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(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,林業(yè)食品加工與安全北京市重點實驗室,北京 100083)

山杏(Armeniacasibirica(L.)Lam)屬于薔薇科(Rosaceae)杏屬(Armeniaca)植物,又稱西伯利亞杏,是我國重要的野生植物資源[1]。山杏仁油脂含量高(約50%)[2],而榨油后剩余的餅粕中蛋白質(zhì)含量高達(dá)45.3%[3],且以易消化的低分子清蛋白為主,占總量的80%以上,而較難消化的大分子球蛋白不到10%[4]。研究發(fā)現(xiàn)山杏仁蛋白含有17種氨基酸,其中8種為人體所必需的氨基酸,約占總量的28%,且纈氨酸(6.65)和異亮氨酸(7.79)含量顯著高于聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)的推薦值(5.0和6.0)[5],因此,山杏仁蛋白是一種食用價值極高的植物蛋白。

凝膠性是植物蛋白重要的功能特性之一,采用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(TG酶)作為交聯(lián)劑促進(jìn)蛋白質(zhì)凝膠的形成已成為蛋白質(zhì)酶法改性的重要手段。它以肽鏈中谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基作為酰基供體,通過催化其與?；荏w間的?；D(zhuǎn)移反應(yīng)促使交聯(lián)現(xiàn)象的發(fā)生[6]。目前,針對山杏仁蛋白的研究主要集中在提取工藝及乳化性、起泡性、溶解性,而對凝膠特性研究還未有報道。顧欣[7]等用響應(yīng)面法優(yōu)化了山杏仁蛋白的提取工藝,蛋白的提取率達(dá)到92.35%;薛蕾[8]等研究了pH、NaCl濃度、溫度對苦杏仁蛋白溶解性、乳化性及起泡性的影響,發(fā)現(xiàn)在等電點附近各項性質(zhì)均最差,NaCl濃度在0～0.8 mol/L以及適宜的溫度(35～55 ℃)均有利于提高各項性質(zhì)。本文在前期研究的基礎(chǔ)上,利用堿溶酸沉法提取山杏仁蛋白,采用TG酶作為交聯(lián)劑,分析工藝參數(shù)對其凝膠特性的影響,通過響應(yīng)面優(yōu)化得到最佳交聯(lián)條件,為山杏仁餅粕的深加工與利用提供理論依據(jù)及技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

脫脂山杏仁粉 河北承德亞歐果仁有限公司,用石油醚脫脂,過80目篩;谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(200 U/g,TG) 江蘇省泰興市一鳴生物制品有限公司;其余所用試劑 均為國產(chǎn)分析純。

1.2實驗方法

1.2.1 山杏仁蛋白的提取 脫脂山杏仁粉按1∶10加入去離子水,超聲破碎10 min,1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至9,45 ℃磁力攪拌提取1 h,4000 r/min離心15 min,上清液用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)溶液pH至4.1,4000 r/min離心15 min,沉淀用去離子水復(fù)溶,pH調(diào)節(jié)至中性,冷凍干燥得到山杏仁分離蛋白(蛋白質(zhì)含量可達(dá)84.52%),-18 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 山杏仁蛋白凝膠的制備 配制16%(w/v)的山杏仁蛋白溶液,調(diào)節(jié)溶液pH至7,按一定的量加入TG酶,分別在一定的溫度下反應(yīng)一定的時間,然后90 ℃滅酶15 min,將樣品置于冰水浴中迅速冷卻至室溫,置于4 ℃冰箱中保存12 h,然后測定其凝膠硬度、彈性和內(nèi)聚力。

1.2.3 凝膠特性的測定 參照何軒輝[9]的方法,略微修改。采用Perten TVT 6700質(zhì)構(gòu)儀,選擇直徑為20 mm的TVT 673020型圓柱探頭、TVT 675088型平板基臺。設(shè)置參數(shù):測前速度為2.0 mm/s;測試速度為0.8 mm/s;測后速度為0.8 mm/s;壓縮比50%;數(shù)據(jù)采集速率為200 pps。一次測定過程中探頭下壓兩次,凝膠硬度為第一次壓縮過程中的峰值,彈性為第二次開始壓縮到壓縮結(jié)束的總時間與第一次開始壓縮到壓縮結(jié)束的總時間的比值,內(nèi)聚力為第二次壓縮峰下面積與第一次壓縮峰下面積的比值。每個樣品重復(fù)測定5次。

1.2.4 單因素實驗設(shè)計

1.2.4.1 加酶量對蛋白凝膠特性的影響 固定pH為7,交聯(lián)溫度40 ℃,交聯(lián)時間1 h,考察不同的加酶量(0、4、8、12、16、20、24、28 U/g)對蛋白凝膠硬度、彈性和內(nèi)聚力的影響。

蘭州石化始終堅持“環(huán)保優(yōu)先、安全第一、質(zhì)量至上、以人為本”的理念，強(qiáng)化HSE體系建設(shè)，常年堅持開展公司、分廠和車間三級崗位責(zé)任制大檢查，建立了四級風(fēng)險“管控網(wǎng)”，形成了專業(yè)監(jiān)督、專職檢查、干部走動式巡檢、值班檢查“四位一體”的監(jiān)督檢查體系，做到了現(xiàn)場作業(yè)風(fēng)險識別管控全過程、全覆蓋。蘭州石化嚴(yán)格執(zhí)行環(huán)保新標(biāo)準(zhǔn)，推進(jìn)清潔生產(chǎn)、綠色發(fā)展。5年來，公司重點環(huán)保項目建設(shè)投入達(dá)到20多億元，減排成效顯著。

1.2.4.2 pH對蛋白凝膠特性的影響 固定加酶量16 U/g,交聯(lián)溫度40 ℃,交聯(lián)時間1 h,考察pH(5、6、7、8、9)對蛋白凝膠硬度、彈性和內(nèi)聚力的影響。

1.2.4.3 溫度對蛋白凝膠特性的影響 固定加酶量16 U/g,pH為7,交聯(lián)時間1 h,考察交聯(lián)溫度(20、30、40、50、60、70 ℃)對蛋白凝膠硬度、彈性和內(nèi)聚力的影響。

1.2.4.4 時間對蛋白凝膠特性的影響 固定加酶量16 U/g,pH為7,交聯(lián)溫度40 ℃,考察交聯(lián)時間(0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 h)對蛋白凝膠硬度、彈性和內(nèi)聚力的影響。

1.2.5 響應(yīng)面實驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,以凝膠硬度為考察指標(biāo),選取TG酶添加量、交聯(lián)溫度、pH、交聯(lián)時間為實驗因素,確定凝膠形成的最佳條件,響應(yīng)面實驗因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面實驗因素與水平Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用Microsoft Excel(Office 2013)、Design Expert 7.0、SPSS Statistics 21軟件進(jìn)行分析。顯著性分析采用Duncana新復(fù)極差法比較,p<0.05認(rèn)為結(jié)果差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1TG酶添加量對山杏仁蛋白凝膠特性的影響

圖1 加酶量對山杏仁蛋白凝膠特性的影響Fig.1 Effect of TG amount on the gel properties of apricot protein gel注:同一性質(zhì),字母不同者為差異顯著(p<0.05),相同者為差異不顯著(p>0.05);圖2～圖4同。

由圖1可得,隨著TG酶添加量的增加,凝膠硬度呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢,當(dāng)加酶量為16 U/g時,凝膠硬度達(dá)到最大值106 g;彈性在0～8 U/g內(nèi)增加,之后變化不顯著,在8 U/g時達(dá)到最大值0.77;內(nèi)聚力在16～28 U/g時顯著高于0～12 U/g,在16 U/g時出現(xiàn)最大值0.47。TG酶交聯(lián)賴氨酸上的ε-氨基和谷氨酸上的γ-酰胺基形成共價鍵,促進(jìn)蛋白質(zhì)分子間的共價交聯(lián),生成了大分子聚集體,使得蛋白質(zhì)分子量增大,凝膠硬度也隨之增大[10]。但加酶量過高反而導(dǎo)致蛋白凝膠硬度有所下降,這是因為維系蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定所需的共價鍵的數(shù)目已達(dá)到飽和,過量的酶可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面的作用位點發(fā)生交聯(lián),減少了與周圍蛋白質(zhì)分子交聯(lián)的機(jī)會[11]。汪亞強(qiáng)[12]等利用TG酶催化制備小麥和大豆蛋白的混合凝膠,發(fā)現(xiàn)隨著加酶量的增加,凝膠強(qiáng)度持續(xù)增加,但并非一直呈正相關(guān)關(guān)系。所以選取加酶量在16 U/g。

2.2pH對山杏仁蛋白凝膠特性的影響

由圖2可知,隨著pH的升高,凝膠硬度和內(nèi)聚力均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,在pH為7時達(dá)到最大值;彈性在pH為5～7時增加,之后無顯著性變化。反應(yīng)體系的pH主要影響酶的活性和穩(wěn)定性,TG酶的最適pH為6.0～7.5,當(dāng)pH過高或過低,TG酶空間構(gòu)象發(fā)生改變導(dǎo)致活性降低[13];另一方面,當(dāng)pH接近山杏仁蛋白的等電點(pH4.1)時,蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀,無法形成有序的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),導(dǎo)致凝膠特性有所降低。袁建[14]等研究了pH對菜籽蛋白凝膠性的影響,發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH遠(yuǎn)離菜籽蛋白等電點時均具有良好的凝膠性,且堿性條件下的凝膠性高于酸性條件下的凝膠性,所以選取pH為7。

圖2 pH對山杏仁蛋白凝膠特性的影響Fig.2 Effect of pH on the gel properties of apricot protein gel

2.3交聯(lián)溫度對山杏仁蛋白凝膠特性的影響

如圖3所示,隨著交聯(lián)溫度的升高,山杏仁蛋白的凝膠硬度呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢,在溫度為40 ℃時達(dá)到最大值;彈性和內(nèi)聚力均先增加達(dá)到最大值,之后逐漸減小,內(nèi)聚力在60～70 ℃范圍內(nèi)卻顯著增加,這可能時因為高溫導(dǎo)致酶失活,此時蛋白質(zhì)發(fā)生熱聚集而非酶促聚集形成凝膠,使得凝膠內(nèi)聚力有所增加。研究表明TG酶的熱穩(wěn)定性較好,最適溫度為37～50 ℃,但加熱到70 ℃時活性便完全喪失,從而失去交聯(lián)蛋白質(zhì)的能力[15]。安靜等[16]人研究發(fā)現(xiàn),反應(yīng)溫度能顯著提高大豆分離蛋白的凝膠強(qiáng)度,40～60 ℃范圍內(nèi)變化不顯著,在70 ℃時卻顯著降低。所以選取交聯(lián)溫度為40 ℃。

圖3 交聯(lián)溫度對山杏仁蛋白凝膠特性的影響Fig.3 Effect of temperature on the gel properties of apricot protein gel

2.4交聯(lián)時間對山杏仁蛋白凝膠特性的影響

如圖4所示,時間在0.5～2 h范圍內(nèi)凝膠硬度變化不顯著,在時間達(dá)到2.5 h時硬度出現(xiàn)最大值,之后逐漸降低;彈性在0.5～3 h內(nèi)呈現(xiàn)輕微的先增加后降低的趨勢,其值均較高,在0.71以上,當(dāng)時間超過3 h卻顯著降低;內(nèi)聚力在1 h時達(dá)到最大值,之后逐漸減小。維系蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定的共價鍵數(shù)目有限,當(dāng)所需共價鍵數(shù)目達(dá)到飽和,過長時間的交聯(lián)反而會導(dǎo)致凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的破裂,使得蛋白的凝膠特性有所降低[17]。封小龍[18]研究了TG酶交聯(lián)時間對花生球蛋白和伴花生球蛋白凝膠硬度的影響,結(jié)果表明交聯(lián)時間在1～2 h內(nèi),花生球蛋白凝膠硬度無顯著變化,伴花生球蛋白凝膠硬度顯著增加,當(dāng)時間達(dá)到2.5 h時兩者的凝膠硬度均顯著降低。所以選取交聯(lián)時間2.5 h。

圖4 交聯(lián)時間對山杏仁蛋白凝膠特性的影響Fig.4 Effect of treatment time on the gel properties of apricot protein gel

2.5響應(yīng)面優(yōu)化實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果,依據(jù)Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計原理,運(yùn)用Design Expert 7.0軟件設(shè)計響應(yīng)面實驗,響應(yīng)面實驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodology experiment

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Variance analysis of mathematical regression model

注:*:p<0.05,顯著;**:p<0.01,極顯著。

采用Design Expert 7.0軟件對響應(yīng)面實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,得到山杏仁蛋白凝膠硬度的二次多項回歸模型為:

Y=127.00+4.83A+14.58B+6.83C+2.42D+2.75AB+17.50AC+2.75AD+8.25BC+4.25BD-0.75CD-24.79A2-33.92B2-17.29C2-32.92D2

對上述方程進(jìn)行方差分析,結(jié)果如表3所示。

由表3可知,回歸方程顯著性檢驗F值為14.47(p<0.0001),表明回歸方程在實驗點上的擬合度達(dá)到極顯著水平;失擬項檢驗F值為4.60(p=0.0772>0.05),表明差異不顯著,擬合的模型方程效果較好;回歸模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9352,表明模型成立有效。

模型中一次項C、交互項AC、二次項C2影響顯著;B、A2、B2、D2的影響達(dá)到極顯著水平。各因素對山杏仁分離蛋白凝膠硬度的影響程度由大到小依次為:交聯(lián)溫度(B)>pH(C)>TG酶添加量(A)>交聯(lián)時間(D)。

對于雙因素間的交互作用,模型中只有AC(TG酶添加量-pH)交互作用顯著,根據(jù)分析結(jié)果分別繪制雙因素交互作用的曲面圖和等高線,如圖5所示。由圖5可知,響應(yīng)面曲線為開口向下的拋物曲面,即在實驗范圍內(nèi)存在響應(yīng)值的最大值。當(dāng)交聯(lián)溫度為40 ℃,交聯(lián)時間為2.5 h時,TG酶添加量和pH的交互作用對響應(yīng)值起著二次影響作用。隨著TG酶添加量和pH的增加,山杏仁蛋白的凝膠硬度先增大后減小,在接近中心點時達(dá)到最大值。

圖5 TG酶添加量和pH對山杏仁蛋白凝膠硬度的交互作用分析Fig.5 Effect of TG amount and pH on the gel strength of apricot protein gel

對回歸方程進(jìn)行分析,可得TG酶交聯(lián)山杏仁蛋白凝膠的最佳理論工藝參數(shù):TG酶添加量17 U/g,交聯(lián)溫度43 ℃,pH為7.2,交聯(lián)時間2.5 h,此條件下山杏仁蛋白凝膠硬度的預(yù)測值為131 g。為檢驗響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果的可靠性,在上述條件下進(jìn)行重復(fù)驗證實驗,得到山杏仁蛋白的凝膠硬度為(135±7.14) g,與理論預(yù)測值的相對誤差在2.96%左右,說明模型優(yōu)化所得參數(shù)有效,可用于TG酶交聯(lián)山杏仁蛋白形成凝膠。

3 結(jié)論

利用TG酶交聯(lián)山杏仁蛋白形成凝膠,通過單因素實驗考察TG酶添加量、pH、交聯(lián)溫度、交聯(lián)時間對凝膠硬度、內(nèi)聚力、彈性的影響,結(jié)果表明TG酶對山杏仁蛋白的凝膠硬度、內(nèi)聚力、彈性均具有明顯的提高作用,其中交聯(lián)溫度對凝膠硬度的影響最大,pH、TG酶添加量次之,交聯(lián)時間的影響最小。并以凝膠硬度為指標(biāo),運(yùn)用Box-Behnken響應(yīng)面對條件進(jìn)行優(yōu)化,得到凝膠形成的最佳條件為TG酶添加量17 U/g,交聯(lián)溫度43 ℃,pH為7.2,交聯(lián)時間2.5 h,在此條件下凝膠硬度達(dá)到(135±7.14)g。本研究可為實現(xiàn)山杏仁餅粕的深加工與利用提供理論依據(jù)及技術(shù)指導(dǎo)。

[1]中科院中國植物志編輯委員會. 中國植物志[M]. 北京:科學(xué)出版社,1986:27-28.

[2]WANG L B,YU H Y. Biodiesel from Siberian apricot(Prunus sibirica L.)seed kernel oil[J]. Bioresource Technology,2012,112:355-358.

[3]ALPASLAN M,HAYTA M. Apricot kernel:physical and chemical properties[J]. Journal of the American Oil Chemists

Society,2006,83(5):469-471.

[4]EL-AAL M H A,HAMZA M A,RAHMA E H. In vitro digestibility,physico-chemical and functional properties of apricot kernel proteins[J]. Food Chemistry,1986,19(3):197-211.

[5]李科友,史清華,朱海蘭. 苦杏仁氨基酸的營養(yǎng)評析[J]. 林業(yè)科技開發(fā),2001,15(4):23-24.

[6]GASPAR A L C,GOES-FAVONI S P de. Action of microbial transglutaminase(MTGase)in the modification of food proteins:A review[J]. Food Chemistry,2015,171:315-322.

[7]顧欣,李莉,侯雅坤,等. 響應(yīng)面法優(yōu)化山杏仁蛋白提取工藝研究[J]. 河北林果研究,2010,25(2):162-168.

[8]薛蕾,李大文,尉芹,等. 苦杏仁蛋白的功能特性[J]. 食品科學(xué),2013,34(7):70-75.

[9]何軒輝. 超高壓對花生分離蛋白凝膠特性的影響及其機(jī)理研究[D]. 北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2013.

[10]YANG M,LIU F,TANG C H. Properties and microstructure of transglutaminase-set soy protein-stabilized emulsion gels[J]. Food Research International,2013,52:409-418.

[11]徐幸蓮,程巧芬,周光宏. 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對蛋白質(zhì)凝膠性能的影響[J]. 食品科學(xué),2003,24(10):38-43.

[12]汪亞強(qiáng),羅水忠,鐘昔陽,等. 谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶對大豆與小麥混合蛋白凝膠性質(zhì)的影響[J]. 食品科學(xué),2016,37(21):48-52.

[13]于國萍,安靜,初云斌,等. 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化對大豆分離蛋白凝膠性的影響[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2010,41(10):100-107.

[14]袁建,鞠興榮,何榮,等. 谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶改性菜籽蛋白凝膠特性的研究[J]. 食品科學(xué),2010,31(18):10-13.

[15]姜巍巍,于國萍. 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對大豆11S蛋白疏水性的影響[J]. 食品工業(yè)科技,2009,30(8):96-98.

[16]安靜,于國萍,初云斌,等. 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化對不同大豆蛋白凝膠性的影響[J]. 食品科學(xué),2011,32(6):32-37.

[17]胡曉. 酶法交聯(lián)與微射流均質(zhì)改性花生蛋白及其結(jié)構(gòu)與功能特性的研究[D]. 廣州:華南理工大學(xué),2011.

[18]封小龍. 花生蛋白組分制備、改性及應(yīng)用研究[D]. 北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2014.