吳 晶， 王娟娟， 朱騰義， 惠 珊， 劉玲玲， 錢曉晴

(揚(yáng)州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225100)

水稻在我國(guó)糧食生產(chǎn)中占據(jù)著非常重要的地位。水稻高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培技術(shù)研究受到廣泛關(guān)注，且取得了顯著進(jìn)展。水稻土壤肥力與稻米的品質(zhì)和產(chǎn)量有著不可分割的關(guān)系，過(guò)去為了追求高產(chǎn)，盲目增施化肥農(nóng)藥，導(dǎo)致肥效下降，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本也不斷攀升，并直接導(dǎo)致稻田土壤理化性質(zhì)和生態(tài)環(huán)境惡化，制約了稻田土壤可持續(xù)生產(chǎn)能力[1]。土壤中化肥農(nóng)藥的施入，會(huì)使得土壤微生物的生存繁殖環(huán)境發(fā)生改變，進(jìn)一步影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和土壤生態(tài)系統(tǒng)。土壤微生物分布廣、數(shù)量大、種類多，在土壤系統(tǒng)中占據(jù)著重要地位。它們參與土壤有機(jī)質(zhì)分解、腐殖質(zhì)合成，是土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和循環(huán)的動(dòng)力，可維持土壤系統(tǒng)的穩(wěn)定性及抗干擾能力，對(duì)保持土壤健康和農(nóng)業(yè)可持續(xù)生產(chǎn)起著重要作用[2-3]。土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定與土壤微生物多樣性有著密不可分的關(guān)系，一般來(lái)說(shuō)，土壤微生物多樣性越高越有利于土壤功能和生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定[4]。

當(dāng)前，越來(lái)越多的研究學(xué)者將水稻田地上部分植物農(nóng)業(yè)性狀改良的單一研究擴(kuò)展到地下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、功能的分析研究[5]，通過(guò)弄清水稻田養(yǎng)分供應(yīng)特征及機(jī)制，掌握土壤微生物調(diào)控技術(shù)，提高土壤肥力和生產(chǎn)力，維護(hù)和保障稻田土壤生態(tài)功能和生態(tài)系統(tǒng)健康，為我國(guó)水稻高產(chǎn)高效栽培技術(shù)的完整性和可持續(xù)利用提供理論支持。

1 水稻生長(zhǎng)過(guò)程土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的動(dòng)態(tài)特征

水稻生長(zhǎng)過(guò)程中，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。一方面，土壤微生物通過(guò)改變植物根系生理特征和根際環(huán)境，直接影響植物獲得養(yǎng)分的能力，例如Jetiyanon等在泰國(guó)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，接種菌株RS87的根際促生菌能夠替代水稻化肥50%的肥料施用量并能維持水稻產(chǎn)量[6]；另一方面，土壤微生物參與了非根際土壤的養(yǎng)分循環(huán)，包括養(yǎng)分生物固定和礦化分解、硝化和反硝化等過(guò)程[7]。氮在水稻生產(chǎn)中是最重要的營(yíng)養(yǎng)元素，通過(guò)提高氮素利用率，可以減少過(guò)量氮肥施用造成的負(fù)面環(huán)境效應(yīng)。作為水稻產(chǎn)量提升的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)力，與稻田氮素循環(huán)有關(guān)的微生物過(guò)程研究一直受到相當(dāng)程度的關(guān)注。

氮循環(huán)中與土壤微生物直接關(guān)聯(lián)的有生物固氮、氮礦化、硝化和反硝化等過(guò)程。大氣中的氮?dú)獠荒苤苯颖恢参镂?，須要被合成氨后才能被植物吸收。能被植物吸收的是在土壤中被礦化成的小分子氮或氨，多種土壤微生物參與氮礦化這一過(guò)程的調(diào)控[8]。在硝化過(guò)程中，氨氧化微生物負(fù)責(zé)將氨氧化為亞硝酸鹽[9]。已有研究表明，氨氧化細(xì)菌 (ammonia oxidizing bacteria，AOB) 、氨氧化古菌 (ammonia oxidizing archaea，AOA)是硝化、反硝化過(guò)程中的重要功能微生物[10]，土壤中氮素的轉(zhuǎn)化與其種群結(jié)構(gòu)、豐度等因素相關(guān)[11-14]。這些微生物和土壤酶參與調(diào)節(jié)土壤氮轉(zhuǎn)化的生物化學(xué)過(guò)程，使得水稻在對(duì)氮素吸收利用時(shí)產(chǎn)生影響[15-16]。宋亞娜等利用PCR-DGGE、 DNA測(cè)序、熒光定量PCR等分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)福建省紅壤稻田不同生育期內(nèi)土壤氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌的群落結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行探究，研究表明氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在生長(zhǎng)期中的變化程度不大，在苗期-分蘗期和孕穗期-成熟期2個(gè)階段間存在一定差異，而氨氧化古菌群落結(jié)構(gòu)變化明顯，不同的生育期均存在一定差異，隨著水稻生長(zhǎng)發(fā)育土壤氨氧化古菌群落多樣性逐漸提高，孕穗期達(dá)到較高水平后變化平穩(wěn)，且稻田土壤AOA數(shù)量比AOB更多，與土壤硝化勢(shì)相關(guān)性也更高[17-18]。

2 不同施肥措施對(duì)水稻土壤微生物多樣性的影響

施肥是提高作物產(chǎn)量的重要農(nóng)業(yè)措施之一，施肥方式的不同會(huì)進(jìn)一步影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和微生物生物量[19-20]。與此同時(shí)，土壤微生物參與養(yǎng)分的活化、轉(zhuǎn)化和運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程，一定程度上改變地上植物的生產(chǎn)力和養(yǎng)分利用率[21]。特別是對(duì)水稻土而言，其特有淹水種植還原環(huán)境下，不同施肥措施對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響研究不夠透徹[22]。

大量長(zhǎng)期定位試驗(yàn)結(jié)果顯示，有機(jī)肥、無(wú)機(jī)肥配施可以影響土壤的理化性質(zhì)，改善土壤結(jié)構(gòu)，土壤微生物數(shù)量和結(jié)構(gòu)因此會(huì)發(fā)生改變[23]。裴雪霞等采用PCR-DGGE方法對(duì)黃棕壤性水稻土進(jìn)行試驗(yàn)研究，結(jié)果表明，長(zhǎng)期施肥能提高水稻土微生物生物量碳氮含量，并改變土壤中氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)[24]。Xun等研究發(fā)現(xiàn)，將部分化肥替換成豬糞或牛糞有機(jī)肥可以改善土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，提高土壤養(yǎng)分的有效性，并能增加土壤微生物生物量[25]。同樣，趙軍等利用454焦磷酸測(cè)序法對(duì)施用豬糞有機(jī)肥的影響進(jìn)行研究，得出了一致的結(jié)果[26]。

氮素營(yíng)養(yǎng)是水稻產(chǎn)量和養(yǎng)分吸收的重要因素，植物的氮素利用一方面依靠氮攝入，另一方面如果碳源不足也會(huì)影響氮效率。水稻為了應(yīng)對(duì)根外銨態(tài)氮養(yǎng)分水平的變化，自身調(diào)節(jié)碳氮代謝水平，這表明保持碳氮平衡是水稻氮素利用效率須要考慮的因素[27]。農(nóng)作物秸稈是我國(guó)重要的農(nóng)業(yè)廢棄物資源，其中含有大量有機(jī)質(zhì)、氮、磷、鉀及中量、微量元素養(yǎng)分等，秸稈還田后逐漸腐解，向土壤中輸入的秸稈碳促進(jìn)了土壤有機(jī)質(zhì)增加、微生物活性增強(qiáng)，改善了土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，提高土壤肥力[28-30]。劉驊等研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期秸稈還田能提高土壤微生物多樣性及酶活性，并能有效調(diào)節(jié)土壤養(yǎng)分指標(biāo)[31]。Doran研究表明，秸稈還田可使土壤中細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量增加2～6倍，硝化和反硝化細(xì)菌數(shù)量增加更多[32-33]。Ocio等研究發(fā)現(xiàn)，在施加秸稈后7 d，土壤微生物生物量變?yōu)樵鹊?倍[34]。羅希茜等通過(guò)長(zhǎng)期定位試驗(yàn)，采用了Biolog測(cè)試板分析發(fā)現(xiàn)，秸稈還田有利于維持微生物物種的數(shù)量及多樣性，但群落均勻度會(huì)有所降低，這可能是由于長(zhǎng)期秸稈還田促進(jìn)了某些微生物種群的生長(zhǎng)代謝[35]。韓新忠等通過(guò)大田試驗(yàn)研究不同小麥秸稈還田量對(duì)水稻生長(zhǎng)、土壤微生物量及酶活性的影響，結(jié)果表明，50%秸稈還田處理增產(chǎn)效果最顯著，由于土壤肥力的長(zhǎng)期效應(yīng)及土壤微生物生理代謝影響的復(fù)雜性，合理秸稈還田量的選擇還須長(zhǎng)期定位試驗(yàn)研究[36]。

綠肥是用綠色植物體制成的肥料，綠肥作物生長(zhǎng)較快，適應(yīng)性能力強(qiáng)，有機(jī)質(zhì)含量豐富，能改善土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，是一種優(yōu)質(zhì)生物肥料[37-39]。例如，豆科的紫云英作為稻田主要綠肥作物之一，種植翻壓后改善土壤物理環(huán)境，提升土壤肥力，土壤微生物活性和多樣性增加[40-41]。高嵩涓基于長(zhǎng)期雙季稻-冬綠肥定位試驗(yàn)，應(yīng)用熒光定量PCR、高通量測(cè)序等技術(shù)，研究顯示，長(zhǎng)期綠肥種植會(huì)改變硝化作用和反硝化作用的部分基因功能菌和其他功能菌屬的群落功能[42]。楊曾平等在對(duì)26年冬種不同綠肥的紅壤性水稻土研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期冬種綠肥翻壓處理的水稻土中微生物種群數(shù)量、微生物生物量碳氮含量、土壤酶活性有所提高，冬種效果最明顯的植物是紫云英[37，43]。

3 不同栽培措施對(duì)水稻土壤微生物多樣性的影響

土壤微生物多樣性受多種因素影響，人類對(duì)土地和作物的管理也會(huì)使得其發(fā)生改變[44]。合理的栽培措施不僅能促進(jìn)稻田生態(tài)系統(tǒng)的良性發(fā)展，而且可以提高作物產(chǎn)量和資源利用率。土壤微生物對(duì)不同栽培措施的響應(yīng)較為敏感，土壤理化性質(zhì)和微生物生長(zhǎng)繁殖條件等變化均會(huì)影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能[45-46]。

作物連作后土壤環(huán)境會(huì)發(fā)生變化，土壤中有益的細(xì)菌、放線菌數(shù)量減少，土壤從細(xì)菌型向真菌型轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致病原微生物富集，土壤微生物多樣性水平降低，加重土傳病害的發(fā)生，最終表現(xiàn)為連作障礙[46]。而輪作措施中種植作物及殘茬會(huì)增強(qiáng)土壤中微生物活性，增加有益微生物。在耕作過(guò)程中，對(duì)土壤投入的能源物質(zhì)增多，則微生物數(shù)量會(huì)增加，對(duì)作物增產(chǎn)是有幫助的。張立成等通過(guò)長(zhǎng)期定位試驗(yàn)對(duì)稻—稻—油菜輪作土壤與稻—稻連作土壤比較后發(fā)現(xiàn)，輪作土壤顯著提高土壤微生物豐富度指數(shù)，據(jù)此分析稻—稻—油菜輪作栽培中這2種作物從土壤中吸收的養(yǎng)分不同，可以減少作物對(duì)土壤中同種元素吸收，避免出現(xiàn)單一養(yǎng)分貧乏的情況，更有利于土壤養(yǎng)分平衡和維持土壤微生物種群多樣性[47]。

目前，我國(guó)農(nóng)田耕地方式主要有傳統(tǒng)耕作(翻耕、深松耕)、少耕(淺耕、旋耕)和免耕(留茬、留茬覆蓋等)。國(guó)外的保護(hù)性耕作研究主要以覆蓋休閑式免耕和少耕模式為主，由于復(fù)種指數(shù)低加上一些除草成本，這種耕作方式國(guó)內(nèi)并不適用。張磊等對(duì)經(jīng)過(guò)10年半旱式免耕定位試驗(yàn)的水稻土進(jìn)行研究，結(jié)果表明實(shí)行壟作免耕法和廂作免耕的稻田土上層微生物生物量在水稻整個(gè)生育期內(nèi)穩(wěn)中有升[48]。陳冬林等研究在不同耕作方式下秸稈還田量對(duì)水稻土壤微生物的影響，結(jié)果表明土壤耕作有利于晚稻生育前期與后期土壤微生物活性的提高，耕翻使土壤中真菌、嫌氣性細(xì)菌數(shù)量減少[49]。秸稈深耕還田技術(shù)是將深耕和秸稈還田方式相結(jié)合，通過(guò)這種技術(shù)，使得土壤層頻繁擾動(dòng)，通氣性增加，微生物與秸稈等有機(jī)質(zhì)接觸面積增大，營(yíng)養(yǎng)源的豐富促進(jìn)了微生物生長(zhǎng)，提高了土壤酶活性[50]。趙亞麗等研究發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)耕作相比，深耕+秸稈還田處理土壤微生物數(shù)量、土壤酶活性分別提高了45.9%、34.1%[51]。

4 水稻土壤微生物多樣性的主要研究方法

傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法是將土壤中可培養(yǎng)微生物采用不同營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)，但有些微生物實(shí)驗(yàn)室條件下不可被培養(yǎng)，擴(kuò)大了生長(zhǎng)繁殖快的微生物數(shù)量[52-54]。另一種Biolog微平板法是通過(guò)測(cè)定土壤微生物對(duì)不同單一碳源的利用與代謝能力差異，用于評(píng)價(jià)土壤微生物群落多樣性。蔚霞運(yùn)用Biolog ECO微平板對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因水稻在淹水條件秸稈還田后對(duì)土壤微生物功能多樣性的影響進(jìn)行研究，其研究結(jié)果[55]與前人結(jié)果[56-57]存在部分差異，這可能與培養(yǎng)環(huán)境、水稻品種、選擇的微平板類型等因素相關(guān)，故建議其他方法與Biolog微平板法結(jié)合使用，以便得到更全面的結(jié)果[58]。

2005年以來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)飛躍式發(fā)展，已經(jīng)成為主流的分子生態(tài)學(xué)研究手段，可識(shí)別微生物資源和功能的程度由1%提高到30%左右，這為揭示養(yǎng)分循環(huán)的土壤生物功能和區(qū)域分異規(guī)律提供了契機(jī)[21]。微生物多樣性測(cè)序(別稱擴(kuò)增自測(cè)序)是利用2/3代測(cè)序平臺(tái)，對(duì)16S rDNA/18S rDNA/ITS/功能基因等特定區(qū)段PCR產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序，突破傳統(tǒng)微生物不可培養(yǎng)的缺點(diǎn)，獲得環(huán)境樣本中微生物群落結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系以及微生物與環(huán)境相關(guān)性等信息。穩(wěn)定性同位素核酸探針(DNA/RNA-based Stable Isotope probing，DNA/RNA-SIP)技術(shù)通過(guò)穩(wěn)定性同位素示蹤微生物DNA/RNA，能在分子水平上研究關(guān)鍵元素的微生物調(diào)控機(jī)制[59]。鄭燕等利用穩(wěn)定性同位素核酸探針技術(shù)對(duì)6種典型水稻土中的微生物甲烷氧化過(guò)程進(jìn)行研究，有效地克服將復(fù)雜土壤環(huán)境中甲烷氧化過(guò)程及其微生物作用直接偶聯(lián)的技術(shù)難點(diǎn)[60]。郭赟利用穩(wěn)定性同位素示蹤技術(shù)結(jié)合454高通量測(cè)序，研究了長(zhǎng)期施肥對(duì)活躍的AOA和AOB的影響[61]。

為了驗(yàn)證后期結(jié)果(或目標(biāo)基因)，熒光定量PCR技術(shù)是用于驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果是否可靠的常規(guī)方法之一。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過(guò)熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)控，最后未知的模板根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析的方法[62]。賈仲君等對(duì)典型水稻土微生物組的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行研究，結(jié)果表明，傳統(tǒng)顯微計(jì)數(shù)結(jié)果顯著低于qPCR技術(shù)，最高可達(dá)3個(gè)數(shù)量級(jí)[63]。劉瓊等選取4種典型稻田土壤進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)，選擇用qPCR、克隆測(cè)序以及末端限制性長(zhǎng)度多態(tài)性分析(T-RFLP)技術(shù)對(duì)參與卡爾文循環(huán)基因cbbL和cbbM的豐度和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究[64]。不論是傳統(tǒng)顯微技術(shù)方法還是現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，應(yīng)該根據(jù)對(duì)象需求和各項(xiàng)技術(shù)優(yōu)勢(shì)，合理選擇研究技術(shù)方法，為土壤微生物演化規(guī)律和環(huán)境功能提供技術(shù)支撐。

5 展望

調(diào)控土壤微生物為主的管理措施將是未來(lái)研究高產(chǎn)高效農(nóng)業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)，水稻作為我國(guó)主要的糧食作物，其發(fā)展若僅僅以“高產(chǎn)”為目的，其生產(chǎn)措施將不可持續(xù)。隨著人們對(duì)土壤微生物認(rèn)知的加深，更加重視和農(nóng)學(xué)領(lǐng)域的融合，未來(lái)會(huì)有良好的發(fā)展前景。目前對(duì)水稻土壤微生物的研究還有許多問(wèn)題尚未解決。因此，建議進(jìn)一步加強(qiáng)以下幾個(gè)方面的研究：

(1)很多關(guān)于水稻土壤微生物的研究往往針對(duì)生長(zhǎng)期中某一時(shí)期的土壤，對(duì)水稻整個(gè)生育期土壤微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較綜合分析的研究較少。水稻的生長(zhǎng)發(fā)育是在一個(gè)與土壤、微生物相互作用的環(huán)境系統(tǒng)下進(jìn)行的，水稻發(fā)育勢(shì)必影響稻田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，反之亦然。因此，對(duì)水稻生長(zhǎng)期土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的動(dòng)態(tài)特征研究很有必要，這為探究土壤中某些微生物基因及功能研究奠定理論基礎(chǔ)。

(2)微生物介導(dǎo)的水稻-土壤之間的養(yǎng)分循環(huán)和養(yǎng)分高效利用之間的機(jī)制，目前尚未研究透徹，有些對(duì)稻田土壤微生物的研究停留在對(duì)現(xiàn)象的描述，有待進(jìn)一步探究。

(3)在分析水稻土壤微生物群落結(jié)構(gòu)時(shí)，單一的方法可能會(huì)導(dǎo)致對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的片面解釋，因此應(yīng)該采用多種技術(shù)相結(jié)合的方法。新一代454高通量測(cè)序、環(huán)境基因組學(xué)與SIP技術(shù)的結(jié)合與綜合應(yīng)用將成為熱點(diǎn)。

(4)水稻土的取樣對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響很大，很多時(shí)候會(huì)對(duì)土壤濕度、土壤溫度以及可利用殘留物和作物的季節(jié)變化等因素有所忽略，因而對(duì)水稻土微生物取樣標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一是須要關(guān)注的。

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