李忠琴 張 坤 林 茂 賴曉健 江興龍

(1. 集美大學水產學院 廈門 361021; 2. 鰻鱺現代產業(yè)技術教育部工程研究中心 廈門 361021;3. 廈門市漁用藥物工程技術研究中心 廈門 361021)

氣單胞菌于自然環(huán)境中廣泛分布, 具有宿主范圍廣、致病性強等特點, 是造成水產養(yǎng)殖魚類細菌性疾病的主要病原菌之一。其中維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)為氣單胞菌屬中常見致病菌。其感染魚體主要癥狀表現為: 體表、鰭條有出血現象、腸道有黃色黏液、嚴重時充血, 解剖后肝臟出現糜爛等現象(簡燈, 2015)。已有研究報道稱維氏氣單胞菌能引起不同水產養(yǎng)殖動物如西伯利亞鱘(Acipenser baerii) (馬志宏等, 2009)、日本鰻鱺(Anguilla japonica)(楊求華等, 2012)、烏鱧(Channa argus) (康元環(huán)等,2014)、黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco) (朱成科等,2013)、中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis) (房海等, 2008)等大量死亡。而感染大黃魚發(fā)病的報道較少。

目前水產養(yǎng)殖中主要采用抗生素、生物制品、微生態(tài)制劑、環(huán)境改良劑、中草藥等藥物防治細菌性疾病(李輝華等, 2001)?？股貙λa動物疾病防治, 促進生長等方面有明顯作用, 但大量頻繁的使用不僅導致耐藥菌株的產生, 而且易造成藥物殘留、抑制魚體免疫系統(tǒng)、破壞微生態(tài)平衡等現象(胡夢紅, 2006)。因此, 合理適宜的對癥下藥、及時檢測重分離菌株耐藥性、研發(fā)替代綠色藥物(中草藥)顯得尤為關鍵。中藥具有生物活性, 并且對熱相對穩(wěn)定、易溶于水和不污染環(huán)境等特點, 可以解決抗菌化學類藥物引起的耐藥性和養(yǎng)殖魚類藥殘超標等問題, 符合無公害水產業(yè)、生產綠色水產品的病害防治原則。因此, 越來越被水產養(yǎng)殖業(yè)所接受和重視, 可作為代替抗菌藥物應用于水產養(yǎng)殖防治細菌性疾病。

大黃魚(Pseudosciaena crocea)是我國海水養(yǎng)殖產品中的重要經濟魚類。近十多年來, 隨著人工繁育、網箱養(yǎng)殖等難關的突破, 大黃魚人工養(yǎng)殖得以迅速發(fā)展, 據統(tǒng)計, 2014年我國年產大黃魚 12.79萬噸,為海水養(yǎng)殖魚類之最(農業(yè)部漁業(yè)漁政管理局, 2015)。然而隨著養(yǎng)殖規(guī)模與密度的不斷擴大, 造成的養(yǎng)殖環(huán)境污染以及病害問題也相繼出現, 已成為阻礙大黃魚產量提高, 養(yǎng)殖業(yè)穩(wěn)定發(fā)展的主要因素。每年由各類病害造成的經濟損失達數億元人民幣, 其中尤以細菌性疾病的危害最大, 不同細菌引起的大黃魚疾病主要包括潰瘍病、內臟結節(jié)(白點病)、鰓炎、腸炎等(黃志斌, 1999; 沈錦玉等, 2008; 王程程等,2014), 該病害傳播速度快, 致死率極高。因此相關的大黃魚疾病防治研究工作亟需展開, 首要任務就是研究大黃魚在養(yǎng)殖階段出現的病害, 了解其病害的種類和發(fā)生規(guī)律, 從而為有效防治大黃魚疾病提供科學依據。2014年7月, 養(yǎng)殖大黃魚于廈門集美大學海水試驗場出現病情。本研究從現場取回患病大黃魚并進行病原菌的分離、鑒定及相關抗生素藥物試驗, 旨在弄清大黃魚致病菌, 并為此病防治提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

患病大黃魚(Pseudosciaena crocea)取自廈門集美海水養(yǎng)殖場, 其典型癥狀表現為體表皮膚出現點狀出血, 表皮鱗片脫落, 嚴重時出現潰瘍, 背、尾鰭出血, 解剖魚體發(fā)現部分腸道有黃色黏液, 肝臟有白色結節(jié)。人工感染試驗所用吉富羅非魚(Oreochromis niloticus)購自漳州某羅非魚養(yǎng)殖場, 體長(13±2)cm,體重(30±2)g。共計70尾。

2216E瓊脂培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基(BR, 山東青海高科園海博生物技術有限公司); GYZ-15eV發(fā)酵型革蘭氏陰型桿菌生化編碼鑒定管、藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司; Biolog專用培養(yǎng)基(BUG Agar, Biolog universal Growth Agar); 細菌基因組提取試劑盒、DNA Marker (2000bp)、16S rRNA擴增引物(27F/1492R)、Taq酶(上海捷瑞生物工程有限公司)。

生化培養(yǎng)箱(LRH-250, 上海一恒科技有限公司);Biolog自動微生物鑒定系統(tǒng)(Gen Ⅲ Microstation , 美國 Biolog公司); 酶標儀(1510-00669C, Thermo Scientific); PCR熱循環(huán)儀(TCA0096, Thermo Scientific); 電泳儀(EPS300, Tanon)。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離 無菌操作解剖魚體, 取皮膚、鰓、腎臟、肝臟等病變部位于2216E瓊脂培養(yǎng)基上劃線接種, 28℃培養(yǎng)24h后挑取優(yōu)勢菌于TSA培養(yǎng)基(含1% NaCl)上劃線純化, 并將純化后的單菌落劃線至新鮮TSA斜面上, 28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h, 用20%甘油洗下并分裝于–80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 傳統(tǒng)表型特征鑒定 將純化后菌株于 TSA培養(yǎng)基上接種激活, 經革蘭氏染色后鏡檢, 觀察菌落大小、形態(tài)等。采用GYZ-15eV發(fā)酵型生化試劑盒對菌株常規(guī)生理生化特征進行鑒定, 并通過 Biolog自動鑒定系統(tǒng)檢測菌株對碳源利用的特異性。具體操作參照產品使用說明書。

1.2.3 16S rRNA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構建將待測菌株接種于LB肉湯中, 28℃過夜振蕩培養(yǎng)24h,置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。按?DNA抽提試劑盒方法提取細菌DNA作為模板。參考已有文獻資料(郭松林,2006)的引物及反應條件進行 16S rRNA基因序列擴增。50μL的PCR反應體系為: 10×PCR buffer (with Mg2+15mmol/L) 5μL; 10mmol/μL 的 dNTP 酶 1μL;2.5U/μL 的 Taq DNA 酶 1μL; 12.5μmol/L 正反向引物各1μL; DNA模板 2μL; 加雙蒸水至50μL。擴增產物經 1%瓊脂糖凝膠電泳驗證后, 送至上海生工生物工程有限公司測序。登錄NCBI將獲得的16S rRNA序列與 GenBank中的已知核酸序列進行同源性比對,用 ClustalX(1.81)軟件對與該菌株同源性較高的同屬其他菌株序列進行多重序列匹配排列, 之后使用MEGA 5.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建, 置信度檢測通過自舉分析, 自舉數據集為1000次。

1.2.4 人工回歸感染試驗 取70尾體重為(30±2)g健康羅非魚, 平均分成7組, 每組設置2個平行, 各5尾魚。其中設置一組為注射生理鹽水對照組, 另外 6組為注射不同濃度菌液試驗組。將菌株于 TSA瓊脂斜面劃線純化培養(yǎng) 8—24h后, 用 0.85%生理鹽水沖下制成菌懸液。結合比濁法與平板計數法, 稀釋菌液并調至1.33×109CFU/mL, 經10倍梯度稀釋后(100、101、102、103、104、105)對各組羅非魚進行腹腔注射,每尾100μL。連續(xù)觀察7d, 記錄試驗魚的發(fā)病及死亡情況, 同時對瀕臨死亡或剛死亡的魚進行病原菌的重分離并鑒定。按照Spearman-Karber法(Hamilton et al, 1977)計算菌株對羅非魚的半致死量(LD50)。

1.2.5 抗生素紙片藥敏試驗 采用紙片擴散法,用移液槍吸取100μL濃度為108CFU/mL的菌懸液無菌涂布于TSA瓊脂平板上, 將鑷子灼燒后夾取24種抗生素紙片輕輕貼至平板表面, 倒扣于 28℃恒溫培養(yǎng) 24h后測定抑菌圈直徑。根據抑菌圈直徑的大小,以及《抗菌藥物敏感試驗執(zhí)行標準第十九版信息增刊》(CLSI, 2009)說明, 判定菌株對不同抗生素敏感性差異。

1.2.6 中藥體外抑菌試驗 采用瓊脂稀釋法, 將攪碎后不同質量的中藥超微粉加至經 121℃、20min高壓滅菌后的 TSA瓊脂培養(yǎng)基中, 配置成不同濃度梯度的含藥培養(yǎng)基。每個藥物濃度梯度做兩組平行試驗, 對照組為不加中藥的 TSA 瓊脂培養(yǎng)基。取 2μL濃度為108CFU/mL菌懸液點種于含藥培養(yǎng)基后倒置于28℃恒溫箱培養(yǎng), 分別于24h、48h后記錄培養(yǎng)基上菌落的生長情況, 并計算最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)及計算最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration, MBC)值。

2 結果

2.1 菌株的分離與鑒定

2.1.1 菌株分離與形態(tài) 分離自患病大黃魚肝臟處菌株9L2置于28℃培養(yǎng)24h后, 在TSA培養(yǎng)基上形成表面隆起, 半透明光滑、圓形、濕潤呈液滴狀、邊緣整齊的灰白色菌落, 直徑為1—2mm。

2.1.2 生理生化鑒定結果 菌株 9L2為發(fā)酵型革蘭氏陰性短桿菌, 具有運動性, 氧化酶、V-P、ONPG試驗呈陽性, 能產生吲哚, 利用賴氨酸、枸櫞酸鹽;不能利用苯丙氨酸、鳥氨酸、尿素酶等。根據菌株9L2與維氏氣單胞菌標準株(CECT4199)的GYZ-15eV系統(tǒng)鑒定結果(表 1)可知, 兩株菌的常規(guī)生理生化特征高度一致。查閱鑒定手冊表明, 9L2為維氏氣單胞菌, 可信度達到92.46%。

2.1.3 Biolog系統(tǒng)自動鑒定結果 Biolog系統(tǒng)根據不同微生物對碳源利用的特異性及利用碳源過程中發(fā)生的氧化-還原反應產生濁度變化模式圖, 從而依據“代謝指紋”建立與物種相對應的數據庫。因其快速、簡便、準確率高等特點, 極大簡化了鑒定細菌的步驟以及避免了對未知菌生理生化指標測定時人工操作造成檢測誤差。本試驗 Biolog自動系統(tǒng)鑒定結果表明(表 2), 菌株 9L2為維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii), 相似性為0.617, 可信度為100%。

2.1.4 16S rRNA基因序列分析 采用PCR擴增出菌株9L2的16S rRNA基因, 經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示(圖 1), 目的條帶長度約為 1500bp。經測序獲得菌株16S rRNA基因序列登錄號(KU525083),通過與NCBI上已知標準基因序列同源性比對后, 發(fā)現菌株 9L2與維氏氣單胞菌(EU488698)同源性高于99.7%。構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)后顯示菌株9L2與維氏氣單胞菌聚為一支。綜上所述, 確定分離菌9L2為維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)。

2.2 人工感染試驗

菌株 9L2人工感染羅非魚結果顯示(表 3): 攻毒1d后未出現死亡; 第二天開始隨著細菌注射量的升高, 死亡數增多。其中注射量為4.43×106CFU/g組羅非魚在四天內全部死亡, 4.43×105CFU/g與4.43×104CFU/g組羅非魚在感染 1d后開始死亡, 累計死亡率達到90%。其余三組死亡數隨著注射量的梯度降低而減少。對照組的羅非魚未見異常。對瀕死的羅非魚病原菌進行重分離后發(fā)現其生理生化鑒定結果與菌株9L2相同?；疾◆~體表現為不進食, 反應遲鈍, 體表、尾鰭呈點狀出血, 嚴重時產生潰瘍, 解剖后發(fā)現腸道有黃色黏液, 肝臟出現白色結節(jié)等, 與自然發(fā)病大黃魚的疾病癥狀相似(圖3), 通過Spearman-Karber法計算出菌株 9L2對羅非魚的半致死劑量(LD50)1.08×103CFU/g。

表2 大黃魚病原菌的Biolog系統(tǒng)鑒定指標結果Tab.2 The result of Biolog system indexes to the strains

圖1 分離菌株16S rRNA基因擴增產物電泳結果Fig.1 Agarose electrophoresis results of 16S rRNA gene fragments of pathogen strains

2.3 藥敏試驗

圖2 基于氣單胞菌的16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of Aeromonas based on 16S rRNA gene注: 括號內為序列登錄號

表3 菌株9L2人工感染羅非魚試驗Tab.3 Artificial infection of pathogenic strain 9L2 in healthy O. niloticus

圖3 回歸感染羅非魚與患病大黃魚病癥對比Fig.3 Comparison in symptom caused by pathogenic bacteria between O. niloticus and P. crocea注: A. 菌株9L2感染羅非魚后的解剖圖; B. 菌株9L2感染羅非魚后肝臟出現白色結節(jié); C. 菌株9L2感染大黃魚后的解剖圖; D. 菌株9L2感染大黃魚后肝臟出現白色結節(jié)

表4 致病菌9L2對24種抗生素藥物的抑菌試驗結果Tab.4 Sensitive results of pathogen bacteria 9L2 to 24 antibiotics

菌株9L2對諾氟沙星、阿莫西林、鏈霉素、慶大霉素、復方新諾明、四環(huán)素、萬古霉素、強力霉素、新生霉素、萘啶酸、頭孢曲松、呋喃妥等12種藥物高度敏感, 占總數的50%; 對洛美沙星、頭孢拉定、乙酰螺旋霉素、卡那霉素、頭孢他啶等5種藥物中度敏感, 占總數的 20.8%; 對利福平、氨芐西林、青霉素、頭孢噻吩、頭孢唑林、阿米卡星、哌拉西林等7種藥物產生耐藥性, 占總數的29.2%(表4)。

2.4 中藥體外抑菌試驗

不同中藥對致病菌 9L2的體外抑菌試驗結果表明(表5): 20種中藥中有11種對致病菌的體外抑菌及殺菌作用效果較好, 最低抑菌濃度范圍為 0.11—7.20mg/mL, 最低殺菌濃度為0.11—7.20mg/mL。其中五倍子、黃芩及地榆針對致病菌的抑菌效果最佳,其平均抑菌濃度、平均殺菌濃度均低于1mg/mL, 分別為0.11、0.90、0.90mg/mL; 黃連、丁香、石榴皮、大黃、虎杖、訶子等 6種中藥對致病菌的抑菌效果較好, 最低抑菌濃度范圍在 1.80—3.60mg/mL之間;另外 2種中藥苦楝及魚腥草效果次之, 最低抑菌濃度、最低殺菌濃度均為7.20mg/mL。其余10種中藥效果較差, 平均抑菌濃度及平均殺菌濃度均大于10mg/mL。

表5 20種中藥對致病菌9L2的體外抑菌效果(mg/mL)Tab.5 The inhibitory effect of 20 Chinese herbs on pathogen strain 9L2 (mg/mL)

3 討論

3.1 分離菌株的鑒定

表型鑒定法和分子遺傳學鑒定法作為細菌鑒定的兩大類被廣泛應用于食品安全、醫(yī)療衛(wèi)生以及科學研究等領域。本研究自患病大黃魚肝臟處分離得到一株致病菌, 經傳統(tǒng)表型特征及16S rRNA基因序列分析, 確定該菌株為維氏氣單胞菌。

目前針對傳統(tǒng)生理生化特征鑒定, 國際上普遍采用的是《伯杰氏細菌系統(tǒng)分類學手冊》。該書作為分類鑒定法的基本依據, 提供了已報道菌株的種屬描述, DNA相關性等分類學特性。但由于細菌的生理生化特征有近百種, 且表型的表達不穩(wěn)定, 敏感性不高, 導致需測試的指標多, 費時費力。因此基于計算機數理統(tǒng)計的自動化鑒定系統(tǒng)應運而生。例如Biolog自動化系統(tǒng)鑒定是基于碳源利用圖譜開發(fā)的一套微生物鑒定系統(tǒng)。因其數據庫全面、鑒定范圍廣、標準自動化程度高等優(yōu)勢, 已成為鑒定細菌等領域中的常用技術手段(馮瑞華等, 2000; 張朝正等, 2009)而被廣泛應用。Sellami等(2011)對108株臨床醫(yī)學上對人類產生致病性的氣單胞菌屬進行 Biolog系統(tǒng)鑒定,通過與API20E試劑盒鑒定結果、功能基因RpoB鑒定結果相比較, 表明 Biolog鑒定結果具有快速可靠等優(yōu)點; 王榮華等(2015)通過對水產動物斑點叉尾腸套疊病病原菌進行鑒定, 比較了 Biolog系統(tǒng)鑒定及16S rRNA基因序列分析鑒定結果具有高度一致性;然而由于細菌鑒定的可靠性受多方面的影響, 利用Biolog系統(tǒng)鑒定細菌時仍需注意其對不常見分離菌的鑒定效果較差, 易受到不利因素的影響(如細胞受損), 系統(tǒng)數據庫覆蓋范圍需不斷更新以保證鑒定菌種的準確性(吳會桃等, 2010)。同時由于國內尚未開發(fā)專門應用于水產動物細菌鑒定的自動化鑒定系統(tǒng),導致Biolog成本高, 不利于基層應用推廣。

鑒于傳統(tǒng)表型特征鑒定法耗時、準確性易受多方面因素影響的缺陷。利用分子遺傳學鑒定法從核酸水平出發(fā), 極大地為傳統(tǒng)分類學鑒定起到補充作用。16S rRNA基因存在于所有生物中, 在結構與功能上具有高度的保守性, 物種間的差異體現在高變序列區(qū)域。其序列特征為近緣種的分類奠定了分子生物學基礎, 因而廣泛應用于菌種鑒定和系統(tǒng)發(fā)生學研究。研究表明16S rRNA基因能準確鑒定菌株的屬, 不過在種間由于基因的高度保守性而受到限制(Martin-Carnahan A et al, 2005)。因此在鑒定細菌的過程中,僅靠一種方法是不夠的, 必須綜合幾種方法才能準確對菌株進行判定。

3.2 維氏氣單胞菌毒力分析

人工回歸感染試驗證實菌株 9L2對羅非魚具有強致病力, 感染后的羅非魚主要癥狀與與自然患病的大黃魚臨床表現大體一致, 根據科赫法則可證實菌株9L2為患病大黃魚的致病菌。半致死劑量的大小是衡量微生物毒力強弱的重要指標, 但影響半致死劑量的因素有很多。比如微生物自身毒力, 受試動物的個體、種類、健康狀況等。本研究雖然測定出分離自大黃魚病灶處致病菌的半致死劑量, 但因受條件限制, 選擇了羅非魚作為代替魚。因此不能認為這些菌株對大黃魚的半致死劑量與羅非魚相同, 且菌株的致病機理還有待進一步研究。

3.3 分離菌的藥物敏感性分析

抗生素是水產養(yǎng)殖過程中重要的防治細菌性疾病藥物, 主要包括氨基糖苷類、青霉素類、喹諾酮類、頭孢類等?？股卦谝种迫~酸代謝、細菌細胞壁合成等方面有顯著效果。但隨著長期低劑量的使用, 導致菌株耐藥性的產生。本研究中24種抗生素對致病菌9L2的藥敏試驗表明, 該菌對諾氟沙星、阿莫西林、鏈霉素等 12種藥物高度敏感; 對洛美沙星、頭孢拉定、乙酰螺旋霉素等5種藥物中度敏感; 對利福平、氨芐西林、青霉素等7種藥物產生耐藥性。這與夏飛等(2012)、黎炯等(2011)研究結果有所差異, 可能是由于菌株在分裂繁殖及針對藥物不斷選擇性進化的過程中, 已對大部分抗生素產生耐藥性, 另外不同宿主來源、區(qū)域分布及菌株數量極大影響著細菌對抗生素的耐藥性。因此在實際生產中應充分考慮菌株耐藥機制, 科學合理用藥, 避免誘導致病菌產生對抗菌藥物的廣泛耐藥性, 同時需在國家漁業(yè)用藥準則(中華人民共和國農業(yè)部, 2002)許可的條件下, 有針對性地選擇大黃魚細菌性疾病防治藥物。另外, 為確保水產養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展, 應加強無耐藥性、無殘留的替代品的研發(fā)以取代抗生素。

中藥具有低毒、無殘留、不易產生抗藥性等特點,所含有效成分包括生物堿、鞣質、糖類、甙類、氨基酸、蛋白質等。這些成分具有明顯抑菌作用, 且對機體免疫狀態(tài)的改善, 自身抗菌能力的提高有積極作用, 可作為代替抗菌藥物應用于水產養(yǎng)殖防治細菌性疾病。本試驗通過研究20種中藥對大黃魚致病維氏氣單胞菌的體外抑制作用, 表明 11種中藥的體外抑菌及殺菌效果較好, 平均抑菌濃度為 0.11—7.20mg/mL。這與馬志宏等(2011)研究結果有所差異,分析原因可能是因為中藥加工方式不同。該試驗所用中藥為經水提取濃縮后的浸膏物, 有利于中藥的有效成分充分融入水中。其次菌株的血清型及分離源、中藥的采集地及藥用部位、提取方法等多種因素也可能對藥敏試驗結果產生影響。另外, 在實際生產中,常利用不同中藥間的相互協(xié)同作用, 將具有抑菌作用的中藥組合成復方, 更有效地發(fā)揮中藥的抑菌作用, 從而達到防治維氏氣單胞菌等引起的細菌性疾病目的。馬志宏, 李鐵梁, 姜 娜等, 2011. 中草藥對致病性維氏氣單胞菌體外抑菌活性及最優(yōu)組方研究. 中國畜牧獸醫(yī), 38(6):155—159

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