王騰騰 韋秀梅 常 城 韓慧宗 姜海濱①

(1. 上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院 上海 201306; 2. 山東省海洋資源與環(huán)境研究院山東省海洋生態(tài)修復重點實驗室煙臺 264006)

乳酸菌(Lactic acid bacteria)是一類不運動、無芽孢、能利用碳水化合物發(fā)酵并產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽性細菌的統(tǒng)稱(張剛, 2007)。因其具有綠色安全、無毒副作用、無殘留的特點, 在海水魚養(yǎng)殖業(yè)中具有廣闊的應用前景。章蔚(2012)發(fā)現(xiàn)用分離獲得的明串珠菌屬乳酸菌投喂黑鯛幼魚, 可以提高幼魚腸道菌群多樣性、促進幼體腸道的生長發(fā)育; Gatesoupe等(1994)以乳桿菌強化的活體輪蟲作為大菱鲆幼體的食物, 證實了乳酸菌的使用可以提高幼魚成活率; 王福強(2005)用鼠李糖乳桿菌P15投喂牙鲆稚魚, 達到了降低水中和牙鲆消化道中弧菌數(shù)量、提高成活率、促進生長的效果。以上研究證明, 乳酸菌可以促進海水魚類生長、提高成活率, 在海水魚養(yǎng)殖業(yè)的應用有望減少抗生素使用, 促進海水魚養(yǎng)殖業(yè)健康和可持續(xù)發(fā)展。

許氏平 鲉 (Sebastes schlegelii)是我國黃渤海區(qū)域習見的魚類之一, 因其肉質鮮美、營養(yǎng)豐富、抗逆性強、生長迅速, 已成為北方沿海網(wǎng)箱養(yǎng)殖和人工放流的重要經(jīng)濟魚類。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大, 病害問題日益突出, 許氏平鲉養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展受到制約。從許氏平鲉腸道中分離乳酸菌等益生菌, 對于研制有效的微生態(tài)添加劑, 提 高許氏平 鲉 抗病能力具有重要的現(xiàn)實意義。目前國內(nèi)外對許氏平 鲉 的研究主要集中在繁殖生物學(馮東岳等, 2003)、發(fā)育生物學(楊艷萍等,2012; 藺玉珍等, 2014; 馬麗曼, 2014)等方面, 對其腸道微生物的研究非常有限, 腸道乳酸菌分離鑒定和特性分析的研究更未見報道。本研究首次從野生許氏平 鲉 腸道內(nèi)分離獲得了一株乳酸菌, 采用 16S rDNA基因序列分析法對其進行了分類鑒定, 并對其生長特性、抑菌特性及動物安全性進行了研究, 旨在為篩選能夠提高許氏平 鲉 免疫力和抗病能力、促進其生長的乳酸菌提供理論依據(jù), 從而為研發(fā)適用于許氏平 鲉 養(yǎng)殖業(yè)的微生態(tài)制劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

海捕野生許氏平 鲉 體長 17.51cm, 購于煙臺市遲家農(nóng)貿(mào)市場, 用 于乳酸菌的分離。健康許氏平 鲉 體長9.87±1.73cm, 由煙臺泰華海珍品有限公司提供, 用于乳酸菌的安全性檢測實驗。

1.2 細菌分離純化

用 70%的酒精擦拭魚體腹部表面, 在無菌條件下解剖, 剪下中腸段; 去除腸道內(nèi)容物, 以無菌生理鹽水沖洗2次后, 用解剖刀刮取腸道內(nèi)壁的黏液, 加入到無菌生理鹽水中, 渦旋振蕩搖勻后均勻涂布于MRS固體培養(yǎng)基。30°C無氧條件下培養(yǎng)至出現(xiàn)菌落,再重復平板劃線分離出單菌落。挑取單菌落 30°C擴繁后保種于甘油中。

1.3 細菌鑒定

1.3.1 菌落形態(tài)觀察及生理生化特征鑒定 將保種的菌株接種于 MRS培養(yǎng)基中, 培養(yǎng)24h后觀察菌落形態(tài)、顏色等。挑取菌落進行革蘭氏染色和脫脂乳試管凝固試驗。將培養(yǎng)到指數(shù)期的菌株經(jīng)戊二醛(2.5%)固定、磷酸緩沖液(pH7.4)漂洗、酒精梯度脫水和叔丁醇重懸后制作玻片, 通過掃描電鏡觀察其形態(tài)特征; 以梅里埃 API 50CHL試劑條進行生理生化測試, 對分離獲得的細菌進行初步鑒定。

1.3.2 細菌 16S rDNA基因序列分析 采用 16S rDNA基因序列分析的方法對初步鑒定的細菌進行分子鑒定。擴增引物序列為: 8F-5′AGAGTTTGATCCTG GCTCAG3′, 1492R-5′GGCTACCTTGTTACGACTT3′。反應體系為 50μL, 其中包括: 正、反向引物(10mmol/L)各 2μL, 2μL 分離菌菌液, 0.4μL Taq 酶,5μL 10×PCR Buffer (Mg2+), 4μL dNTPs, 34.6μL ddH2O。序列擴增反應條件為: 94°C 5min; 94°C 30s,55°C 30s, 72°C 2min, 30 個循環(huán); 72°C 10min。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 送至英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司北京測序實驗室進行測序。測序結果用BLAST軟件與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中所收集的相關種屬的16S rDNA序列進行同源性分析。

1.4 生長特性分析

1.4.1 pH對生長的影響 取100μL培養(yǎng)至指數(shù)期的菌懸液接種于終pH值分別為3.2、4.2、4.9、5.7、6.5、7.2、8.4、8.8、9.1、9.4、9.6、10.3 的 MRS 培養(yǎng)基中, 30°C培養(yǎng)24h后檢測600nm的光密度, 并測定培養(yǎng)基的最終pH值。每個實驗組設三個平行。采用SPSS軟件包單因素方差分析法(one-way ANOVA)中的 Duncan多重比較檢驗法進行數(shù)據(jù)分析, 再利用Origin 8.0軟件作圖。

1.4.2 溫度對生長的影響 取 100μL培養(yǎng)至指數(shù)期的菌懸液接種到MRS培養(yǎng)基中, 分別置于5、10、15、20、25、30、35、40、45和 50°C 下培養(yǎng) 24h, 檢測 600nm的光密度。每個實驗組設三個平行。數(shù)據(jù)分析和作圖方法同上。

1.4.3 NaCl含量對生長的影響 取100μL培養(yǎng)至指數(shù)期的菌懸液接種于NaCl含量(w/v%)為0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10的MRS培養(yǎng)基中, 30°C培養(yǎng)24h后檢測600nm的光密度。每個實驗組設三個平行。數(shù)據(jù)分析和作圖方法同上。

1.5 抑菌作用分析

采用平板擴散法檢測乳酸菌產(chǎn)物的抑菌作用。選取金黃色葡萄球菌、嗜水氣單胞菌、大腸桿菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、遲鈍愛德華氏菌、鰻弧菌、假交替單胞菌和哈維氏弧菌作為指示菌。指示菌培養(yǎng)至指數(shù)期后加入到未冷凝的固體培養(yǎng)基中, 待培養(yǎng)基凝固后制作直徑 5mm的加樣孔。乳酸菌置于37°C、200r/min振蕩培養(yǎng)12h至指數(shù)期后, 10000r/min離心5min, 取200μL上清液加入指示菌平板的加樣孔中, 對照組加等量的MRS液體培養(yǎng)基, 30°C培養(yǎng)24—48h后觀察和測量抑菌圈大小。每種指示菌設三個平行。

1.6 安全性檢測

安全性檢測實驗參照El-Rhman等(2009)、Aly等(2008)的 方法設計。選取健康許氏平 鲉 40尾, 分4組,每組 10尾, 暫養(yǎng)于 70L玻璃缸內(nèi), 水溫 15±1°C。日換水1次, 每次換水1/5; 連續(xù)充氣, 不投喂食物, 及時清理糞便; 暫養(yǎng)一周后用于實驗。乳酸菌在 37°C,200r/min條件下振蕩培養(yǎng) 12h至指數(shù)期后,10000r/min離心5min, 用0.65%的無菌生理鹽水重懸至108CFU/mL。

第1 組 許氏平 鲉 每尾肌肉注射100μL菌懸液, 第2組每尾肌肉注射100μL0.65%無菌生理鹽水為對照;第3組每尾腹腔注射1000μL菌懸液, 第4組每尾腹腔注射相同劑量的0.65%無菌生理鹽水為對照。每組設三個平行。注射后連續(xù)觀察 10天, 統(tǒng)計各組許氏平 鲉 的生長和死亡狀況。

2 結果與分析

2.1 細菌的鑒定結果

2.1.1 初步鑒定結果 實驗共分離純化出35株腸道菌, 通過細菌生化測試實驗, 選取革蘭氏染色呈陽性, 脫脂乳試管凝固試驗中牛乳出現(xiàn)凝固、無氣泡、呈酸性現(xiàn)象的一株細菌初步鑒定為乳酸菌, 命名為YH1。該菌株的菌落呈白色、圓形、表面光滑、邊緣圓潤。掃描電鏡結果如圖 1所示, 乳酸菌 YH1細胞形狀規(guī)則, 呈桿狀, 無鞭毛, 表面較光滑, 長度約為1.87μm、寬度約為0.69μm。菌株YH1的生理生化特征描述如表1所示。

2.1.2 16S rDNA序列分析結果 采用PCR儀擴增細菌YH1的16S rDNA基因獲得大小為1456bp的片段, 將該序列提交到GenBank核苷酸序列數(shù)據(jù)庫, 登陸號為KX440974.1。16S rDNA序列比對結果顯示:菌株 YH1與食竇魏斯氏菌(Weissella cibaria)CH2(CP012873.1)的相識度為 99%, 與食竇魏斯氏菌JCM7777(AB911503.1)的相識度為 99%, 與食竇魏斯氏菌 CAG13(AB572036.1)的相識度為 99%, 屬魏斯氏菌屬成員; 結合其形態(tài)學和生理生化特征, 確定菌株YH1為食竇魏斯氏菌YH1。

2.2 YH1的生長特性研究結果

圖1 YH1的掃描電鏡圖(標尺=500nm)Fig.1 Scanning electron micrograph of Strain YH1

表1 YH1的生理生化特征鑒定結果表Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of strainYH1

2.2.1 不同pH值下 YH1的生長情況 食竇魏斯氏菌YH1在初始pH為4.2—8.8的培養(yǎng)基下均能生長,但生長情況存在明顯差異。在初始pH為4.2—8.4的培養(yǎng)基中, 隨著初始 pH的升高, 培養(yǎng)液在實驗終止與初始時的 OD600差值不斷增加, 在初始 pH為7.2—8.4處達到最大, 說明在該pH范圍下YH1生長情況最好; 在 8.4—8.8內(nèi), 培養(yǎng)液的 OD600差值有所下降。當培養(yǎng)基初始 pH過低(pH=3.2)或者過高(pH=9.1、9.4、9.6、10.3), YH1幾乎不生長(圖 2)。不同pH條件下YH1生長24h后, 培養(yǎng)基pH的變化結果如圖3所示, 初始pH4.9—8.8的培養(yǎng)液發(fā)酵24h后的 pH均發(fā)生了明顯變化, 且隨著初始 pH的不斷增大, 24h后的pH降幅越大; 初始pH過低(pH=3.2)或者過高(pH=9.1、9.4、9.6、10.3), 培養(yǎng)基的 pH無變化(圖 3)。

圖2 不同pH條件下YH1的生長情況Fig.2 The growth of YH1 in various pH注: 所有數(shù)據(jù)按照平均值±標準差(n=3)表示。不同字母表示兩組間YH1生長情況差異顯著(P＜0.05)。

圖3 不同pH條件下YH1生長24h培養(yǎng)基pH的變化Fig.3 The variations of medium pH after 24h culture under different initial pH

2.2.2 不同溫度下YH1的生長情況 食竇魏斯氏菌 YH1在 15—45°C 均能生長, 其中最適生長溫度35°C, 且各溫度下YH1的生長情況存在顯著差異。在15—35°C, 隨著培養(yǎng)溫度的升高, YH1培養(yǎng)液在實驗終止與初始時的OD600差值逐漸增大, 在35°C時達到最大值, 為0.979。當培養(yǎng)溫度大于35°C時, YH1培養(yǎng)液在實驗終止與初始時的OD600差值逐漸降低。當培養(yǎng)溫度過低(T=5°C、10°C)或溫度過高(50°C)時,YH1培養(yǎng)液在實驗終止與初始時的 OD600差值最低,YH1幾乎不生長(圖4)。

2.2.3 不同NaCl含量下YH1的生長情況 食竇魏斯氏菌YH1在NaCl含量(w/v%)為0—10的MRS培養(yǎng)基中均能生長。隨著NaCl含量的升高, YH1培養(yǎng)液在實驗終止與初始時的OD600差值逐漸降低, 說明向MRS培養(yǎng)基中添加NaCl會抑制YH1的生長。不同NaCl含量條件下YH1生長情況的差異性如圖5所示。

圖4 不同溫度下YH1的生長情況Fig.4 The growth of YH1 in various temperatures注: 所有數(shù)據(jù)按照平均值±標準差(n=3)表示。不同字母表示兩組間YH1生長情況差異顯著(P＜0.05)。

圖5 不同NaCl含量下YH1的生長情況Fig.5 The growth of YH1 vs. concentration of NaCl注: 所有數(shù)據(jù)按照平均值±標準差(n=3)表示。不同字母表示兩組間YH1生長情況差異顯著(P＜0.05)。

2.3 YH1產(chǎn)物的抑菌活性

分析 YH1產(chǎn)物的抑菌活性發(fā)現(xiàn), 該產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌、嗜水氣單胞菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、遲鈍愛德華氏菌、鰻弧菌、假交替單胞菌、哈維氏弧菌等指示菌均有抑制作用, 可形成直徑為 11—21mm的抑菌圈(表2)。其中YH1的產(chǎn)物對假交替單胞菌和鰻弧菌的抑菌效果如圖6所示。YH1的產(chǎn)物具有廣譜抑菌性。。

2.4 YH1對許氏平鲉的安全性

以108CFU/mL 濃 度向許氏平 鲉 體內(nèi)注射YH1并未引發(fā)魚體發(fā)病或死亡, 表明YH1在108CFU/mL及以下濃度對 許 氏平 鲉 是相對安全的(表3)。

表2 YH1產(chǎn)物對指示菌的抑菌活性Tab.2 Antimicrobial activity of YH1's supernatant on indicatorbacteria

表3 YH1對許氏平鲉的安全性Tab.3 Safety test on YH1 to S. schlegelii

3 討論

近年來, 對于鼠李糖乳桿菌(王福強, 2005)、明串珠球菌(章蔚, 2012)等常見乳酸菌的研究發(fā)現(xiàn), 乳酸菌可以改善養(yǎng)殖水域環(huán)境、提高養(yǎng)殖魚類免疫力。這些研究為從海水魚類腸道分離的乳酸菌進一步應用于海水魚類養(yǎng)殖奠定了基礎。魏斯氏菌作為一種不常見乳酸菌, 對其的研究相對較少。本研究從野生海捕的許氏平 鲉 腸道內(nèi)分離獲得了一株特征明顯的乳酸菌菌株。通過革蘭氏染色、形態(tài)觀察、脫脂乳試管凝固試驗、生理生化指標檢測和16S rDNA基因序列分析, 發(fā)現(xiàn)該株細菌為魏斯氏菌屬成員, 確定為食竇魏斯氏菌YH1。

pH、溫度和NaCl含量是影響細菌生長的重要因素, 探究細菌的生長特性對掌握其最適培養(yǎng)條件具有重要意義。食竇魏斯氏菌 YH1的生長特性研究表明, 其最適培養(yǎng)條件為: pH 7.2—8.4、溫度35°C。向MRS培養(yǎng)基中添加 NaCl, YH1的生長受到抑制, 這一結果與王福強(2005)對于鼠李糖乳桿菌P15的研究結論相同。在探究不同pH值條件下生長情況的實驗中, 食竇魏斯氏菌YH1在初始pH值為4.6—8.8條件下均能生長, 在7.2—8.4條件下生長最好, 且通過測定培養(yǎng)24h后各培養(yǎng)基的酸堿度發(fā)現(xiàn), YH1生長使培養(yǎng)基的pH值明顯下降, 并趨于4.0。YH1在堿性條件下生長的過程中產(chǎn)酸降低了培養(yǎng)基的pH值, 形成了有利的生長環(huán)境, 從而促進了自身的生長; 同時YH1生長的產(chǎn)物又降低了環(huán)境的 pH值, 形成了良性循環(huán)。因此在不同初始pH環(huán)境下, YH1的生長情況趨向一致。

乳酸菌通過競爭營養(yǎng)、附著位點或分泌細菌素等毒素的方式殺死或抑制病原微生物, 有效調(diào)節(jié)魚類胃腸中的菌群平衡, 增強魚體抗感染能力, 提高免疫力和存活率(張艷婷等, 2012)。楊鶯鶯等(2005)以溶藻弧菌和鯊魚弧菌為指示菌探究了乳酸桿菌的抑菌性,結果表明乳酸桿菌及其代謝物質對弧菌具有協(xié)同抑制作用。本研究結果顯示, 食竇魏斯氏菌 YH1的產(chǎn)物不僅能抑制溶藻弧菌、副溶血弧菌、鰻弧菌、哈維氏弧菌、假交替單胞菌、遲鈍愛德華氏菌、嗜水氣單胞菌等革蘭氏陰性病原菌的生長, 也對金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性病原菌的生長有抑制效果。YH1表現(xiàn)出廣譜抑菌活性, 暗 示其能在許氏平 鲉 抵御多種病原菌的過程中發(fā)揮作用, 作為益生菌添加可能提高許氏平 鲉 對抗病原菌侵染的能力。乳酸菌YH1的廣譜抑菌作用為其在海水養(yǎng)殖中的應用提供了前提。

乳酸菌的抑菌作用機理一直都是研究熱點。楊勇(2006)探究了抑制鰻弧菌生長的乳酸菌產(chǎn)物, 推測乳酸菌代謝產(chǎn)物對鰻弧菌的抑制作用是由其中的乳酸或乙酸等有機酸造成的, 而不是乳酸菌素類物質。陳營等(2002)的研究認為乳酸菌的抑菌機制主要是分解糖類產(chǎn)生乳酸, 降低環(huán)境中的 pH值, 抑制其他細菌的生長。本研究在分析食竇魏斯氏菌YH1在不同pH環(huán)境下的生長情況時發(fā)現(xiàn), YH1可顯著降低環(huán)境 pH值, 推測YH1產(chǎn)酸降低環(huán)境pH值可能是其抑制病原指示菌生長的方式之一, 但其抑菌機制還需要進一步的研究。

益生菌是一類對機體健康有益且無致病性的微生物。益生菌的安全性檢測是其投入生產(chǎn)應用前確保其對機體無致病性的必要測試。El-Rhman等(2009)在探究藤黃微球菌和假單胞菌對尼羅羅非魚生長性能和健康的促進作用前先驗證了這兩株細菌在羅非魚機體內(nèi)的安全性。呂利群等(2010)在檢測解淀粉芽孢桿菌 Sh1的動物安全性試驗中指出, 腹腔注射1×108CFU/mL的 Shl對草魚的生長沒有任何不良影響。Kim 等(2006)將從虹鱒腸道分離出的Carnobacterium maltaromaticum B26菌株和廣布肉桿菌Carnobacterium divergens B33菌株腹腔或肌肉注射魚體或者投喂含二菌株的飼料均無毒性。本研究中動物安全性檢測實驗表明, 腹腔或肌肉注射1×108CFU/mL的食竇魏斯氏菌YH1 對許氏平 鲉 無毒性。本研究為下一步探究食竇魏斯氏菌 YH1對許氏平 鲉 生長和免疫的影響提供了理論依據(jù), 為其應用于生產(chǎn)提供了可能性。

4 結論

本研究分析了食竇魏斯氏菌 YH1的生長條件,證實了其廣譜抑菌性和動物安全性, 顯示了該菌作為有益菌用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的潛力, 為乳酸菌微生態(tài)制劑的開發(fā)及其在許氏平 鲉 養(yǎng)殖業(yè)的應用奠定了理論基礎。

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