陶金華 崔健 張帆 陳佳楠 王貴玉 劉正 王錫山

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一［1］。我國結直腸癌的發(fā)病率一直呈明顯的上升趨勢，最新統(tǒng)計資料顯示，我國結直腸癌發(fā)病率居男性第四位、女性第三位，死亡率居男性第五位、女性第四位［2］。結直腸黏膜——腺瘤——癌——侵襲、轉移的惡性轉化過程是結直腸癌發(fā)生發(fā)展的經(jīng)典途徑，如果能夠對這一過程進行早期干預和治療，將有望降低結直腸癌的發(fā)生率及死亡率，改善患者的預后［3］。

目前的研究認為炎癥引起的機體微環(huán)境失衡是導致正常細胞向腫瘤細胞轉化的關鍵因素，炎癥因素包括炎性細胞及炎癥介質，其中肥大細胞是參與炎癥反應的主要細胞［4-7］。近年來肥大細胞與結直腸癌的相互關系也越來越受到學者們的關注，肥大細胞在胃腸道廣泛分布，參與了維持胃腸道內環(huán)境的穩(wěn)定，并影響胃腸黏膜的分泌和吸收［8］。肥大細胞類糜蛋白酶Chymase是肥大細胞產(chǎn)生的特異性中性蛋白酶，基因定位于人4號染色體，全長3 kb，由5個外顯子和4個內含子組成，它能夠增加血管通透性、引起炎性細胞浸潤、刺激炎性介質釋放和促進細胞增殖［9-10］。Chymase作為肥大細胞的重要效應蛋白，對維持腸道炎癥微環(huán)境的穩(wěn)定有著重要的作用［10-12］。

關于肥大細胞Chymase的表達與結腸癌發(fā)生、轉移、預后的相關性目前尚無明確研究證據(jù)，本研究擬通過檢測結直腸癌組織和癌旁組織肥大細胞中Chymase的表達，探討Chymase與結直腸癌發(fā)生、發(fā)展、轉移及預后可能存在的關系，以期能為結直腸癌的診斷、治療及預后評估提供新的理論依據(jù)。

資料與方法

一、一般資料

收集2010年9月至2012年9月于中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院結直腸外科和哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院結直腸腫瘤外科接受結直腸癌根治術的147例結直腸癌患者組織標本及臨床病理資料，選擇保存完好的癌組織石蠟標本，同時收集癌旁正常組織（取自手術切除殘端，距離癌組織5 cm以上，切緣陰性）。研究納入的病例病理組織學診斷均為結直腸腺癌，無合并其他多原發(fā)腫瘤，術前均未進行放射治療、化學治療及其他靶向治療。

147例患者中，135例患者獲得5年隨訪資料，12例患者因聯(lián)系方式變更失效等原因造成失訪，失訪率8.16%。其中，男：61例，女：74例，年齡29～87歲，平均：56.86±10.65歲。參照AJCC（American Joint Committee on Cancer）第 8版分期系統(tǒng)對腫瘤進行分期，其中Ⅰ期：12例，Ⅱ期：63例，Ⅲ期：52例，Ⅳ期：8例。隨訪終點是總生存期（overall survival，OS），總生存時間定義為結直腸癌根治術手術開始時間至死亡時間或最終隨訪時間。

二、主要試劑

Chymase鼠抗人單克隆抗體購自Abcam，DAB顯色試劑盒購自DAKO，抗兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒、檸檬酸抗原修復液購自北京中杉金橋生物技術有限公司，山羊血清封閉液購自北京博奧森生物技術有限公司，PBS緩沖液試劑購自武漢博士德生物技術有限公司。

三、免疫組化結果判定

Chymase表達水平評分：每張切片隨機選擇10個高倍鏡視野，經(jīng)兩位高年資病理科醫(yī)生獨立閱片。聯(lián)合評估染色強度和陽性細胞比例來綜合確定表達情況：（1）按染色強度分為4個分值：0（陰性），1（弱陽性），2（中等陽性），3（強陽性）；（2）按染色范圍分為4個分值：1（＜25 %），2（25～49%），3（50～74%），4（≥75%）；（3）染色強度和范圍評分之和為其最終分值。最終評分0～3分為低表達，4～7分為高表達。

四、研究方法

免疫組化：選取135例患者的癌組織及癌旁組織病理切片進行免疫組化檢查（SP法）。免疫組化具體步驟如下：（1）烤片：將4 um石蠟病理切片放入70 ℃烘片機中烘烤20分鐘；（2）脫蠟和水化：將病理切片置于二甲苯中每次浸泡10分鐘，共浸泡三次，然后分別在無水乙醇、95%乙醇、75%乙醇中各浸泡5分鐘；（3）抗原修復：采用高壓熱修復；（4）加一抗，4 ℃過夜；（5）次晨加二抗，37 ℃恒溫箱中孵育30 min；（6）DAB顯色，在顯微鏡下控制反應時間；（7）蘇木精復染，脫水透明后，中性樹膠封片。

五、統(tǒng)計學分析

應用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，兩組間計數(shù)資料采用卡方檢驗，計量資料采用t檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier方法，組間比較采用log-rank檢驗，多因素生存分析應用Cox風險比例回歸模型，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、Chymase在結直腸癌組織中的表達及與臨床病理資料之間的關系

（一）Chymase在結直腸癌組織中的表達

免疫組化的方法檢測Chymase蛋白的表達。Chymase蛋白表達在肥大細胞中（圖1），其中64例結直腸癌患者Chymase蛋白高表達，71例患者Chymase蛋白低表達。在癌旁組織中，81例Chymase蛋白高表達，54例Chymase蛋白低表達，Chymase蛋白在結直腸癌組織及癌旁組織中的表達差異具有統(tǒng)計學意義（Χ2=4.305，P=0.038），見表1。

（二）Chymase的表達及與臨床病理資料之間的關系

結直腸癌組織中Chymase蛋白的表達與遠處轉移有關，有遠處轉移患者Chymase蛋白表達降低（P=0.002），Chymase蛋白的表達與N分期有關，分期越晚，Chymase蛋白的表達越低（Χ2=54.81，P＜0.001），Chymase蛋白的表達與TNM分期有關，在Ⅲ＋Ⅳ期患者Chymase蛋白表達降低（Χ2=50.84，P＜0.001），具體見表2。

二、Chymase表達與結直腸癌患者預后的關系

影響結直腸癌患者預后的危險因素包括Chymase蛋白的表達（圖2），T分期，N分期，M分期，TNM分期和分化等因素，見表3。將影響結直腸癌生存的因素納入多因素分析，結果顯示結直腸癌分期是影響結直腸癌預后的獨立因素，見表4。

圖1 Chymase蛋白在結直腸癌及癌旁組織中的表達，1A在結直腸癌組織中低表達；1B在癌旁組織中高表達

表1 Chymase蛋白在結直腸癌組織及癌旁組織中的表達

討 論

近年來，結直腸癌與炎癥的關系日益受到關注［13-15］。肥大細胞作為免疫細胞在炎性反應過程中發(fā)揮重要作用。有研究表明：在炎癥條件下肥大細胞可以促進結直腸癌的生長，誘導腫瘤細胞遷移，目前還沒有證據(jù)表明肥大細胞可以直接促使正常腸道黏膜向癌轉化，但肥大細胞可以刺激腺瘤的產(chǎn)生，并縮短結直腸腺瘤癌變的周期［16-17］，但通過何種途徑仍不明確。肥大細胞可能是通過其脫顆粒釋放類胰蛋白酶后促進血管生成從而發(fā)揮促癌作用［18］。但是，有研究也得出了相反的發(fā)現(xiàn)，推測肥大細胞可能通過釋放顆粒胰蛋白酶促凋亡從而起到抑癌作用［19］。因此本研究的目的是進一步探索結直腸癌肥大細胞中Chymase的表達及臨床意義。

表2 Chymase的表達及與臨床病理資料之間的關系

圖2 Chymase蛋白的高低表達對135例結直腸癌患者總生存的影響

Mehdawi等應用免疫組化的方法在結直腸癌組織中檢測肥大細胞的密度及Chymase的表達，研究發(fā)現(xiàn)在結直腸癌旁組織里，肥大細胞的密度及糜蛋白酶陽性的肥大細胞密度要高于癌組織（101±11.5vs.52±7.4），差異具有統(tǒng)計學意義［20］。本研究進一步驗證了上述結果，同樣發(fā)現(xiàn)Chymase在結直腸癌旁組織中的表達要高于在結直腸癌組織中的表達。

本研究顯示結直腸癌組織中Chymase蛋白的表達與遠處轉移有關，有遠處轉移患者Chymase蛋白表達降低，Chymase蛋白的表達與N分期有關，N分期越晚，Chymase蛋白的表達越低，Chymase蛋白的表達與TNM分期有關，在Ⅲ＋Ⅳ期患者Chymase蛋白表達降低，Chymase蛋白的表達隨著腫瘤的進展表達含量降低。也許可以從側面角度說明Chymase蛋白的高表達是保護因素，參與抑制結直腸癌進展的作用。但Chymase蛋白在結腸癌組織中具體抑癌功能及機制仍需要進一步的分子生物學實驗來證實。

關于肥大細胞與腫瘤預后之間的關系仍備受爭議，Nielsen等和Tan等的研究發(fā)現(xiàn)肥大細胞密度增高預示結直腸癌良好的預后［21-22］，然而Acikalin 與Gulubova 的研究顯示，肥大細胞的密度及微血管密度增加卻與結直腸癌患者不良預后有關［19，23］。我們發(fā)現(xiàn)Chymase蛋白高表達的患者預示著更長的生存期，這與既往Mehdawi的研究結果相符合。其研究發(fā)現(xiàn)肥大細胞密度是結直腸癌患者的獨立預后因素，并且在結直腸癌肥大細胞中主要高表達Chymase蛋白［18］。

綜上，本研究進一步探討了Chymase蛋白的表達與結直腸癌患者臨床病理資料之間的關系及其臨床意義，但研究仍有一定不足：1.仍需要大樣本的臨床標本驗證；2.仍需要進行相關研究來探討Chymase蛋白在結直腸癌中的作用機制。仍有待通過后續(xù)研究為結直腸癌患者明確Chymase作為治療靶點及預后指標的價值。

表3 135例結直腸癌患者總生存的危險因素單因素分析

表4 135例結直腸癌患者總生存的危險因素多因素分析

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