黃偉 ，冉飛 ，余楊紅 ，謝玉珍 ，段榮 ，柯江維

手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)是由多種腸道病毒(Enterovirus，EV)引起的，腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A16型(CAl6)是最主要的病原體[1-4]，以發(fā)熱和手、足、口腔、咽部等部位出現(xiàn)皰疹或者潰瘍?yōu)橹饕卣?，是一種兒童常見的全球性傳染病，嚴(yán)重時可引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)并發(fā)癥，甚至導(dǎo)致重癥患兒死亡，其中EV71病毒是重癥手足口病最主要的病原體[5，6]。實(shí)時熒光定量PCR為目前臨床早期診斷實(shí)驗(yàn)室檢測的主要方法[7，8]，其特點(diǎn)不僅檢測快速，而且具有高度靈敏度和高特異性，并且可同時檢測EV71、CA16和腸道病毒通用型，對手足口病腸道病毒病原體檢測實(shí)現(xiàn)全覆蓋[9]。Fang Y等[10]通過mata分析得出，首次就醫(yī)的確診能顯著降低重癥手足口病的風(fēng)險。由此可見，如何提高手足口病實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)的診斷效率，尤其是提高腸道病毒（CoxA16、EV71等）特異性核酸檢測陽性的靈敏度、準(zhǔn)確性，對疾病的治療、預(yù)防和控制有著及其重要的作用。而能否提取出高質(zhì)量的核酸則是實(shí)時熒光定量PCR檢測的關(guān)鍵，提取方法的靈敏度、特異性也將直接關(guān)系到后續(xù)試驗(yàn)的成敗。目前很多公司紛紛推出自己的全核酸自動提取儀器，各種原理的都有，本文將對西安天隆NP968自動核酸提取儀 (磁珠法)和手工法在手足口病腸道病毒咽拭子標(biāo)本前處理的比較，評價納米磁珠核酸自動提取儀在手足口病腸道病毒RNA熒光定量PCR檢測中的應(yīng)用價值，為納米磁珠核酸自動提取儀在手足口病腸道病毒核酸提取中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 96例咽拭子樣本均來源為我院2016年6月份門診手足口病疑似患兒 （根據(jù)衛(wèi)生部《手足口病診療指南（2010 年版）》[11]診斷），發(fā)病年齡0～5歲，性別、體重、營養(yǎng)狀況未統(tǒng)計。

1.2 RNA 提取方法

1.2.1 樣本處理及實(shí)驗(yàn)分組 將生理鹽水2～4ml加入無菌咽拭子管中，振蕩混勻，備用。實(shí)驗(yàn)分為兩個組：⑴核酸提取儀組：加入100μl咽拭子樣本混勻液至天隆核酸提取試劑盒。⑵Trizol提取組：加入100μl咽拭子樣本混勻液至Trizol和氯仿中。

1.2.2 NP968核酸提取儀提取法 天隆 NP968核酸提取儀利用磁珠吸附原理，從病毒樣本中提取手足口病腸道病毒RNA。按照說明書操作，試劑配制、加樣（在96孔板的第1及第7排中分別加入30μl Proteinase K、100μl樣品及 4μl Acryl Carrier），運(yùn)行自動化程序(預(yù)先根據(jù)說明書設(shè)定裂解/結(jié)合/洗滌/洗脫/棄磁珠的時間和反應(yīng)體積及溫度)，自動化程序結(jié)束后將第6及第l2排的洗脫液轉(zhuǎn)移至干凈EP管中。

1.2.3 Trizol提取法 將咽拭子樣本混勻液 100μl加入Trizol和氯仿中，吹打靜置3min，12000r/min離心2min；樣品即分成水樣層、中間層和有機(jī)層，收集水樣層通過SiO2沉淀RNA來還原，離心取沉淀加入75%乙醇液洗滌，離心沉淀，60°C加熱干燥，加入30μl DEPC水混勻，待用。

1.3 實(shí)時熒光 PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系 20μl如下：RNase Inhibitor 1μl，5xReverse Transcriptase Buffer 4μl，OL68-1 Primer 1μl，dNTP Mixture(l0mM each)1μl，MMLV Reverse Transcriptase 1μl，樣品 RNA 1μl，DEPC 水 11μl。

循環(huán)條件設(shè)置如下：40℃ 25min，1個循環(huán)；94℃ 3min，1 個循環(huán)；93℃ 15s，55℃ 45s，40 個循環(huán)。設(shè)置完成后，保存文件，運(yùn)行程序。根據(jù)CT值判定結(jié)果：CT值≥38為陰性，CT值＜35為陽性，35≥CT值＜38為檢測灰區(qū)，亦判定為陽性結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （x±s）表示，采用配對t檢驗(yàn)或兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)。應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，使用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行制圖，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 稀釋法檢測手足口病腸道病毒兩種方法提取的陽性檢出率 我們隨機(jī)抽取96例門診疑似手足口病標(biāo)本，使用兩種方法同時進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NP968核酸提取與手工提取法陽性檢出率二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P>0.05），兩者檢出率見表1；隨后用無菌生理鹽水做103倍稀釋，稀釋后NP968核酸提取儀陽性檢出率更高，有統(tǒng)計學(xué)意義(46.9%vs 39.6%，P=0.016)，見表 2。

表1 兩種方法檢查手足口病的檢出率（n=96）

表2 稀釋后兩種方法的檢測結(jié)果

2.2 比較兩種提取的批內(nèi)精密度及重復(fù)性 從手足口病腸道病毒陽性樣本中各取一份低CT值（強(qiáng)陽性）和高CT值（弱陽性）標(biāo)本，分別用自動核酸提取法和手工法每組連續(xù)測定10次所得結(jié)果經(jīng)兩獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)統(tǒng)計分析批內(nèi)精密度，結(jié)果顯示患兒手足口病腸道病毒在高CT值（弱陽性）組，NP968核酸自動提取較Trizol法提取精密度高，有統(tǒng)計學(xué)意義(36.70±0.17 vs 37.40±0.23，P<0.05)，而低CT值（強(qiáng)陽性）組，二者無明顯差異（21.40±0.16 vs 21.40±0.26，P>0.05），見圖 1A；隨后，從手足口病腸道病毒陽性樣本高CT值（弱陽性）組隨機(jī)抽取10份陽性標(biāo)本，平行重復(fù)做3次計算CT值的平均值，測算兩種提取方法的變異系數(shù)，經(jīng)配對T檢驗(yàn)結(jié)果顯示NP968核酸提取儀法重復(fù)性較手工Trizol提取法好（36.39±0.27 vs 36.68±0.38，CV 0.74%vs 1.04%），見圖 1B。

圖1 兩種提取方法批內(nèi)精密度及重復(fù)性的比較

3 討論

本課題研究表明NP968核酸提儀在手足口病腸道病毒RNA提取陽性檢出率、精密度、重復(fù)性等方面均優(yōu)于Trizol手工法。值得一提的是，本次實(shí)驗(yàn)研究中，我們發(fā)現(xiàn)隨著樣本稀釋倍數(shù)的增加導(dǎo)致手工提取的陰性檢出率增加、陽性檢出率減小，表明全自動核酸提儀靈敏度高于手工提取法，因而全自動核酸提取儀可以為臨床診斷手足口病腸道病毒濃度更低的樣本提供更有價值的幫助；此外，手工提取的陰性檢出率增加還可能是因?yàn)槭止ぬ崛》ê怂崽崛√幚頃r間較長，操作較為煩鎖，周圍環(huán)境中廣泛存在的RNA酶能快速降解病毒RNA，造成標(biāo)本假陰性結(jié)果。

目前，我們沒有進(jìn)行交叉污染率的相關(guān)性研究，雖然全自動核酸提取儀在陽性檢出率、精密度、重復(fù)性方面具有優(yōu)勢，但由于儀器內(nèi)的氣溶膠、儀器程序運(yùn)行錯誤以及儀器中磁力棒的污染是一個值得考慮的問題，這是一個導(dǎo)致對陰性標(biāo)本交叉污染的潛在問題。相比全自動核酸提取儀提取手足口病腸道病毒RNA病毒，傳統(tǒng)手工提取一個潛在的擔(dān)憂是手工提取效果主要依賴檢驗(yàn)技術(shù)人員的技術(shù)嫻熟度。另外，本文對納米磁珠法和Trizol法提取手足口病腸道病毒進(jìn)行對比，納米磁珠法與手工提取法陽性檢出率分別為55.2%和54.2%，其手工提取法陽性檢出率和江西省內(nèi)其他醫(yī)院基本相同[12]。本課題研究未進(jìn)行EV71與CA16病毒分組提取陽性診斷率的比較，我們認(rèn)為全自動核酸提取儀與手工法提取在不同類型的手足口病腸道病毒提取中其靈敏度和特異性有可能存在差異，因此有必要對EV71和CA16兩種病毒提取進(jìn)行方法學(xué)上的進(jìn)一步研究。此外，其他實(shí)際問題如標(biāo)本處理速度、人力成本已有文獻(xiàn)報道[13]，故本實(shí)驗(yàn)室不再進(jìn)行研究分析。

總之，納米磁珠核酸自動提取儀在手足口病腸道病毒核酸提取中的應(yīng)用有利于應(yīng)對手足口病流行季節(jié)或爆發(fā)流行時大批量標(biāo)本的處理，降低勞動強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)手足口病標(biāo)本的高效、快速、準(zhǔn)確地處理。同時，提高實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)水平，保障醫(yī)務(wù)工作者的職業(yè)衛(wèi)生與安全，保障醫(yī)療質(zhì)量和醫(yī)療安全有著極其重要的作用和意義。