度測定試劑盒說明書所示方法測量、計算抗原的蛋白濃度，分別分裝后-70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5分別培養(yǎng)肝癌干細(xì)胞和肝癌細(xì)胞抗原致敏的DC-CTL細(xì)胞

1.5.1外周血單個核細(xì)胞分別誘導(dǎo)擴(kuò)增DC和CIK細(xì)胞：肝癌患者(與上文獲得肝癌干細(xì)胞為同一患者)手術(shù)1個月后，應(yīng)用血液成分分離機(jī)進(jìn)行單個核細(xì)胞單采，經(jīng)Ficoll淋巴細(xì)胞分離液從單個核細(xì)胞分離淋巴細(xì)胞。用GTT-551培養(yǎng)基洗滌2次，用GTT-551培養(yǎng)基加入6%人AB血清混懸于培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2孵育箱中，2 h后將懸浮細(xì)胞移出進(jìn)行CIK培養(yǎng)，貼壁細(xì)胞進(jìn)行DC培養(yǎng)。

1.5.2肝癌干細(xì)胞和肝癌細(xì)胞抗原致敏的DC細(xì)胞培養(yǎng)：貼壁細(xì)胞加入IL-4(500 U/ml),GM-CSF(1 000 U/ml)培養(yǎng)，每隔2-3天換液1次，第6天分別加入肝癌干細(xì)胞和肝癌細(xì)胞抗原100 μg/ml，第7天加入TNF-α(500 U/ml)誘導(dǎo)DC成熟，第9天分別收獲成熟DC細(xì)胞。

1.5.3CIK細(xì)胞培養(yǎng)：懸浮淋巴細(xì)胞加入重組人IFN-r(1 000 U/ml)和10%AB型人血清的GTT-551培養(yǎng)液，24 h后更換成含100 ng/ml小鼠抗人CD3單克隆抗體、IL-1α(1 000 U/ml)和 IL-2(500 U/ml)的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，2天后換含IL-2(500 U/ml)的完全培養(yǎng)液隔日換液維持培養(yǎng)9天。

1.5.4分選CTL細(xì)胞 參照ClincMacs使用說明，加入CD3、CD8抗體磁珠,應(yīng)用CliniMacs流式細(xì)胞儀從誘導(dǎo)擴(kuò)增的CIK細(xì)胞中分選出CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞。

1.5.5抗原致敏后的DC與CTL細(xì)胞共培養(yǎng)，獲得DC-CTL細(xì)胞：細(xì)胞培養(yǎng)第9天，分別取肝癌干細(xì)胞和肝癌細(xì)胞抗原致敏后的DC細(xì)胞，經(jīng)活細(xì)胞計數(shù)后，按1∶5比例分別與CD3+CD8+T細(xì)胞混合培養(yǎng)，每2天加入IL-2(500 U/ml)半量換液,5天后收集，獲得分別CTL細(xì)胞。細(xì)胞質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞存活率≥95%，不含細(xì)菌、病毒和內(nèi)毒素等微生物。

1.6MTT法檢測不同抗原致敏的DC-CTL對肝癌干細(xì)胞的殺傷作用

取狀態(tài)良好的肝癌干細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度分別為5 ×104/mL，接種于96 孔板，100 μL/孔，置于37℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)過夜至靶細(xì)胞貼壁。分別取肝癌干細(xì)胞抗原致敏的DC-CTL細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)、肝癌細(xì)胞抗原致敏的DC-CTL細(xì)胞(陽性對照組)和無抗原致敏的DC-CTL細(xì)胞(空白對照組)，按照效靶比5∶1、10∶1 和20∶1 的細(xì)胞比例接種于鋪有靶細(xì)胞的96 孔板，100 μL/孔，每組設(shè)10 個平行復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。然后每孔加入MTT( 5 mg /mL) 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心去上清，每孔加入200 μL DMSO，震蕩10 min，用酶標(biāo)儀在檢測波長490 nm 測定吸光度( A) 值，每組取5 個平行復(fù)孔計算平均A值，按公式計算殺傷率。殺傷率= [1-(A實(shí)驗(yàn)組-A效應(yīng)細(xì)胞對照組) /( A靶細(xì)胞對照組-A空白組) ]× 100%。

2 結(jié)果

2.1流式細(xì)胞技術(shù)測定肝癌干細(xì)胞

CD133表達(dá)達(dá)到98.4%，說明分選成功，得到的細(xì)胞基本為具有CD133+標(biāo)志的肝癌干細(xì)胞，結(jié)果見圖1。

注：左圖顯示分選前，CD133表達(dá)率為3.8%；右圖顯示分選后，CD133表達(dá)率為98.4%。

2.2抗原致敏DC細(xì)胞培養(yǎng)

DC細(xì)胞培養(yǎng)至第9天在顯微鏡下觀察，DC細(xì)胞呈圓形，貼壁生長，表面有樹突狀突起。應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)測定DC細(xì)胞表面標(biāo)志，說明為成熟DC,見圖2。

注：成熟DC細(xì)胞表面標(biāo)志HLA-DR+表達(dá)率為85%，CD80+表達(dá)率為72%， CD83+表達(dá)率為45.2%，CD86+表達(dá)率為95.1%。

2.3CIK(cytokine-inducedkillercells)細(xì)胞培養(yǎng)

流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增前CD3+CD8+細(xì)胞含量約為48%，見圖3；細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增9天，CIK細(xì)胞中CD3+CD8+含量約達(dá)90%，見圖4。并且細(xì)胞總數(shù)量隨誘導(dǎo)時間大幅擴(kuò)增，第9天擴(kuò)增100余倍，見表1。

注：輔助性T細(xì)胞(CD3+CD4+,Th)表達(dá)率為39%，殺傷性T細(xì)胞(CD3+CD8+,CTL)表達(dá)率為48%。

注：輔助性T細(xì)胞(CD3+CD4+,Th)表達(dá)率為7%，殺傷性T細(xì)胞(CD3+CD8+,CTL)表達(dá)率為90%,自然殺傷性T細(xì)胞(CD3+CD56+,NKT)表達(dá)率為30%。

圖4 細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增后

2.4MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組(肝癌干細(xì)胞抗原致敏組)與陽性對照組(肝癌細(xì)胞抗原致敏組)及空白對照組(無抗原致敏組)相比，效應(yīng)細(xì)胞對肝癌干細(xì)胞的殺傷作用均具有極顯著性差異；且隨不同效靶比效應(yīng)細(xì)胞的增加，其殺傷作用顯著增強(qiáng)(見表2)。說明肝癌干細(xì)胞抗原致敏的DC-CTL細(xì)胞對肝癌干細(xì)胞具有極強(qiáng)的殺傷作用，且此殺傷作用隨效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量的增加而增強(qiáng)。

表2 抗原致敏的DC-CTL殺傷肝癌干細(xì)胞作用效應(yīng)

3 討論

我國是肝癌高發(fā)區(qū)，肝癌患者生存期短，死亡率高，即使預(yù)后較好的小肝癌，術(shù)后也有超過70%的患者在2年內(nèi)發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而高達(dá)90%以上的肝癌術(shù)后死亡因素與轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)有關(guān)。原發(fā)性肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是患者最終死亡的主要原因，而肝癌干細(xì)胞的殘存和逃脫免疫系統(tǒng)監(jiān)視清除是復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的根源。人體抗腫瘤免疫主要為細(xì)胞免疫，主要是T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫中CD3+CD8+T細(xì)胞即細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)發(fā)揮識別和殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。而DC是人體內(nèi)功能最強(qiáng)大的抗原呈遞細(xì)胞，能有效激活初始T細(xì)胞，誘導(dǎo)出抗原特異性CTL，使機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)?？乖旅艉驞C細(xì)胞的增殖活性和對抗原的識別作用均增強(qiáng)[6]，與CTL共培養(yǎng)后，細(xì)胞間的相互作用能促進(jìn)二者的成熟和增殖，使CTL的抗瘤效應(yīng)增強(qiáng)[7]，增加DC和共刺激分子遞呈抗原的特異性，促進(jìn)DC分泌IL-2[8]。

本研究根據(jù)肝癌干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志CD133分子，從肝癌組織中篩選出肝癌干細(xì)胞，制備抗原。同時從病人外周血中分離單個核細(xì)胞，體外分別誘導(dǎo)、擴(kuò)增人肝癌干細(xì)胞抗原致敏的樹突狀細(xì)胞(DC)和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)，并進(jìn)一步從CIK細(xì)胞中分選出CTL細(xì)胞。CIK細(xì)胞是人體外周血單個核細(xì)胞在體外用多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)而獲得的一種多克隆性T細(xì)胞[9]，增殖能力強(qiáng)，短期培養(yǎng)后即可達(dá)到抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量。CIK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的毒性是非MHC限制的，并且對腫瘤干細(xì)胞也具有細(xì)胞毒性[10]。CIK細(xì)胞中富含大量的毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。本課題組通過臨床應(yīng)用級別的ClinicMacs流式細(xì)胞儀從CIK細(xì)胞中分選出CD3+CD8+的CTL細(xì)胞；將肝癌干細(xì)胞抗原致敏后的DC細(xì)胞與CTL細(xì)胞共培養(yǎng)，產(chǎn)生大量具有抗原特異性殺傷功能的CTL細(xì)胞。肝癌患者由于免疫耐受等原因，腫瘤免疫原性差，不能有效提呈給DC細(xì)胞，導(dǎo)致機(jī)體難以產(chǎn)生針對性的CD3+CD8+T細(xì)胞。本課題組采取體外誘導(dǎo)擴(kuò)增DC和CTL的方式，流式細(xì)胞術(shù)測定結(jié)果顯示細(xì)胞分類和增殖情況均可以滿足實(shí)驗(yàn)和治療需要。

本研究結(jié)果顯示，肝癌干細(xì)胞抗原致敏后的DC-CTL細(xì)胞對肝癌干細(xì)胞具有很強(qiáng)的殺傷作用,且隨效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量的增加殺傷作用亦增強(qiáng)，為進(jìn)一步開展臨床實(shí)驗(yàn)研究提供理論依據(jù)。

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