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        全自動(dòng)生化分析儀法測定紅細(xì)胞脆性的性能研究及在地中海貧血篩查中的應(yīng)用

        2018-01-20 05:37:36馮志剛梁愛芬雷亞利華仙麗隋洪
        關(guān)鍵詞:光密度方法學(xué)脆性

        馮志剛,梁愛芬,雷亞利,華仙麗,隋洪

        地中海貧血是人類最常見的單基因遺傳病之一,全世界約有1億以上人口攜帶地貧基因[1,2]。我國南方尤其海南、貴州、廣西、云南、廣東、江西等地區(qū)為高發(fā)區(qū)[3-7]。由于地中海貧血基因攜帶者的臨床表型有很高的異質(zhì)性,因此基因診斷才是地中海貧血確診的金標(biāo)準(zhǔn)[8-11]。2012年國家衛(wèi)生計(jì)生委啟動(dòng)實(shí)施地貧防控試點(diǎn)項(xiàng)目,2012年1月至2015年9月,試點(diǎn)地區(qū)共為54.13萬對新婚和計(jì)劃懷孕夫婦免費(fèi)提供地貧篩查和基因檢測。鑒于各地區(qū)技術(shù)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的不平衡性,作為地貧的篩查指標(biāo),紅細(xì)胞參數(shù)、紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)、血紅蛋白電泳等簡便經(jīng)濟(jì)的實(shí)驗(yàn)室檢測項(xiàng)目,仍發(fā)揮著其不可或缺的作用[12-18]。市面上在售的紅細(xì)胞脆性檢測試劑盒(自動(dòng)生化分析儀法)數(shù)量不多,且提供的多為通用參數(shù),未指定儀器型號。本文使用武漢市長立生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的紅細(xì)胞脆性(EFT)測定試劑盒(直接比色法)結(jié)合SIEMENS公司的ADVIA 2400生化分析儀,建立了一種操作簡便、準(zhǔn)確快速、成本低廉,且可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析的地貧篩查方法,研究其方法學(xué)參數(shù)并驗(yàn)證臨床性能,供廣大的臨床實(shí)驗(yàn)室同行和臨床醫(yī)生參考。

        1 材料與方法

        1.1 儀器和試劑 ⑴SIEMENS公司生產(chǎn)的ADVIA 2400全自動(dòng)生化分析儀。武漢市長立生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的紅細(xì)胞脆性 (EFT)測定試劑盒(直接比色法),注冊證編號鄂械注準(zhǔn)20142401475,組成自動(dòng)生化分析儀檢測法,通過檢測反應(yīng)體系中紅細(xì)胞懸液的濁度變化來計(jì)算溶血百分比。⑵上海精密科學(xué)儀器有限公司棱光722N可見分光光度計(jì),配套廣州市米基醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)的紅細(xì)胞滲透脆性檢測試劑盒(一管法),粵食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2013第2400503號,組成手工法溶血百分比檢測法,通過檢測反應(yīng)體系中游離血紅蛋白的光密度變化來計(jì)算溶血百分比。

        1.2 自動(dòng)生化分析儀檢測法參數(shù)優(yōu)化

        1.2.1 波長的選擇 ADVIA2400生化分析儀為光柵后分光,可以提供 340nm,410nm,451nm,478nm,505nm,545nm,571nm,596nm,658nm,694nm,751nm,805nm,845nm,884nm等14個(gè)波長的數(shù)據(jù),根據(jù)反應(yīng)原理,分別用生理鹽水和長立試劑中的溶血?jiǎng)┳饔糜谙嗤康娜?,測定不同波長下的光密度系列值,選擇濁度變化明顯而血紅蛋白光密度背景低的波長作為檢測波長。

        1.2.2 樣本體積分?jǐn)?shù)的確定 為了降低透光率讀數(shù)誤差的影響,固定試劑體積為100μl,樣本為40μl全血加入到960μl生理鹽水中制備成上機(jī)檢測紅細(xì)胞懸液,在方法學(xué)參數(shù)設(shè)置界面依次設(shè)定樣本量 14μl、7μl、3.5μl,并分別對應(yīng)增加生化分析儀機(jī)內(nèi)生理鹽水樣本稀釋液體積保證反應(yīng)總體積一致,進(jìn)行紅細(xì)胞脆性平行檢測來優(yōu)化加入反應(yīng)杯中的稀釋樣本量。

        1.3 方法學(xué)性能

        1.3.1 重復(fù)性 在確定自動(dòng)生化分析儀檢測紅細(xì)胞脆性試驗(yàn)參數(shù)后,選擇正常與病理標(biāo)本各1份,分別重復(fù)測定紅細(xì)胞脆性各10次,計(jì)算均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù),評估批內(nèi)精密度,與試劑說明書中廠商聲明標(biāo)準(zhǔn)比較。

        1.3.2 方法學(xué)比對 收集2016年4月我院門診、住院患者靜脈血標(biāo)本共計(jì)99例,其中病例組14例(經(jīng)深圳益生堂生物企業(yè)有限公司地中海貧血基因檢測試劑盒檢測基因型確診), 年齡 27.2±8.3歲;對照組 85 例,年齡 25.8±10.4 歲。

        使用廣州陽普醫(yī)療科技股份有限公司生產(chǎn)的EDTA·K2管抗凝真空采血管,抽取靜脈血2ml,收到標(biāo)本后保存在2~8℃冰箱,分別使用武漢長立和廣州米基方法24h內(nèi)檢測。計(jì)算出溶血百分比數(shù)值分別與兩者試劑說明書參考區(qū)間比較,判斷脆性試驗(yàn)陰陽性,并以基因型為準(zhǔn)的臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)。

        1.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和分析,定量資料的比較使用t檢驗(yàn),定性資料的比較使用卡方檢驗(yàn),一致性檢驗(yàn)使用Kappa檢驗(yàn)。

        2 結(jié)果

        2.1 波長的選擇 從ADVIA 2400全自動(dòng)生化分析儀獲得原始光密度數(shù)據(jù),比較不同波長處紅細(xì)胞懸液、游離血紅蛋白溶液光密度。340nm,410nm,451nm,478nm,505nm,545nm,571nm,596nm,658nm,694nm,751nm,805nm,845nm,884nm 處紅細(xì)胞懸液 的 光 密 度 依 次 為 1.26734,1.73038,1.249 15,1.12029,1.08021,1.19975,1.02064,0.97956,0.97159,0.95745,0.95100,0.94740,0.94309,0.9421 1;游離血紅蛋白溶液的光密度依次為0.87212,2.62122,0.48450,0.24424,0.18837,0.401 93,0.43583,0.05860,0.02476,0.02230,0.02081,0.02067,0.02082,0.02054,將數(shù)據(jù)制成圖 1,可以看出,在596nm波長附近,游離血紅蛋白溶液光密度已遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于紅細(xì)胞懸液的光密度,因此選擇596nm波長作為檢測波長。

        2.2 樣本體積分?jǐn)?shù)的確定 為了降低透光率讀數(shù)誤差的影響,分光光度法檢測技術(shù)一般選擇透光率 0.2~0.7 的讀數(shù)范圍, 已知 ADVIA 2400 的比色杯光徑為0.5cm,表2中顯示的讀數(shù)為標(biāo)化成1cm光徑的讀數(shù),所以選擇表中透光度0.339797對應(yīng)的樣本量7μl。見表2。

        圖1 紅細(xì)胞懸液、游離血紅蛋白溶液的光密度和波長關(guān)系圖

        表2 ADVIA 2400生化分析儀樣本量與反應(yīng)體系光密度透光率

        2.3 批內(nèi)精密度結(jié)果 評估標(biāo)準(zhǔn)為試劑說明書中廠商聲明標(biāo)準(zhǔn),結(jié)論為符合廠商聲明標(biāo)準(zhǔn)。見表3。

        表3 正常與病理標(biāo)本溶血百分比精密度與廠商標(biāo)準(zhǔn)比較

        2.4 兩種方法診斷一致性Kappa檢驗(yàn)結(jié)果 對長立和米基兩種方法的診斷一致性進(jìn)行Kappa檢驗(yàn),Kappa值為0.54,結(jié)論為兩者一致性中等。見表4。

        表4 兩種方法診斷一致性Kappa檢驗(yàn)結(jié)果

        2.5 方法學(xué)的性能指標(biāo) 以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn),兩種方法學(xué)的性能指標(biāo)如表5,可見長立方法的敏感度略高,但特異度低于米基方法。

        3 討論

        正常紅細(xì)胞的形態(tài)為雙凹圓盤形,試驗(yàn)時(shí)置于低滲性氯化鈉溶液中,水分子在細(xì)胞內(nèi)外滲透壓差的條件下進(jìn)入紅細(xì)胞,紅細(xì)胞發(fā)生腫脹甚至破裂而發(fā)生不完全或完全溶血,這種紅細(xì)胞在低滲鹽溶液中出現(xiàn)溶血的特性即紅細(xì)胞滲透脆性。滲透脆性升高可見于遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥、遺傳性橢圓形紅細(xì)胞增多癥、自身免疫性溶血性貧血、阻塞性黃疸等疾病,減低可見于各型珠蛋白生成障礙性貧血、HbC、HbD、HbE血紅蛋白病、缺鐵性貧血、脾切除術(shù)等情況,近年來其臨床應(yīng)用范圍不斷得到拓展[19]。臨床上基于此原理建立和應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)方法有紅細(xì)胞滲透脆性過篩實(shí)驗(yàn)、紅細(xì)胞滲透脆型簡易初篩實(shí)驗(yàn),紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)光電比色法,紅細(xì)胞孵育滲透脆性實(shí)驗(yàn),紅細(xì)胞滲透脆性檢測一管法等,其中以紅細(xì)胞滲透脆性檢測一管法操作較為簡單,在我國南方地中海貧血高發(fā)區(qū)域廣泛的應(yīng)用于該疾病的初篩。隨著實(shí)驗(yàn)室高度自動(dòng)化信息化的發(fā)展,以上多數(shù)方法固有的手工操作,步驟繁瑣,效率偏低,結(jié)果重復(fù)性差的缺點(diǎn)日益凸顯。國內(nèi)有些廠家開發(fā)出應(yīng)用于全自動(dòng)生化分析儀檢測的試劑盒,僅提供少數(shù)品牌和型號生化分析儀的方法學(xué)參數(shù)和性能指標(biāo),且對其實(shí)驗(yàn)原理闡述不深。本文根據(jù)紅細(xì)胞滲透脆性現(xiàn)象的的基本實(shí)驗(yàn)原理,挖掘分析SIEMENSADVIA2400生化分析儀提供的多波長,全反應(yīng)時(shí)間讀點(diǎn)的光學(xué)檢測數(shù)據(jù),優(yōu)化針對該全自動(dòng)生化分析儀的方法學(xué)參數(shù),并對儀器法和手工法的方法學(xué)性能比較做了初步的分析比較。

        表5 兩種結(jié)果與臨床診斷結(jié)果的符合情況

        本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,全自動(dòng)生化分析儀法測定紅細(xì)胞脆性法,高值水平重復(fù)性1.6%,低值水平重復(fù)性3.4%,符合廠商標(biāo)準(zhǔn),接近許多臨床化學(xué)常規(guī)項(xiàng)目。長立法敏感度、特異度分別為85.7%、77.6%,米基法分別為78.6%、94.1%,在臨床應(yīng)用于地中海貧血篩查方面長立法具有一定的優(yōu)勢。潘干華[20]所報(bào)道的兩點(diǎn)比濁法測定紅細(xì)胞脆性半自動(dòng)生化儀法篩查地中海貧血的敏感度、特異度分別為86.3%,95.5%,本文全自動(dòng)生化儀方法在操作上具有較大優(yōu)勢,在靈敏度方面與其相當(dāng),在特異度方面與其尚有差距,分析可能為本文研究對象數(shù)量相對較少,擬在今后的臨床工作中不斷積累相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行更深入的研究。綜上所述,全自動(dòng)生化分析儀法在方法學(xué)性能和臨床性能方面均能滿足地中海貧血篩查的需要,宜在廣大地中海貧血流行地區(qū)大力推廣。

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