馮志剛，梁愛芬，雷亞利，華仙麗，隋洪

地中海貧血是人類最常見的單基因遺傳病之一，全世界約有1億以上人口攜帶地貧基因[1，2]。我國(guó)南方尤其海南、貴州、廣西、云南、廣東、江西等地區(qū)為高發(fā)區(qū)[3-7]。由于地中海貧血基因攜帶者的臨床表型有很高的異質(zhì)性，因此基因診斷才是地中海貧血確診的金標(biāo)準(zhǔn)[8-11]。2012年國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委啟動(dòng)實(shí)施地貧防控試點(diǎn)項(xiàng)目，2012年1月至2015年9月，試點(diǎn)地區(qū)共為54.13萬(wàn)對(duì)新婚和計(jì)劃懷孕夫婦免費(fèi)提供地貧篩查和基因檢測(cè)。鑒于各地區(qū)技術(shù)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的不平衡性，作為地貧的篩查指標(biāo)，紅細(xì)胞參數(shù)、紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)、血紅蛋白電泳等簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)項(xiàng)目，仍發(fā)揮著其不可或缺的作用[12-18]。市面上在售的紅細(xì)胞脆性檢測(cè)試劑盒（自動(dòng)生化分析儀法）數(shù)量不多，且提供的多為通用參數(shù)，未指定儀器型號(hào)。本文使用武漢市長(zhǎng)立生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的紅細(xì)胞脆性(EFT)測(cè)定試劑盒(直接比色法)結(jié)合SIEMENS公司的ADVIA 2400生化分析儀，建立了一種操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確快速、成本低廉，且可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析的地貧篩查方法，研究其方法學(xué)參數(shù)并驗(yàn)證臨床性能，供廣大的臨床實(shí)驗(yàn)室同行和臨床醫(yī)生參考。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 ⑴SIEMENS公司生產(chǎn)的ADVIA 2400全自動(dòng)生化分析儀。武漢市長(zhǎng)立生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的紅細(xì)胞脆性 (EFT)測(cè)定試劑盒(直接比色法)，注冊(cè)證編號(hào)鄂械注準(zhǔn)20142401475，組成自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)法，通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)體系中紅細(xì)胞懸液的濁度變化來(lái)計(jì)算溶血百分比。⑵上海精密科學(xué)儀器有限公司棱光722N可見分光光度計(jì)，配套廣州市米基醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)的紅細(xì)胞滲透脆性檢測(cè)試劑盒(一管法)，粵食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2013第2400503號(hào)，組成手工法溶血百分比檢測(cè)法，通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)體系中游離血紅蛋白的光密度變化來(lái)計(jì)算溶血百分比。

1.2 自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)法參數(shù)優(yōu)化

1.2.1 波長(zhǎng)的選擇 ADVIA2400生化分析儀為光柵后分光，可以提供 340nm，410nm，451nm，478nm，505nm，545nm，571nm，596nm，658nm，694nm，751nm，805nm，845nm，884nm等14個(gè)波長(zhǎng)的數(shù)據(jù)，根據(jù)反應(yīng)原理，分別用生理鹽水和長(zhǎng)立試劑中的溶血?jiǎng)┳饔糜谙嗤康娜瑴y(cè)定不同波長(zhǎng)下的光密度系列值，選擇濁度變化明顯而血紅蛋白光密度背景低的波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.2.2 樣本體積分?jǐn)?shù)的確定 為了降低透光率讀數(shù)誤差的影響，固定試劑體積為100μl，樣本為40μl全血加入到960μl生理鹽水中制備成上機(jī)檢測(cè)紅細(xì)胞懸液，在方法學(xué)參數(shù)設(shè)置界面依次設(shè)定樣本量 14μl、7μl、3.5μl，并分別對(duì)應(yīng)增加生化分析儀機(jī)內(nèi)生理鹽水樣本稀釋液體積保證反應(yīng)總體積一致，進(jìn)行紅細(xì)胞脆性平行檢測(cè)來(lái)優(yōu)化加入反應(yīng)杯中的稀釋樣本量。

1.3 方法學(xué)性能

1.3.1 重復(fù)性 在確定自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)紅細(xì)胞脆性試驗(yàn)參數(shù)后，選擇正常與病理標(biāo)本各1份，分別重復(fù)測(cè)定紅細(xì)胞脆性各10次，計(jì)算均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，評(píng)估批內(nèi)精密度，與試劑說(shuō)明書中廠商聲明標(biāo)準(zhǔn)比較。

1.3.2 方法學(xué)比對(duì) 收集2016年4月我院門診、住院患者靜脈血標(biāo)本共計(jì)99例，其中病例組14例（經(jīng)深圳益生堂生物企業(yè)有限公司地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)基因型確診）， 年齡 27.2±8.3歲；對(duì)照組 85 例，年齡 25.8±10.4 歲。

使用廣州陽(yáng)普醫(yī)療科技股份有限公司生產(chǎn)的EDTA·K2管抗凝真空采血管，抽取靜脈血2ml，收到標(biāo)本后保存在2～8℃冰箱，分別使用武漢長(zhǎng)立和廣州米基方法24h內(nèi)檢測(cè)。計(jì)算出溶血百分比數(shù)值分別與兩者試劑說(shuō)明書參考區(qū)間比較，判斷脆性試驗(yàn)陰陽(yáng)性，并以基因型為準(zhǔn)的臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和分析，定量資料的比較使用t檢驗(yàn)，定性資料的比較使用卡方檢驗(yàn)，一致性檢驗(yàn)使用Kappa檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 波長(zhǎng)的選擇 從ADVIA 2400全自動(dòng)生化分析儀獲得原始光密度數(shù)據(jù)，比較不同波長(zhǎng)處紅細(xì)胞懸液、游離血紅蛋白溶液光密度。340nm，410nm，451nm，478nm，505nm，545nm，571nm，596nm，658nm，694nm，751nm，805nm，845nm，884nm 處紅細(xì)胞懸液 的 光 密 度 依 次 為 1.26734，1.73038，1.249 15，1.12029，1.08021，1.19975，1.02064，0.97956，0.97159，0.95745，0.95100，0.94740，0.94309，0.9421 1；游離血紅蛋白溶液的光密度依次為0.87212，2.62122，0.48450，0.24424，0.18837，0.401 93，0.43583，0.05860，0.02476，0.02230，0.02081，0.02067，0.02082，0.02054，將數(shù)據(jù)制成圖 1，可以看出，在596nm波長(zhǎng)附近，游離血紅蛋白溶液光密度已遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于紅細(xì)胞懸液的光密度，因此選擇596nm波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 樣本體積分?jǐn)?shù)的確定 為了降低透光率讀數(shù)誤差的影響，分光光度法檢測(cè)技術(shù)一般選擇透光率 0.2～0.7 的讀數(shù)范圍， 已知 ADVIA 2400 的比色杯光徑為0.5cm，表2中顯示的讀數(shù)為標(biāo)化成1cm光徑的讀數(shù)，所以選擇表中透光度0.339797對(duì)應(yīng)的樣本量7μl。見表2。

圖1 紅細(xì)胞懸液、游離血紅蛋白溶液的光密度和波長(zhǎng)關(guān)系圖

表2 ADVIA 2400生化分析儀樣本量與反應(yīng)體系光密度透光率

2.3 批內(nèi)精密度結(jié)果 評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)為試劑說(shuō)明書中廠商聲明標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)論為符合廠商聲明標(biāo)準(zhǔn)。見表3。

表3 正常與病理標(biāo)本溶血百分比精密度與廠商標(biāo)準(zhǔn)比較

2.4 兩種方法診斷一致性Kappa檢驗(yàn)結(jié)果 對(duì)長(zhǎng)立和米基兩種方法的診斷一致性進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)，Kappa值為0.54，結(jié)論為兩者一致性中等。見表4。

表4 兩種方法診斷一致性Kappa檢驗(yàn)結(jié)果

2.5 方法學(xué)的性能指標(biāo) 以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，兩種方法學(xué)的性能指標(biāo)如表5，可見長(zhǎng)立方法的敏感度略高，但特異度低于米基方法。

3 討論

正常紅細(xì)胞的形態(tài)為雙凹圓盤形，試驗(yàn)時(shí)置于低滲性氯化鈉溶液中，水分子在細(xì)胞內(nèi)外滲透壓差的條件下進(jìn)入紅細(xì)胞，紅細(xì)胞發(fā)生腫脹甚至破裂而發(fā)生不完全或完全溶血，這種紅細(xì)胞在低滲鹽溶液中出現(xiàn)溶血的特性即紅細(xì)胞滲透脆性。滲透脆性升高可見于遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥、遺傳性橢圓形紅細(xì)胞增多癥、自身免疫性溶血性貧血、阻塞性黃疸等疾病，減低可見于各型珠蛋白生成障礙性貧血、HbC、HbD、HbE血紅蛋白病、缺鐵性貧血、脾切除術(shù)等情況，近年來(lái)其臨床應(yīng)用范圍不斷得到拓展[19]。臨床上基于此原理建立和應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)方法有紅細(xì)胞滲透脆性過(guò)篩實(shí)驗(yàn)、紅細(xì)胞滲透脆型簡(jiǎn)易初篩實(shí)驗(yàn)，紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)光電比色法，紅細(xì)胞孵育滲透脆性實(shí)驗(yàn)，紅細(xì)胞滲透脆性檢測(cè)一管法等，其中以紅細(xì)胞滲透脆性檢測(cè)一管法操作較為簡(jiǎn)單，在我國(guó)南方地中海貧血高發(fā)區(qū)域廣泛的應(yīng)用于該疾病的初篩。隨著實(shí)驗(yàn)室高度自動(dòng)化信息化的發(fā)展，以上多數(shù)方法固有的手工操作，步驟繁瑣，效率偏低，結(jié)果重復(fù)性差的缺點(diǎn)日益凸顯。國(guó)內(nèi)有些廠家開發(fā)出應(yīng)用于全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)的試劑盒，僅提供少數(shù)品牌和型號(hào)生化分析儀的方法學(xué)參數(shù)和性能指標(biāo)，且對(duì)其實(shí)驗(yàn)原理闡述不深。本文根據(jù)紅細(xì)胞滲透脆性現(xiàn)象的的基本實(shí)驗(yàn)原理，挖掘分析SIEMENSADVIA2400生化分析儀提供的多波長(zhǎng)，全反應(yīng)時(shí)間讀點(diǎn)的光學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)，優(yōu)化針對(duì)該全自動(dòng)生化分析儀的方法學(xué)參數(shù)，并對(duì)儀器法和手工法的方法學(xué)性能比較做了初步的分析比較。

表5 兩種結(jié)果與臨床診斷結(jié)果的符合情況

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，全自動(dòng)生化分析儀法測(cè)定紅細(xì)胞脆性法，高值水平重復(fù)性1.6%，低值水平重復(fù)性3.4%，符合廠商標(biāo)準(zhǔn)，接近許多臨床化學(xué)常規(guī)項(xiàng)目。長(zhǎng)立法敏感度、特異度分別為85.7%、77.6%，米基法分別為78.6%、94.1%，在臨床應(yīng)用于地中海貧血篩查方面長(zhǎng)立法具有一定的優(yōu)勢(shì)。潘干華[20]所報(bào)道的兩點(diǎn)比濁法測(cè)定紅細(xì)胞脆性半自動(dòng)生化儀法篩查地中海貧血的敏感度、特異度分別為86.3%，95.5%，本文全自動(dòng)生化儀方法在操作上具有較大優(yōu)勢(shì)，在靈敏度方面與其相當(dāng)，在特異度方面與其尚有差距，分析可能為本文研究對(duì)象數(shù)量相對(duì)較少，擬在今后的臨床工作中不斷積累相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行更深入的研究。綜上所述，全自動(dòng)生化分析儀法在方法學(xué)性能和臨床性能方面均能滿足地中海貧血篩查的需要，宜在廣大地中海貧血流行地區(qū)大力推廣。