摘 要：采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法對(duì)反復(fù)鹵制的醬牛肉老湯進(jìn)行揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的定性與定量分析，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，同時(shí)結(jié)合電子鼻檢測(cè)結(jié)果，對(duì)不同煮制次數(shù)的老湯進(jìn)行風(fēng)味分析與變化規(guī)律研究。結(jié)果表明：煮制1～4 次的醬牛肉老湯中共檢出揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)101 種，檢出共有揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)53 種，其中丁香酚、茴香腦和乙酸丁香酚酯等為主要風(fēng)味物質(zhì)；揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量隨煮制次數(shù)的增加而逐漸降低，因此在老湯使用到一定程度時(shí)應(yīng)補(bǔ)充香辛料以保證醬牛肉的風(fēng)味。通過(guò)聚類分析和對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)損失程度的綜合分析發(fā)現(xiàn)，老湯使用至第3次時(shí)可以開(kāi)始補(bǔ)充丁香、肉豆蔻、花椒和小茴香，其補(bǔ)充量可以為初始添加量的40%～50%；而使用至第4次的老湯，其香辛料補(bǔ)充量則需要提高至初始量的50%～70%。

關(guān)鍵詞：醬牛肉老湯；氣相色譜-質(zhì)譜法；電子鼻；聚類分析

Abstract： The volatile flavor components in repeatedly cooked soup stock for spiced beef were extracted and identified by solid-phase microextraction （SPME） combined with gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. The data obtained were analyzed with cluster analysis. The changes in the flavor components with the number of cooking cycles were detected using an electronic nose. The results showed that a total of 101 volatile compounds were identified in soup stock cooked once， twice， three and four times. Fifty-three volatile flavor compounds were common to four samples， the predominant ones being eugenol， anethole and acetyleugenol. The relative contents of the volatile flavor compounds decreased with increasing number of cooking cycles. Therefore， supplementation of spices to the soup stock is needed to ensure the flavor of spiced beef. Collectively， cluster analysis and the loss of volatile flavor compounds showed that clove， nutmeg， Chinese prickly ash and fennel could be added at 40%–50% and 50%–70% of the initial amounts after second and third repeated use， respectively.

Key words： soup stock for spicy beef； gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）； electronic nose； cluster analysis

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201712008

中圖分類號(hào)：TS251.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2017）12-0041-09

引文格式：

貢慧， 史智佳， 楊震， 等. 反復(fù)煮制醬牛肉老湯揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化趨勢(shì)[J]. 肉類研究， 2017， 31（12）： 41-49. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201712008. http：//www.rlyj.pub

GONG Hui， SHI Zhijia， YANG Zhen， et al. Changes in volatile flavor components in soup stock for spiced beef during repeated use[J]. Meat Research， 2017， 31（12）： 41-49. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201712008. http：//www.rlyj.pub

醬牛肉是我國(guó)的主要傳統(tǒng)肉制品之一，以其獨(dú)特的風(fēng)味和鮮美多汁的口感深受我國(guó)消費(fèi)者的喜愛(ài)[1]。在傳統(tǒng)醬牛肉的加工過(guò)程中一般會(huì)添加一定比例的老湯來(lái)醬鹵牛肉，以增添其風(fēng)味[2]。老湯，顧名思義就是反復(fù)燉煮過(guò)牛肉的湯汁，其中除了添加的香辛料，還有反復(fù)燉煮牛肉過(guò)程中，牛肉在進(jìn)行了脂肪酸氧化、Strecker降解、蛋白質(zhì)降解、Maillard反應(yīng)和硫胺素降解等變化[3-4]之后產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)，這些風(fēng)味物質(zhì)與香辛料的風(fēng)味結(jié)合，經(jīng)過(guò)燉煮形成的老湯風(fēng)味濃郁、醇厚。但是隨著老湯重復(fù)使用次數(shù)的增加，不同種類與來(lái)源的風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生了不同趨勢(shì)的變化，香辛料的風(fēng)味可能逐漸喪失，牛肉煮制過(guò)程中的風(fēng)味物質(zhì)可能會(huì)逐漸積累，但在實(shí)際生產(chǎn)時(shí)經(jīng)常會(huì)遇到老湯煮制幾次后是否還會(huì)對(duì)風(fēng)味有幫助作用、是否應(yīng)該補(bǔ)充香辛料的問(wèn)題。本研究以醬牛肉老湯反復(fù)燉煮過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)的變化為研究?jī)?nèi)容，采用數(shù)理統(tǒng)計(jì)的方法探究上述問(wèn)題。

目前采用固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法對(duì)食品原輔料以及產(chǎn)品進(jìn)行風(fēng)味分析是在一定程度上被大家所認(rèn)同的方法。但是用以上方法進(jìn)行風(fēng)味分析時(shí)面臨著繁雜的數(shù)據(jù)分析和處理工作。聚類分析法是基于統(tǒng)計(jì)學(xué)原理的數(shù)據(jù)分析方法，正在被越來(lái)越多地應(yīng)用在食品領(lǐng)域，聚類分析法可以將復(fù)雜的數(shù)據(jù)通過(guò)其變化規(guī)律與特點(diǎn)進(jìn)行歸類，進(jìn)而達(dá)到將龐雜的數(shù)據(jù)簡(jiǎn)單化的目的，在數(shù)據(jù)量龐大的食品品質(zhì)與風(fēng)味分析中已有所應(yīng)用，比如水果[5-6]、燕麥[7]和白endprint

酒[8-9]等的品質(zhì)評(píng)價(jià)與分級(jí)、少數(shù)肉制品[10]的風(fēng)味與品質(zhì)分析，但是在醬鹵老湯風(fēng)味研究上的應(yīng)用幾乎沒(méi)有報(bào)道。

作為一種基于生物嗅覺(jué)模式建立起來(lái)的檢測(cè)系統(tǒng)，電子鼻具有操作簡(jiǎn)單、快速的特點(diǎn)，正在被越來(lái)越多地應(yīng)用于食品分析領(lǐng)域，比如食品新鮮度鑒別[11-12]、原產(chǎn)地鑒別[13-14]以及品質(zhì)與摻假鑒別[15-16]等。但是電子鼻的數(shù)據(jù)只能提供整體揮發(fā)性物質(zhì)的變化信息，而無(wú)法進(jìn)行定量，與GC-MS的數(shù)據(jù)相結(jié)合可以更全面地分析樣品風(fēng)味，更直觀地反應(yīng)樣品的風(fēng)味特征與變化趨勢(shì)。

本研究首先針對(duì)不同煮制次數(shù)的醬牛肉老湯進(jìn)行了SPME-GC-MS分析，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)聚類分析，然后與電子鼻檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，直觀立體地揭示了不同煮制次數(shù)老湯的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化規(guī)律，為實(shí)際加工生產(chǎn)中老湯的使用次數(shù)與香辛料補(bǔ)充時(shí)機(jī)與比例提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛腱子肉 河北福成五豐食品股份有限公司；醬牛肉加工用輔料（食鹽、白砂糖、醬油、香辛料（花椒、八角茴香、小茴香、砂仁、草果、丁香、肉豆蔻、肉桂）） 市售。

1.2 儀器與設(shè)備

TRACE 1310 GC-TSQ8000 GC-MS儀 美國(guó)賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（carboxen/polydimethylsiloxane，CAR/PDMS）萃取頭 美國(guó)Supelco公司；PEN3電子鼻 德國(guó)Airsense公司；ODP2嗅聞檢測(cè)儀 德國(guó)Gerstel公司。

1.3 方法

1.3.1 不同煮制次數(shù)醬牛肉老湯的制備與取樣

原料肉解凍→修整→切塊（0.5 cm見(jiàn)方）

切塊牛肉→預(yù)煮→煮制→冷卻→老湯1→第1次樣品

切塊牛肉→預(yù)煮→煮制（老湯1）→冷卻→過(guò)濾→老湯2→第2次樣品

切塊牛肉→預(yù)煮→煮制（老湯2）→冷卻→過(guò)濾→老湯3→第3次樣品

切塊牛肉→預(yù)煮→煮制（老湯3）→冷卻→過(guò)濾→老湯4→第4次樣品

操作要點(diǎn)：1）預(yù)煮條件為100 ℃、10 min；2）煮制：預(yù)煮結(jié)束后，按照配方比例加入食鹽、白砂糖、醬油和香辛料（各香辛料均以原料肉質(zhì)量的0.2%加入）等輔料，與肉質(zhì)量2 倍的清水煮沸10 min，降至90 ℃熬煮牛肉4 h后取樣；3）使用老湯鹵制時(shí)需補(bǔ)充適量水，使老湯與水的總質(zhì)量始終為肉質(zhì)量的2 倍，在相同的溫度條件下熬煮牛肉；4）每次取樣量約為50 mL，冷卻后于

-18 ℃冷凍，重復(fù)操作3 次，留樣備用。

1.3.2 樣品的SPME

將留樣后的老湯解凍，恢復(fù)至室溫后，每個(gè)樣品取5 mL置于SPME小瓶中，將小瓶放入50 ℃水浴鍋中平衡30 min，將已老化好的SPME針頭插入樣品瓶中，使石英纖維頭暴露于頂空的氣體中，萃取40 min后，將吸附完成的萃取頭插入GC-MS儀進(jìn)行分離和分析，解吸溫度250 ℃[17]。每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次。

1.3.3 GC-MS條件

GC條件：DB-wax MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃；升溫程序：起始柱溫40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min的速率升至200 ℃，再以10 ℃/min的速率升至230 ℃，保持3 min；檢測(cè)器溫度260 ℃；載氣（He）純度≥99.999%，流速1.0 mL/min。MS條件：電子轟擊（electron ionization，EI）離子源，電子能量70 eV；接口溫度260 ℃；離子源溫度280 ℃；溶劑延遲2.5 min；檢測(cè)器電壓1.2 kV；質(zhì)量掃描范圍為m/z 40～600 [1，4]。

1.3.4 電子鼻檢測(cè)

PEN3型電子鼻傳感器由10 種金屬氧化物半導(dǎo)體型化學(xué)傳感元件組成，每種傳感元件對(duì)應(yīng)的敏感物質(zhì)種類不同，各傳感器的名稱及性能描述如表1所示。準(zhǔn)確量取5 mL老湯，放入20 mL樣品瓶，25 ℃恒溫環(huán)境平衡2 h，運(yùn)用PEN3型電子鼻傳感器對(duì)不同樣品進(jìn)行檢測(cè)。傳感器信號(hào)在70 s后基本穩(wěn)定，本研究選取75 s處分析選定信號(hào)，總采集時(shí)間為90 s。每個(gè)樣品平行測(cè)定7 次[16，18]。

1.3.5 嗅聞檢測(cè)

嗅聞檢測(cè)器接口溫度200 ℃。檢測(cè)時(shí)通入適量濕潤(rùn)氮?dú)庖苑乐乖u(píng)價(jià)員鼻腔干燥，影響對(duì)香氣的判斷。用預(yù)處理后的樣品及標(biāo)準(zhǔn)香氣化合物對(duì)評(píng)價(jià)員反復(fù)培訓(xùn)后再進(jìn)行樣品實(shí)驗(yàn)，由3 位評(píng)價(jià)員記錄聞到香氣的時(shí)間、香味特征和強(qiáng)度，每種風(fēng)味化合物的香氣描述及時(shí)間至少由其中2 名評(píng)價(jià)員一致確定[1，19]。本方法用于揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的鑒定。

1.3.6 揮發(fā)性風(fēng)味化合物的定性與定量方法[1，20]

譜庫(kù)檢索鑒定方法：通過(guò)計(jì)算機(jī)檢索，并與美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）和Willey數(shù)據(jù)庫(kù)提供的譜圖相匹配，選取匹配度和純度大于800（最大值為1 000）的化合物作為匹配物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的定性鑒定。

保留指數(shù)（retention index，RI）鑒定方法：計(jì)算各揮發(fā)性風(fēng)味化合物的RI，并與文獻(xiàn)中的RI進(jìn)行比對(duì)。RI按照下式計(jì)算。

式中：Rtx、Rtn及Rtn+1分別為待測(cè)揮發(fā)性成分、含n 個(gè)碳原子正構(gòu)烷烴及含（n+1） 個(gè)碳原子正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間/min。

采用面積歸一化法進(jìn)行定量分析，計(jì)算各揮發(fā)性成分的相對(duì)含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件對(duì)GC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，研究其組間差異性，再采用系統(tǒng)聚類法，根據(jù)皮爾遜相關(guān)性度量對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析；采用Winmuster軟件對(duì)電子鼻測(cè)定結(jié)果進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）[21]；其他數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行處理。endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 不同煮制次數(shù)老湯揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

不同煮制次數(shù)老湯揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的GC-MS總離子流色譜圖如圖1所示（其中只截取了包含所有揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的前35 min的譜圖）。

由表2可知，煮制1～4 次的老湯樣品中共鑒定出揮發(fā)性風(fēng)味化合物101 種，包括烴類29 種、醛類16 種、酮類8 種、醇類17 種、醚類5 種、酚類6 種、酸類5 種、酯類13 種、雜環(huán)類及其他類化合物2 種。第1、2、3、4次的老湯樣品中分別鑒定出揮發(fā)性風(fēng)味化合物75、80、73、68 種，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量依次降低，說(shuō)明老湯中的風(fēng)味物質(zhì)在反復(fù)煮制過(guò)程中有較大損失。

4 種樣品中共有的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有53 種，包括烴類13 種、醛類8 種、酮類3 種、醇類10 種、醚類5 種、酚類3 種、酸類3 種、酯類7 種、雜環(huán)類及其他類化合物1 種。其中丁香酚、茴香腦、乙酸丁香酚酯、肉桂酸甲酯、肉豆蔻醚、甲基丁香酚、2-羥基-4，6-二甲基苯乙酮、4-萜烯醇、欖香素、糠醛和苯并噻唑?yàn)橹饕膿]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

2.1.1 烴類揮發(fā)性風(fēng)味化合物分析

由表3可知，老湯中檢出的烴類揮發(fā)性化合物種類最多，每個(gè)樣品均有17 種以上檢出，但是烴類化合物的相對(duì)含量并不高，且呈現(xiàn)隨著煮制次數(shù)的增加而略有上升的趨勢(shì)。由表2可知，檢出的烴類揮發(fā)性風(fēng)味化合物多數(shù)為不飽和烯烴，如α-蒎烯、β-月桂烯、β-水芹烯等，它們來(lái)源于醬牛肉加工過(guò)程中添加的天然香辛料，如α-蒎烯來(lái)源于草果[22]，β-月桂烯和β-水芹烯則來(lái)源于

砂仁[23-24]，因此呈現(xiàn)香辛料獨(dú)特的辛香氣味。這些不飽和烴的相對(duì)含量隨煮制次數(shù)的增加略有上升，但均未超過(guò)0.50%，說(shuō)明此類風(fēng)味化合物的揮發(fā)性與被牛肉吸收的量有限，但是水溶性較好，因此在老湯中產(chǎn)生了一定的積累。在檢出的烴類揮發(fā)性風(fēng)味化合物中，相對(duì)含量最高的是欖香素，且隨煮制次數(shù)的增加，欖香素的相對(duì)含量下降，從煮制第1次的1.92%逐漸降至第4次的0.51%。欖香素主要來(lái)源于肉豆蔻[25]，屬于芳香族化合物，從化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)上來(lái)說(shuō)，其較烯烴類易揮發(fā)，因此產(chǎn)生上述變化趨勢(shì)。

2.1.2 醛類揮發(fā)性風(fēng)味化合物分析

由表3可知，老湯中的醛類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類較多，均在9 種以上，相對(duì)含量不高，隨著煮制次數(shù)的增加呈明顯下降趨勢(shì)。對(duì)甲氧基苯甲醛是醛類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中相對(duì)含量最高的，其主要來(lái)自于小茴香[26-27]，相對(duì)含量從煮制第1次的2.41%逐漸降至第4次的0.42%，說(shuō)明其揮發(fā)性較強(qiáng)，且易于被牛肉吸收；糠醛是醬油的特征風(fēng)味物質(zhì)之一[28-30]，其含量也隨老湯煮制次數(shù)的增加而降低，從煮制第1次的0.79%降至第4次的0.12%，這都說(shuō)明當(dāng)老湯煮制至第4次時(shí)醛類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量已經(jīng)較低，老湯很可能已經(jīng)喪失了部分風(fēng)味。壬醛和己醛是牛肉在煮制過(guò)程中發(fā)生脂肪氧化、降解或氨基酸的Strecker降解反應(yīng)產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[31-32]，它們的相對(duì)含量很低，但是閾值較低，有重要的增香作用，這也是老湯比香料水的風(fēng)味更醇香的原因，但是這2 種物質(zhì)的相對(duì)含量在不同煮制次數(shù)的樣品中差別不大，說(shuō)明它們?cè)诶蠝杏幸欢ǔ潭鹊姆e累，這可能與其揮發(fā)性與水溶性有關(guān)。

2.1.3 酮、醇類揮發(fā)性風(fēng)味化合物分析

由表3可知，老湯中的酮類揮發(fā)性風(fēng)味化合物種類不多，含量不高，在各樣品中的相對(duì)含量呈下降趨勢(shì)。2-羥基-4，6-二甲基苯乙酮又稱花椒油素，是含量最高的酮類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其主要來(lái)源于花椒[33-34]。由表2可知，2-羥基-4，6-二甲基苯乙酮的相對(duì)含量隨著煮制次數(shù)的增加而逐漸降低，從煮制第1次的3.09%降至第4次的0.72%；其他酮類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化趨勢(shì)相似。

由表3可知，老湯中的醇類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類也較多，均在12 種以上，但相對(duì)含量不高，且呈現(xiàn)波動(dòng)性變化趨勢(shì)。由表2可知，4-萜烯醇是相對(duì)含量最高的醇類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其主要來(lái)源于肉豆蔻[25]，相對(duì)含量隨著煮制次數(shù)的增加而逐漸降低，從煮制第1次的2.78%降至第4次的1.17%，與同樣來(lái)源于肉豆蔻的欖香素的變化趨勢(shì)一致[25]。由此可知，酮、醇類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的揮發(fā)性較強(qiáng)，隨著煮制次數(shù)的增加相對(duì)含量大幅度降低。

2.1.4 醚、酚類揮發(fā)性風(fēng)味化合物分析

由表3可知，醚、酚類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)是老湯中相對(duì)含量最高的2 類物質(zhì)，但種類并不多，均在5 種左右，其相對(duì)含量卻占所有揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量的一半以上，說(shuō)明這2 類物質(zhì)對(duì)老湯的風(fēng)味起主要作用。由表2可知，茴香腦是相對(duì)含量最高的醚類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其主要來(lái)源于八角茴香[35-36]，相對(duì)含量隨著煮制次數(shù)的增加而略有上升，從煮制第1次的12.52%上升至第4次的16.12%，說(shuō)明它與烯烴類風(fēng)味物質(zhì)相似，揮發(fā)性較差，容易在老湯中積累。另一種含量較高的醚類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)是肉豆蔻醚，它的相對(duì)含量從煮制第1次的4.98%逐漸降至第4次的0.86%，這與同樣來(lái)源于肉豆蔻[25]的欖香素和4-萜烯醇的變化趨勢(shì)一致。

由表3可知，老湯中酚類揮發(fā)性化合物的相對(duì)含量最高，其中最高的是丁香酚，其主要來(lái)源于丁香[37-38]，呈現(xiàn)丁香獨(dú)特的香氣。由表2可知，隨著煮制次數(shù)的增加，丁香酚的相對(duì)含量呈逐漸降低趨勢(shì)，從36.02%下降至第4次的10.26%，說(shuō)明丁香酚是老湯中最主要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)之一，其揮發(fā)性很強(qiáng)，在煮制到第3次時(shí)的相對(duì)含量已下降近一半，說(shuō)明此時(shí)的老湯風(fēng)味物質(zhì)已經(jīng)有了很大程度的損失。

2.1.5 酯類揮發(fā)性風(fēng)味化合物分析

由表3可知，老湯中酯類揮發(fā)性風(fēng)味化合物的種類平均在10 種左右，相對(duì)含量呈波動(dòng)性變化趨勢(shì)。由表2可知，在檢出的酯類揮發(fā)性風(fēng)味化合物中，相對(duì)含量最高的是肉桂酸甲酯，且其相對(duì)含量在不同樣品中變化不大，肉桂酸甲酯來(lái)源于肉桂[39-40]，具有香酯樣的芳香氣味；另一種含量較高的酯類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)是乙酸丁香酚酯，其相對(duì)含量從煮制第1次的7.29%降至第4次的1.24%，變化趨勢(shì)與丁香酚一致，且乙酸丁香酚酯同樣來(lái)源于丁香[37-38]。endprint

從醚、酚、酯類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化趨勢(shì)可以看出，來(lái)源于同一種香辛料的不同種類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化趨勢(shì)趨于一致。此種變化也可以作為依據(jù)，在老湯煮制到一定次數(shù)后適當(dāng)補(bǔ)充香辛料，并且確定所需補(bǔ)充香辛料的種類和比例，以保證醬牛肉產(chǎn)品的風(fēng)味。

2.1.6 酸類、雜環(huán)類與其他揮發(fā)性風(fēng)味化合物分析

由表3可知，老湯中的酸類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類較少，含量也較低，其大部分來(lái)自于牛肉中脂肪酸的微量溶解[1，4]，因此含量變化也不明顯。雜環(huán)類化合物的種類最少，含量最低，但是其閾值較低，對(duì)肉制品風(fēng)味的影響顯著，如苯并噻唑主要來(lái)源于牛肉煮制過(guò)程中的蛋白質(zhì)分解反應(yīng)[31-32]，由表2可知，其相對(duì)含量呈現(xiàn)隨煮制次數(shù)的增加而逐漸升高的趨勢(shì)，從煮制第1次的0.37%上升至第4次的0.51%，與壬醛等來(lái)源于牛肉的風(fēng)味物質(zhì)變化趨勢(shì)一致，這也是隨著煮制次數(shù)的增加老湯越發(fā)醇香的原因。

2.2 不同煮制次數(shù)老湯揮發(fā)性風(fēng)味成分的聚類分析

聚類分析是一種建立分類的多元統(tǒng)計(jì)分析方法，能夠?qū)⒁慌鷺颖靖鶕?jù)其諸多特征，按照性質(zhì)上的親疏關(guān)系在沒(méi)有先驗(yàn)知識(shí)的情況下進(jìn)行分類，所得結(jié)果在一定程度上取決于聚類距離[5-9]。將不同煮制次數(shù)的老湯樣品中共同檢出的53 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行聚類分析，根據(jù)皮爾遜相關(guān)性度量，系統(tǒng)聚類可較客觀地根據(jù)差異性與相似性特點(diǎn)對(duì)樣品進(jìn)行分類，系統(tǒng)聚類樹(shù)狀圖如圖2所示。

由表4可知，按照各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量的變化趨勢(shì)與聚類分析結(jié)果可以將53 種共檢出物質(zhì)分為2 類。第1類物質(zhì)的相對(duì)含量總和隨煮制次數(shù)的增加而增加，但是增加幅度不大，其中茴香腦和肉桂酸甲酯的相對(duì)含量最高，其次是苯并噻唑，再次是烯烴類和一部分醛類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，它們主要來(lái)源于八角茴香、肉桂、砂仁、草果以及牛肉煮制過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)的溶出。第2類物質(zhì)的相對(duì)含量隨著煮制次數(shù)的增加而大幅度降低，其中丁香酚、乙酸丁香酚酯、肉豆蔻醚、甲基丁香酚、2-羥基-4，6-二甲基苯乙酮、4-萜烯醇與4-甲氧基苯甲醛的相對(duì)含量較高，它們主要來(lái)源于丁香、肉豆蔻、花椒和小茴香。以此為依據(jù)可以將香辛料分為不易揮發(fā)、易積累與易揮發(fā)、易流失的2 類，為使用老湯煮制醬牛肉是否補(bǔ)充香辛料提供理論依據(jù)。在老湯使用過(guò)程中，無(wú)需或需少量補(bǔ)充的香辛料為八角茴香、肉桂、砂仁和草果；需要補(bǔ)充的香辛料為丁香、肉豆蔻、花椒和小茴香，根據(jù)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的損失程度，可以在老湯使用至第3次時(shí)補(bǔ)充，補(bǔ)充量可以為初始添加量的40%～50%，而使用至第4次的老湯，其香辛料補(bǔ)充量則需提高至初始量的50%～70%。

2.3 不同煮制次數(shù)老湯揮發(fā)性風(fēng)味成分的電子鼻測(cè)定

由圖3可知，PCA中，主成分1和主成分2的貢獻(xiàn)率分別為90.84%和5.61%，二者的總貢獻(xiàn)率為96.45%；LDA中，主成分1和主成分2的貢獻(xiàn)率分別為82.02%和14.08%，總貢獻(xiàn)率為96.10%。2 種方法的總貢獻(xiàn)率均高于95.00%，說(shuō)明4 個(gè)樣品的特征風(fēng)味可以用電子鼻完全區(qū)分，且區(qū)分結(jié)果是有意義的。

從PCA結(jié)果可以看出，煮制第1、2、3次的樣品與煮制第4次的樣品在主成分1方向上的距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明區(qū)分程度較大；LDA中，煮制第3次的樣品與其他3 個(gè)樣品在主成分1方向上的距離較遠(yuǎn)，煮制第4次的樣品與煮制前3次的樣品在主成分2方向上的距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明煮制第4次的樣品與其他樣品的差別較大，而差別從煮制第3次時(shí)已開(kāi)始顯現(xiàn)。

綜合分析電子鼻與GC-MS的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，隨著老湯煮制次數(shù)的增加，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)逐漸散失，此變化從煮制第3次開(kāi)始顯現(xiàn)，如果繼續(xù)使用老湯則無(wú)法為醬牛肉提供風(fēng)味；但是隨著煮制次數(shù)的增加，從牛肉中溶出的風(fēng)味物質(zhì)有所積累，這對(duì)醬牛肉的風(fēng)味形成又具有積極意義，因此此時(shí)的老湯并不應(yīng)丟棄而損失這部分獨(dú)特風(fēng)味。應(yīng)在老湯中適當(dāng)補(bǔ)充香辛料以保證醬牛肉的風(fēng)味，但是通過(guò)上述分析可以發(fā)現(xiàn)，有些香辛料在老湯中不易揮發(fā)、易積累，無(wú)需補(bǔ)充或僅需少量補(bǔ)充，否則可能起到反作用；而有些香辛料則散失嚴(yán)重，需要補(bǔ)充以保證風(fēng)味穩(wěn)定。

3 結(jié) 論

本研究對(duì)不同煮制次數(shù)醬牛肉老湯的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行SPME-GC-MS與電子鼻檢測(cè)，并進(jìn)行了聚類分析。結(jié)果表明，煮制1～4 次的老湯中共檢出揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)101 種，其中烴類29 種、醛類16 種、酮類8 種、醇類17 種、醚類5 種、酚類6 種、酸類5 種、酯類13 種、雜環(huán)類及其他類化合物2 種；檢出共有揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)53 種，其中丁香酚、茴香腦和乙酸丁香酚酯等為主要風(fēng)味物質(zhì)；揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量隨煮制次數(shù)的增加而逐漸降低，此變化在煮制第3次時(shí)開(kāi)始顯現(xiàn)；到煮制第4次時(shí)，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量已降至初始含量的50%，但是積累了一定的牛肉溶出性風(fēng)味物質(zhì)，不能隨意丟棄而喪失這部分醇香風(fēng)味，應(yīng)在老湯中適當(dāng)補(bǔ)充香辛料以保證醬牛肉風(fēng)味的穩(wěn)定。通過(guò)聚類分析和對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)損失程度的綜合分析發(fā)現(xiàn)，老湯使用至第3次時(shí)可以開(kāi)始補(bǔ)充丁香、肉豆蔻、花椒和小茴香，其補(bǔ)充量可以為初始添加量的40%～50%；而使用至第4次的老湯，其香辛料補(bǔ)充量則需要提高至初始量的50%～70%。使用老湯加工醬牛肉可以使產(chǎn)品風(fēng)味更全面，增添牛肉的醇香口感，但是應(yīng)注意老湯使用的次數(shù)和香辛料補(bǔ)充的時(shí)機(jī)和比例。本研究的結(jié)論從風(fēng)味的角度為使用老湯進(jìn)行醬牛肉加工提供了理論依據(jù)。

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