李海峰， 耿 爽， 金 鑫， 戢 爽， 吳 健， 夏廣軍*

(1.延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133000；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學院畜牧分院，吉林 四平 136100)

肌內(nèi)脂肪是影響牛肉品質(zhì)的重要因素之一，不僅影響牛肉的色澤和風味，而且對肉品質(zhì)本身來說，肌內(nèi)脂肪和脂肪酸的組分及含量都直接影響肉品的品質(zhì)和營養(yǎng)價值[1]。肌內(nèi)脂肪是沉積在某塊肌肉內(nèi)的肌纖維與肌束間的脂肪[2]。但在測定上有較大難度且有較大的誤差，因此可以利用生物技術(shù)手段控制脂肪生成和使其沉積的基因，并應用于傳統(tǒng)育種工作中，最終得到理想的肉牛群體，即基因的標記輔助選擇(MAS)，目前標記輔助選擇已成為研究的熱點，已初步確定了部分候選基因，如固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)。

SREBP(Sterol regulatory element binding factor)是1993年從體外培養(yǎng)人的Hela細胞核抽提純化出來，是一類含有“堿性螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈”結(jié)構(gòu)的核轉(zhuǎn)錄因子。SREBP1作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族成員之一，有其特有的性質(zhì)[3]。SREBP基因家族作為轉(zhuǎn)錄因子，在哺乳動物體內(nèi)調(diào)控膽固醇和其它脂類的生物合成和轉(zhuǎn)運機制，由于自身的保守性，在哺乳動物和線蟲體內(nèi)參與脂肪調(diào)控的途徑都基本一致[4-6]。近些年來有很多人對SREBP1基因進行檢測，郝軍等[7]人通過靶細胞來抑制人腎小管上皮細胞SREBP1基因的表達水平，從而發(fā)現(xiàn)SREBP1基因表達沉默能夠明顯抑制人腎小管上皮細胞內(nèi)脂肪酸合成酶的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，并且細胞內(nèi)脂滴也會明顯減少，說明SREBP1基因有控制細胞脂肪酸合成的作用。Shimano等[8]人通過敲除小鼠的SREBP1基因研究發(fā)現(xiàn)，眾多與脂肪生成相關(guān)基因的mRNA表達水平非常低，例如：脂肪酸合成酶基因(FASN)、乙酰輔酶A羧化酶基因(ACC)、硬脂酰輔酶A去飽和酶基因(SCD1)等。延邊黃牛作為中國黃牛5大優(yōu)良品種之一，為優(yōu)質(zhì)牛肉生產(chǎn)做出很大貢獻[9]，該試驗旨在研究SREBP1基因的多態(tài)性與延邊黃牛肌內(nèi)脂肪酸組成的相關(guān)性，從而可以為優(yōu)質(zhì)延邊黃牛的個體選育提供科學而準確的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗群體來自琿春市吉興牧業(yè)有限公司29頭相同月齡的延邊黃牛育肥牛，在相同飼養(yǎng)條件下育肥至30月齡后統(tǒng)一屠宰。肉樣采自延邊黃牛眼肌(牛體12～13肋間背最長肌)，每頭牛頸靜脈采血25 mL，ACD抗凝，低溫快速運回實驗室，分裝后保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

按照Promega公司Genoic DNA Purification Kit說明書方法抽提。

1.2.2 引物設計

參考Hoashi[10]發(fā)表的引物序列，對SREBP1基因的第5內(nèi)含子區(qū)進行擴增(表1)。

表1 PCR擴增引物

1.2.3 PCR擴增

采用PCR方法對所選個體進行擴增及基因型檢測。PCR反應體系：為25 μL，ddH2O 17.9 μL，10×PCR Buffer(15 mmol/L的Mg2+)2.5 μL，dNTPs(2 mmol/L)2 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各0.6 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.4 μL，DNA模板(100 mg/L)1 μL。

PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，最佳退火溫度63.9 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30～35次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存[11～12]。

該片段由于特殊的缺失或插入突變，所以可以直接通過3%的瓊脂糖凝膠電泳進行分型。最后分為3種基因型，A型(插入型，432 bp)、B型(缺失型，348 bp)和AB型(雜合型)。

1.2.4 脂肪酸含量測定

取背最長肌樣品2 g 凍干，然后用Agilent Technologies 7890A GC分析脂肪酸含量。

色譜條件：色譜柱，Supelco SP-2560：100 m×250 μm×0.2 μm；檢測器，F(xiàn)ID；程序升溫，起始溫度130 ℃，保持3 min，運行5 min，速率4 ℃/min，至240 ℃，保持35 min，運行50 min；進樣口溫度240 ℃；FID 溫度250 ℃。

1.2.5 統(tǒng)計分析

應用Excel軟件計算基因型頻率和等位基因頻率，進行χ2檢驗，分析多態(tài)位點是否偏離了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。利用SPSS 19.0軟件，對延邊黃牛SREBP1基因的遺傳多態(tài)性與肌內(nèi)脂肪酸組成的相關(guān)性進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 延邊黃牛SREBP1基因型檢測

延邊黃牛SREBP1基因的第5內(nèi)含子內(nèi)84 bp缺失或插入突變，致使不同基因型的PCR產(chǎn)物之間產(chǎn)生84 bp長度的差異，由此得到的PCR產(chǎn)物，可以直接根據(jù)其片段長度的差異判斷出基因型。經(jīng)檢測，該位點存在3種基因型，即AA基因型、AB基因型、BB基因型(圖1)。

M：DL2000 DNA 分子標準；1～3：AA型；4：AB型；5：BB型

2.2 延邊黃牛SREBP1基因型和等位基因頻率的分布

SREBP1基因的第5內(nèi)含子84 bp缺失突變的基因型和等位基因頻率的分布及多態(tài)性指標見表2。AA、AB、BB 3種基因型頻率分別為0.759、0.172和0.069；A、B等位基因頻率分別為0.845和0.155，多態(tài)信息含量(PIC)為0.359，表現(xiàn)為中度多態(tài)，而且處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。

表2 延邊黃牛SREBP1等位基因與基因型頻率

2.3 SREBP1基因多態(tài)性與肌內(nèi)脂肪酸組成的相關(guān)性分析

SREBP1基因的第5內(nèi)含子84 bp缺失突變的多態(tài)性與延邊黃牛肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)分析見表3。

由表3可知，SREBP1基因的第5內(nèi)含子內(nèi)84 bp缺失或插入突變與肌內(nèi)脂肪酸組成顯著相關(guān)，AB型個體的月桂酸(C12∶0)、棕櫚油酸(C16∶1)、硬脂酸(C18∶0)、亞油酸(C18∶2)含量顯著高于AA型個體(P<0.05)，由于在試驗群體中BB基因型的個體只有2頭，因此，沒有對BB型個體進行深入分析。

表3 SREBP1基因多態(tài)性與肌內(nèi)脂肪含量的相關(guān)性性狀

注：*為差異顯著(P<0.05)。

3 討論與結(jié)論

SREBP1 是細胞內(nèi)調(diào)控脂類代謝的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，主要調(diào)控膽固醇和脂肪酸合成中關(guān)鍵酶基因的表達，調(diào)節(jié)脂質(zhì)新生[13]。SREBP1的作用主要包括調(diào)控脂肪細胞的分化，以及類固醇和脂肪酸的合成過程。SREBP1基因可以直接調(diào)節(jié)脂肪沉積，還可參與脂肪生成相關(guān)基因的表達水平的調(diào)控[14]。除此之外，SREBP1信號轉(zhuǎn)導途徑在脂肪代謝性疾病研究中起著重要的作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)SREBP1基因的多態(tài)性與肌內(nèi)脂肪酸組成顯著相關(guān)，SREBP1基因與月桂酸(C12∶0)、棕櫚酸(C16∶1)、硬脂酸(C18∶0)、亞油酸(C18∶2)有顯著相關(guān)性(P<0.05)。χ2檢驗結(jié)果顯示，延邊黃牛群體處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)，說明遺傳漂變及品種的選育等因素并未對SREBP1基因造成影響。而多態(tài)信息含量處于中度多態(tài)，說明延邊黃牛具有一定的選育潛力。徐麗[16]關(guān)于SREBP1 基因與西門塔爾牛肌內(nèi)脂肪含量關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，SREBP1基因第 5 內(nèi)含子 84 bp indel 與棕櫚油酸、硬脂酸、SFA和甘油三酯及C16脂肪酸不飽和指數(shù)顯著相關(guān)，其中，LL型個體棕櫚油酸、甘油三酯和16碳脂肪酸不飽和指數(shù)均高于LS型個體，而硬脂酸和SFA低于LS個體(P<0.05)。先前已有報道發(fā)現(xiàn)，SREBP1基因有可能會影響肌內(nèi)脂肪酸組成，攜帶A等位基因(AA基因型和AB基因型)的個體比BB基因型個體的大理石花紋評分等級要高。有學者利用不同的群體也得到了相似的結(jié)果[17-18]。

試驗結(jié)果表現(xiàn)出較少的BB基因型，與Hoashi等在2007年發(fā)現(xiàn)和牛中SREBP1基因第5內(nèi)含子內(nèi)84 bp插入缺失多態(tài)性分布較均勻(AA 0.759，AB 0.172，BB 0.069)這一結(jié)果不符，可能是品種不同所致[10]。日本和牛與其他牛品種相比，需要經(jīng)過長時間的育肥飼養(yǎng)，才能夠得到理想的大理石花紋，從而滿足肌內(nèi)脂肪含量的要求；而且和牛經(jīng)過長期選育，成為了肌內(nèi)脂肪含量較高的新品種，所以和牛的SREBP1基因頻率也可能為此而改變。而在2009年Bhuiyan等[19]人的研究報道中，BB基因型在利木贊牛(n=36)中頻率為0.22、安格斯牛(n=34)中頻率為0.00、西門塔爾牛(n=49)中頻率為0.00、婆羅門牛(n=20)中頻率為0.05、紅吉牛(n=49)中頻率為0.01和韓牛(n=88)中頻率為0.08。隨后Barton等人在檢測了370頭弗萊維赫牛(Fleckvieh)后發(fā)現(xiàn)，BB基因型為0.04，這與本試驗結(jié)果相符合?？傊⒉皇撬械呐Ｆ贩N都有SREBP1基因的第5內(nèi)含子84 bp缺失突變，但Hoashi等的研究中BB基因型頻率較高，可能是由于長期對牛進行人工選擇而形成的，而Bhuiyan等的研究中發(fā)現(xiàn)，安格斯牛及西門塔爾牛中并沒有BB基因型，而本試驗檢測到了BB基因型，這可能是牛品種不同或者其試驗群體數(shù)量較少等原因，要研究SREBP1基因的具體功能還需要進行進一步的擴大群體規(guī)模試驗。

延邊黃牛與其他牛群體相比也存在SREBP1基因的第5內(nèi)含子84 bp缺失突變的多態(tài)性，延邊黃牛群體處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。SREBP1基因的第5內(nèi)含子84 bp缺失突變的多態(tài)性與肌內(nèi)脂肪酸組成顯著相關(guān)。

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