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        ABO血型基因測(cè)序在正反定型不符血型鑒定中應(yīng)用

        2018-01-20 05:37:47徐晶
        關(guān)鍵詞:人源外顯子血型

        徐晶

        ABO血型系統(tǒng)是臨床輸血領(lǐng)域最為重要的一個(gè)血型系統(tǒng),由于等位基因在遺傳過(guò)程中伴隨的突變現(xiàn)象,導(dǎo)致了所表達(dá)血型抗原的復(fù)雜性和多樣性,呈現(xiàn)出多種變異的型別[1-3]。ABO血型鑒定傳統(tǒng)的血清學(xué)方法包括正反定型試驗(yàn)、吸收放散試驗(yàn)和唾液血型物質(zhì)中和抑制試驗(yàn),近年來(lái)基因?qū)W方法在ABO疑難血型中應(yīng)用得到廣泛重視。本實(shí)驗(yàn)室采用血清學(xué)方法和基因測(cè)序法對(duì)ABO血型正反定型不符病例1例進(jìn)行血型鑒定,現(xiàn)報(bào)告如下。

        1 材料與方法

        1.1 患者資料 某患者,男,13歲,因右肘骨折后伴細(xì)菌感染入院,欲行手術(shù)治療。術(shù)前備血時(shí),發(fā)現(xiàn)其ABO血型正定型A型,反定型為AB型。既往體健,無(wú)輸血史。為明確血型,遂將其血樣標(biāo)本送至我科做進(jìn)一步鑒定。

        1.2 試劑 單克隆抗-A、抗-B(批號(hào)20150101)、抗-AB血 清 (批 號(hào) 446000)、 抗-H (批 號(hào)20150616)、ABO 試劑紅細(xì)胞(批號(hào) 20165319)均為上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司生產(chǎn);人源抗-B血清 (本室自制);DNA抽提試劑盒(PROMEGA,USA),PCR 產(chǎn) 物 純 化 試 劑 盒 (MILLIPORE,Ireland),BigDye Terminator v3.1 循 環(huán) 測(cè) 序 試 劑 盒(Applied Biosystems,USA),ABI9700 型 PCR 儀(美國(guó)Applied Biosystems公司);凝膠電泳儀(Bio-Rad公司),ABI3130XL基因測(cè)序分析儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)。

        1.3 血型血清學(xué)實(shí)驗(yàn) 患者的ABO血型正、反定型采用試管法進(jìn)行;不規(guī)則抗體篩選實(shí)驗(yàn)分別采用鹽水介質(zhì)、聚凝胺介質(zhì)、抗人球蛋白介質(zhì)中進(jìn)行;采用人源血清進(jìn)行吸收實(shí)驗(yàn)、采用熱放散對(duì)吸收人源血清的紅細(xì)胞進(jìn)行放散;唾液血型物質(zhì)檢測(cè)采用中和抑制試驗(yàn)。所有操作按美國(guó)血庫(kù)協(xié)會(huì)操作手冊(cè)進(jìn)行[4]。

        1.4 基因組DNA提取 用DNA提取試劑盒抽提患者血樣標(biāo)本的基因組DNA,所有操作均嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行。

        1.5 擴(kuò)增ABO基因外顯子6、7和直接測(cè)序 參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行[5]。

        2 結(jié)果

        2.1 血清學(xué)實(shí)驗(yàn) 患者的ABO血型正定型為A型,反定型為AB型。4℃增強(qiáng)后,反定型B細(xì)胞出現(xiàn)2+的凝集,與抗H反應(yīng)室溫出現(xiàn)2+的凝集反應(yīng),4℃增強(qiáng)后為3+(表1);唾液中檢出A、H血型物質(zhì);吸收放散實(shí)驗(yàn)表明患者紅細(xì)胞可吸收放散人源抗-A。

        2.2 ABO基因第6、7外顯子測(cè)序 測(cè)序結(jié)果顯示,外顯子6 c.261G未發(fā)生缺失,c.297A未發(fā)生點(diǎn)突變,外顯子7存在c.467C>A的雜合點(diǎn)突變(圖1)。

        3 討論

        自Yamamato F等[6]克隆出ABO基因的cDNA序列以來(lái),ABO血型的鑒定除了常規(guī)血清學(xué)方法外,逐步有了分子生物學(xué)方法作為補(bǔ)充,截止目前,在人類血型基因突變庫(kù)記載的等位基因已經(jīng)達(dá)到了380個(gè)[7],這充分說(shuō)明了ABO等位基因豐富的多態(tài)性。等位基因序列多態(tài)性的存在,導(dǎo)致了ABO血型抗原表達(dá)的差異,最終表現(xiàn)為各種亞型。因此,在常規(guī)血清學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的基礎(chǔ)上,輔以測(cè)序等技術(shù)有利于精準(zhǔn)鑒定ABO亞型。

        圖1 患者ABO基因第外顯子6和7測(cè)序結(jié)果

        本結(jié)果中,患者的血清學(xué)正、反定型不相符,正定型為A型,反定型則為AB型。唾液中檢出A、H血型物質(zhì);吸收放散實(shí)驗(yàn)表明患者紅細(xì)胞可吸收放散人源抗-A。綜合分析其血清學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,ABO血型應(yīng)當(dāng)定型為A型,伴抗體減弱/消失。

        測(cè)序結(jié)果表明,外顯子6 c.261G未發(fā)生缺失,c.297A未發(fā)生點(diǎn)突變,外顯子7存在c.467C>A的雜合點(diǎn)突變,對(duì)比血型抗原基因突變數(shù)據(jù)庫(kù),該位點(diǎn)為ABO*A102的特異性突變位點(diǎn),可以得出,該患者的基因型為A102/A101,測(cè)序結(jié)果與血清學(xué)綜合分析得出的鑒定結(jié)果相符。

        本病例中,患者基因型對(duì)應(yīng)的抗原表達(dá)沒(méi)有出現(xiàn)異常,但抗體水平出現(xiàn)了異常。曾經(jīng)有國(guó)外學(xué)者報(bào)道過(guò)類似案例[8-10],影響抗體水平表達(dá)的機(jī)制是該突變位點(diǎn)的單獨(dú)作用還是聯(lián)合了別的突變位點(diǎn),則有待進(jìn)一步的研究探索。

        臨床輸血實(shí)踐中,正確的ABO血型鑒定至關(guān)重要。血型鑒定錯(cuò)誤而導(dǎo)致血液誤輸注,則可能發(fā)生嚴(yán)重的輸血反應(yīng)。因此,一旦發(fā)現(xiàn)血清學(xué)定型正、反定型不相符,建議進(jìn)一步完善檢測(cè)方法。包括血清學(xué)中的吸收放散實(shí)驗(yàn)、檢測(cè)血型物質(zhì)的中和抑制實(shí)驗(yàn)等。在有條件的單位,建議進(jìn)行分子生物學(xué)方法的補(bǔ)充,包括PCR-SSP,測(cè)序等途徑,盡量避免血型鑒定錯(cuò)誤的發(fā)生,從而保證輸血安全。

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