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(1.湖南省林產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測中心,湖南長沙 410007; 2.湖南省電子科技職業(yè)學院,湖南長沙 430100)

脂肪酸具有重要的營養(yǎng)價值及獨特的功能作用,是油脂化工的基礎(chǔ)原料。以天然脂肪酸為原料衍生的下游產(chǎn)品,廣泛用于紡織、食品、醫(yī)藥、日用化工、石油化工、橡塑、采礦、交通運輸、鑄造、金屬加工、油墨、涂料等各種行業(yè)。亞油酸、亞麻酸、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等在人體器官的成熟發(fā)育及疾病的治療等方面有著至關(guān)重要的作用,食品中脂肪酸的檢測已成為食品檢測領(lǐng)域的重點工作[1-4]。

現(xiàn)階段對于脂肪酸成分的分析檢測手段有滴定分析法、毛細管氣相色譜法、傅立葉變換紅外光譜法、氣相色譜法以及氣相質(zhì)譜-質(zhì)譜連用[5]。Tyburczy等[6]采用傅立葉變換紅外光譜(ATR-DTIR)和氣相色譜-氫火焰離子化檢測器(GC-FID),對25種食用油脂肪酸樣品進行對比分析,發(fā)現(xiàn)兩種方法得出的結(jié)果差異顯著,氣相色譜法更適合反式脂肪酸中某些組分的檢測。湯富杉等[7]采用GC-FID法測定,研究比較油茶籽油和橄欖油中脂肪酸組成,脂肪酸甲酯都能得到很好的分離,取得分析效果較理想。韓深等[8]測定橄欖油中六種脂肪酸,用配有氫火焰離子化檢測器(FID),結(jié)果表明該方法快速、靈敏且回收率好。[9-10]對于脂肪酸甲酯(FAME),分子量和沸點幾乎是相同的,唯一的差別是由分子上的氫異構(gòu)位置導致的偶極相互作用不同。只有在固定相中存在強偶極相互作用,才能對這些類型的化合物進行色譜分離[9-11]。高宏等[12]比較食品中反式脂肪酸在100 m和30 m毛細管石英柱的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)100 m長色譜柱耗時稍長,存在出峰順序顛倒現(xiàn)象;30 m長色譜柱耗時短,部分反式脂肪酸不能完全分離但并不影響結(jié)果?；魴?quán)恭等[13]采用SPB-1701中等極性毛細管柱對白酒中甲醇、雜醇油、酯類進行分離,檢測結(jié)果表明SPB-1701色譜柱耐高溫、耐氧化性、分離效能高,比極性毛細管柱更實用。劉有添等[14]在烏賊膏脂肪酸組成的檢測工作中對色譜柱進行考察,選用非極性HP-5柱、極性HP-INNOWax柱和強極性HP-88柱對40種脂肪酸甲酯混標進行分離。發(fā)現(xiàn)只有在HP-88柱大部分出峰均達到基本分離。王海軍等[15]驗證強極性色譜柱Sp-2560與弱極性色譜柱Rtx-5檢測效果比較中,強極性色譜柱對于脂肪酸有較好的分離效果。

強極性色譜柱Wondacap-wax常用于芳香烴,醇類,醛類、乙二醇、苯乙烯、對二甲苯。Rt?-2560是FAMEWAX,與其他色譜柱相比,FAMEs在FAMEWAX柱上的出峰順序是一致的,但基線穩(wěn)定所需的時間明顯減少,食品、風味物質(zhì)、芳香物質(zhì)之多不飽和脂肪酸甲酯分析;中等極性色譜柱Rt?-1701對殺蟲劑、除莠基及藥物的分析具有選擇性,利用中等極性色譜柱對脂肪酸甲酯進行分離的文獻報道較少。

本文選用強極性色譜柱Wondacap-wax、Rt?-2560及中等極性色譜柱Rt?-1701對37種脂肪酸甲酯混合標準品進行分析檢測,通過比較極性色譜柱長度30 m(Wondacap-wax)和100 m(Rt?-2560)對脂肪酸甲酯的分離能力的影響,強極性固定相與中等極性固定相保留脂肪酸甲酯化合物的能力,篩選已經(jīng)過優(yōu)化的色譜條件得出對應色譜柱的最佳分離效果,并分別采用不同色譜柱的最優(yōu)條件對同一茶籽油樣品檢測,為快速而準確檢測食用油脂肪酸成分提供研究參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

37種脂肪酸甲酯混標(Supelco) 美國Sigma公司;壓榨茶籽油 長沙馬王堆市場;異辛烷 色譜純,天津致遠;氫氧化鈉、甲醇、硫酸氫鈉等均為分析純。

GC-2010plus氣相色譜儀 日本島津公司;Wondacap-wax色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm) 日本島津公司;Rt?-1701色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm) 美國Restek公司;Rt?-2560色譜柱(100 m×0.25 mm×0.20 μm) 美國Restek公司;AL204電子天平 上海梅特勒。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理方法 參照GB 5009.257-2016對食用油樣品進行預處理,待測樣品采用酯交換法處理,稱取試樣60.00 mg至10 mL具塞試管中,加入異辛烷溶液(色譜純)4 mL,然后再加入200 μL氫氧化鈉甲醇溶液(2 mol/L)。蓋上玻璃塞后猛烈搖晃30 s,使氫氧化鈉溶液充分酯交換甲酯化。靜置至澄清后,加入約1 g硫酸氫鈉中和氫氧化鈉,再次猛烈搖晃后靜置,取上清液進行氣相色譜分析。

1.2.2 氣相色譜分析條件 不同的色譜柱柱流失溫度有差異,并且所測的標準品組分復雜,色譜柱的選擇及分析條件很關(guān)鍵。本實驗選用極性Wondacap-wax柱、極性Rt?-2560柱、中等極性Rt?-1701柱,對37種脂肪酸甲酯混標樣品進行分離。默認實驗條件:FID檢測器、載氣為氮氣,進樣量1 μL,柱流量1 mL/min,氫氣流量30 mL/min,空氣流量300 mL/min,分流比30∶1[16-18]。

1.2.2.1 極性Wondacap-wax柱 方法a:進樣口溫度250 ℃;檢測器溫度250 ℃;程序升溫:140 ℃(5 min)以4 ℃/min上升至230 ℃(10 min);分流比50∶1。

方法b:進樣口溫度250 ℃;檢測器溫度250 ℃;程序升溫:130 ℃(5 min)以5 ℃/min上升至220 ℃(10 min)。

方法c:進樣口溫度240 ℃;檢測器溫度240 ℃;程序升溫:135 ℃(3 min)以2 ℃/min上升至220 ℃(20 min)。

1.2.2.2 極性Rt?-2560柱 方法a:進樣口溫度250 ℃;檢測器溫度250 ℃;柱流量1.3 mL/min;程序升溫:140 ℃(5 min)以1.8 ℃/min上升至220 ℃(10 min)。

方法b:進樣口溫度270 ℃;檢測器溫度280 ℃;程序升溫:100 ℃(13 min)以10 ℃/min上升至180 ℃(6 min),以1 ℃/min上升至200 ℃(20 min),以4 ℃/min上升至230 ℃(10.5 min);分流比100∶1。

方法c:進樣口溫度250 ℃;檢測器溫度260 ℃;程序升溫:140 ℃(5 min)以5 ℃/min上升至240 ℃(30 min)。

1.2.2.3 中等極性Rt?-1701柱 方法a:進樣口溫度250 ℃;檢測器溫度260 ℃;柱流量0.7 mL/min;程序升溫:60 ℃(2 min)以10 ℃/min上升至180 ℃(1 min),以10 ℃/min上升至180 ℃(1 min);以2 ℃/min上升至220 ℃(20 min),以2 ℃/min上升至260 ℃(20 min)。

方法b:進樣口溫度220 ℃;檢測器溫度250 ℃;柱流量2.0 mL/min;程序升溫:70 ℃(5 min)以10 ℃/min上升至230 ℃(5 min);氫氣流量40 mL/min,空氣流量450 mL/min,尾吹流量45 mL/min。

方法c:進樣口溫度250 ℃;檢測器溫度250 ℃;程序升溫:140 ℃(5 min)以5 ℃/min上升至240 ℃(5 min)。

2 結(jié)果與分析

FAME的出峰順序為按照碳數(shù)由低到高順序出峰,同一碳數(shù)的FAME,不飽和的先出峰,不飽和度越高,出峰越早。高柱溫能夠縮短保留時間,使樣品中的組分完全流出,但是不利于分離。柱溫低則有利于樣品的分離,但對峰形有影響。實驗的結(jié)果不僅要考慮是否得到較好的分離,還要考慮檢測時長、分離度等因素。

表1 部分色譜峰分離效果對比Table 1 Comparison of chromatographic peak separation effect

注：“-”:表示未分開,表2同。

2.1 極性Wondacap-wax柱最佳分離結(jié)果

方法a和方法b最后的出峰數(shù)量均少于37種,出現(xiàn)重疊峰現(xiàn)象。未能達到理想的分離效果,而方法c各組分已經(jīng)達到了分離要求,靈敏度較高。如圖1所示。

圖1 色譜柱Wondacap-wax在最佳條件下對脂肪酸甲酯混合標準品的分離Fig.1 Separation results of mixed standard fatty acid methyl ester under the optimal condition with chromatographic column Wondacap-wax

2.2 極性Rt?-2560柱最佳分離結(jié)果

方法b和方法c耗時短但未能達到理想的分離效果,而方法a得到脂肪酸甲酯標品分離效果沒有產(chǎn)生拖尾。如圖2所示。

圖2 色譜柱Rt?-2560在最佳條件下對脂肪酸甲酯混合標準品的分離Fig.2 Separation results of mixed standard fatty acid methyl ester under the optimal condition with chromatographic column Rt?-2560

2.3 中等極性Rt?-1701柱最佳分離結(jié)果

方法a和方法b未能達到理想的分離效果,而方法c,脂肪酸部分分離結(jié)果得到改善但峰型較差,如圖3所示。

圖3 色譜柱Rt?-1701在最佳條件下對脂肪酸甲酯混合標準品的分離Fig.3 Separation results of mixed standard fatty acid methyl ester under the optimal condition with chromatographic column Rt?-1701

2.4 三種色譜柱的分離效果分析

色譜中評價色譜柱總分離效能的指標是分離度,又稱為分辨率,即為相鄰兩色譜峰保留時間之差與兩色譜峰峰寬均值之比,用R(Resolution)表示,常用作色譜柱分離效能指標。當R<1時,兩峰有部分重疊,當1.0≤R<1.5時,分離度達到98%,色譜峰基本分離;當R≥1.5時,分離度可達99.7%,色譜峰完全分離。

通過比較色譜柱對脂肪酸標準品的分離效果,由三種色譜柱最佳分離色譜峰結(jié)果(見表1)可知,極性Wondacap-wax柱基本都能分離出來,但是耗時最長,不同成分之間分離度差距很明顯;極性Rt?-2560柱基本都能分離出來,耗時較短,分離度比較均衡;中等極性Rt?-1701到了30 min后出峰重疊或分叉現(xiàn)象頻繁,10號實現(xiàn)基本分離,23號、30號未分開。因此,強極性色譜柱更適合應用于油脂中脂肪酸分離檢測,中等極性色譜柱雖然分離效果不佳,但是對于單個脂肪酸成分的檢測中,分離度有所改善[19-20]。

2.5 最佳條件對同一種樣品檢測結(jié)果比較

表2 不同色譜柱對食用油樣品檢測結(jié)果Table 2 Results of edible oil samples by different chromatographic column

在實驗最佳分離條件下不同色譜柱對同一茶籽油樣品檢測,結(jié)果見表2,各色譜柱的分離度都大于1,強極性色譜柱Rt?-2560檢測的峰面積是三者中最大的,而強極性色譜柱Wondacap-wax檢測用時最短,在25 min內(nèi)完成分析。中等極性色譜柱Rt?-1701峰面積最小,出峰時間普遍較長。3號和4號未完全分離,可能是因為柱填充或分流比等因素的影響。由于油脂當中脂肪酸成分復雜,脂肪酸成分的碳數(shù)、不飽和度、順反構(gòu)象以及雙鍵的位置都會對出峰時間和峰形有影響。5號的出現(xiàn)可能是因為分離不完全產(chǎn)生的偏離,亦或是檢測器噪音干擾。

圖4 不同色譜柱的色譜圖Fig.4 GC chromatogram map from different chromatographic column

3 結(jié)論

本研究采用3種色譜柱實驗分離37種脂肪酸甲酯成分,并通過對同一食用油樣品檢測,進行結(jié)果比對分析。

結(jié)果表明,通過改變柱溫、升溫程序以及升溫速度等條件,是可以改善混合標準品分離度。色譜柱長度越長柱效越高,分離度越好。Rt?-2560色譜柱的分離效果最好,其次是Wondacap-wax色譜柱,中等極性色譜柱Rt?-1701可能更適合分離部分功能性脂肪酸成分,不適合用于脂肪酸37種標準品的分離。

GC條件均參考相關(guān)分離檢測研究文獻,因色譜柱條件、儀器等因素影響難以避免的存在誤差,但不影響檢測結(jié)果,Rt?-2560柱的分離效果還有改善的空間。分析比較脂肪酸組成,對食用油的營養(yǎng)評估、品質(zhì)分級、鑒別以及風險預估具有重要意義,有利于更好地開發(fā)和推廣我國特色食用油資源。

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