（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300）

1 前言

豬繁殖障礙與呼吸道綜合征，簡(jiǎn)稱(chēng)為PRRS，也可以稱(chēng)之為藍(lán)耳病，發(fā)病后，往往會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱、食欲減退、遲產(chǎn)、死產(chǎn)以及木乃伊胎等，如果是仔豬患病的話(huà)，往往會(huì)伴有明顯的呼吸道癥狀，從而導(dǎo)致死亡。如果能夠快速做出診斷，進(jìn)而采取恰當(dāng)措施進(jìn)行治療的話(huà)，往往會(huì)取得理想的效果。由此可見(jiàn)，關(guān)于“RTPCR檢測(cè)豬繁殖障礙與呼吸道綜合征病毒方法的建立與應(yīng)用”的研究與分析顯得尤為重要。

2 關(guān)于RT-PCR檢測(cè)豬繁殖障礙與呼吸道綜合征病毒方法建立與應(yīng)用的研究與分析

2.1 概述

對(duì)于這種疾病，最為關(guān)鍵的就是要能夠快速做出診斷，這也是能否有效防治這種疾病的關(guān)鍵所在。PCR技術(shù)的原理在于通過(guò)對(duì)體內(nèi)DNA的復(fù)制過(guò)程，實(shí)現(xiàn)基因的體外擴(kuò)增，而檢測(cè)迅速、特異性強(qiáng)、敏感性好、操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)量理想等都是最為顯著的特點(diǎn)，相對(duì)于傳統(tǒng)的方法，這種檢測(cè)方法更加迅速、直觀(guān)。

2.2 具體方法

2.2.1 材料

所需要用到的材料主要就是酶類(lèi)及其制劑以及相關(guān)的儀器設(shè)備等。

2.2.2 方法

方法主要包括引物的設(shè)計(jì)、病毒核酸的提取以及合成、反應(yīng)條件范圍的確定和產(chǎn)物的確定等。

第一就是引物的設(shè)計(jì)，主要是要考慮到PCR的實(shí)際要求，設(shè)計(jì)檢測(cè)PRRSV引物，并將其進(jìn)行定名，分貝是上游引物和下游引物。

第二步就是提取病毒核酸，主要包括血液樣品的提取、組織樣品RNA的提取以及公豬精液樣品RNA的提取。

第三步就是PRRSV病毒cDNA的合成，具體來(lái)說(shuō)就是首先要完成試劑的配制，操作是在PCR管中完成的；緊接著就是在70℃的條件下，在PCR儀器中進(jìn)行保溫處理，處理的時(shí)間大約是10min，之后就要迅速進(jìn)行急冷處理，時(shí)間大約兩分鐘；第三個(gè)步驟就是講上述已經(jīng)制成的液體混合均勻后，進(jìn)行離心處理，主要目的就是為了讓混合液能夠在管底聚集；第四個(gè)步驟就是配制反應(yīng)液，同樣是需要在PCR管中完成的。在配制的實(shí)際過(guò)程中，需要注意的是，配制一定要在冰盒上進(jìn)行，而且需要佩戴一次性手套，以免造成酶污染。

第四步就是建立PRRSV的RT-PCR方法，在這個(gè)步驟中，PCR的擴(kuò)增程序可以簡(jiǎn)單概括為：在94℃的條件下預(yù)變性，時(shí)間為五分鐘；在94℃的條件下，變性，時(shí)間為30s；在59℃的條件下進(jìn)行退火操作，時(shí)間為30s；在72℃的條件下進(jìn)行延伸處理，時(shí)間是30s；之后就是33個(gè)循環(huán)；在72℃的條件下進(jìn)行延伸處理，時(shí)間是5min。等到循環(huán)完成了之后，將PCR的產(chǎn)物5提取出來(lái)，用濃度是1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳處理，對(duì)擴(kuò)增的結(jié)果進(jìn)行觀(guān)察。

第五步就是反應(yīng)條件范圍的群定，主要是引物的濃度確定、dNTPs濃度的確定、RTaq酶濃度的確定以及被檢測(cè)樣品質(zhì)量對(duì)RT-PCR檢測(cè)的影響以RT-PCR退火溫度的確定以及模板量的確定等。

第六步就是對(duì)RT-PCR的產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，鑒定的過(guò)程主要主要是分為以下幾個(gè)步驟，分別是PCR產(chǎn)物的電泳與回收純化處理；PCR產(chǎn)物的連接以及轉(zhuǎn)化、搖菌、質(zhì)粒的提取和酶切的鑒定，等到上述工作完成之后，進(jìn)行測(cè)序處理。

2.3 關(guān)于結(jié)果

2.3.1 引物

這個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的主要目的就是為了設(shè)計(jì)出PRRSV檢測(cè)引物，然后分別在兩端進(jìn)行限制性酶切位點(diǎn)的添加。

2.3.2 RT-PCR反應(yīng)條件范圍的確定

第一，關(guān)于引物的濃度，對(duì)于PRRSV來(lái)說(shuō)，RT-PCR反應(yīng)最為適宜的引物添加量應(yīng)該是0.5μl。

第二，就是要確定dNTPs的濃度，對(duì)于PRRSV來(lái)說(shuō)，RT-PCR反應(yīng)最為適宜的dNTPs添加量是1μl。

第三，就是要確定R Taq酶濃度，對(duì)于PRRSV來(lái)說(shuō)，RT-PCR反應(yīng)最為適宜的R Taq添加量是0.5μl。

第四，關(guān)于被檢測(cè)樣片質(zhì)量對(duì)RT-PCR檢測(cè)的影響，通過(guò)這個(gè)實(shí)驗(yàn)，對(duì)陳舊的被檢測(cè)樣品和新鮮的被檢測(cè)樣品在RT-PCR檢測(cè)中的差異進(jìn)行分析，得到如下結(jié)論，相對(duì)于新鮮的被檢測(cè)樣品而言，從陳舊的被檢測(cè)樣品中提出獲得的RNA更容易降解，而且電泳的效果也比較差。這就是說(shuō)，無(wú)論是在進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)方法建立的實(shí)驗(yàn)中，還是在實(shí)際的應(yīng)用過(guò)程中，都要確保被檢測(cè)樣品的新鮮，從而保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確率。

第五，確定單相RT-PCR的退火溫度，我們以PRRSV為例子進(jìn)行說(shuō)明，分別在53℃、55℃和59℃的退火溫度下進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，59℃的退火溫度條件下，PCR產(chǎn)物的特異性更加理想。

2.3.3 鑒定RT-PCR產(chǎn)物

通過(guò)目的片段與PMD-18T的連接、轉(zhuǎn)化、涂板和挑菌四管，提取質(zhì)粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四個(gè)質(zhì)粒都有酶切目的片段370bp，可以任選一管送去測(cè)序，對(duì)于測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)之后完全符合。

3 結(jié)語(yǔ)

豬繁殖障礙與呼吸道綜合征不僅僅會(huì)對(duì)免疫系統(tǒng)造成侵害，而且所導(dǎo)致的感染也是持續(xù)性的，再加上預(yù)防起來(lái)比較困難，因此這種疾病逐漸成為制約養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要因素。雖然目前關(guān)于這種疾病已經(jīng)研究出了多種檢測(cè)和診斷的技術(shù)，但是相對(duì)于間接免疫熒光、原位雜交以及免疫組化等，RT-PCR檢測(cè)技術(shù)更加省時(shí)，操作更加簡(jiǎn)單，結(jié)果更加準(zhǔn)確，因此也就更加值得推廣。

[1] 涂宜強(qiáng)，楊增歧，徐輝.RT—PCR檢測(cè)豬繁殖障礙與呼吸道綜合征病毒方法的建立與應(yīng)用[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2005，32（6）：52-53.