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        外源性硫化氫對肝細胞NLRP3炎癥小體的影響*

        2018-01-19 07:01:26王紅鋼孫偉力鐘培育吳東棟王國英李彥章
        中國病理生理雜志 2018年1期
        關(guān)鍵詞:外源性小體肝細胞

        王紅鋼, 孫偉力, 鐘培育, 吳東棟, 王 軍, 蔡 歡, 王國英, 喬 玲, 張 濤, 李彥章

        (1河南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 2河南大學(xué)民生學(xué)院, 河南 開封 475004)

        炎癥小體(inflammasome)是機體免疫系統(tǒng)的組成成分,是一種多蛋白復(fù)合體,可識別病原微生物和內(nèi)源性危險信號,即病原相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式等蛋白復(fù)合物,通過激活半胱氨酸天冬氨酸酶-1(caspase-1),誘導(dǎo)促炎因子白細胞介素-1β和白細胞介素-18成熟和分泌,調(diào)控炎癥反應(yīng),抵抗病原體感染和應(yīng)激損傷,但其過度活化可導(dǎo)致組織器官炎癥損傷[1-2]。其中NLRP3炎癥小體由NOD樣受體家族成員NLRP3、接頭蛋白ASC和pro-caspase-1組成,是目前研究最多最透徹的炎癥小體。已確認NLRP3炎癥小體在很多疾病的炎癥發(fā)生發(fā)展中起重要作用,因此,NLRP3炎癥小體已成為眾多炎癥疾病治療藥物開發(fā)的探索靶點。

        硫化氫(hydrogen sulfide,H2S)是哺乳動物體內(nèi)一種重要的氣體信號分子,在脂代謝和心肌細胞損傷等生理病理過程中起重要作用,其在哺乳動物體內(nèi)以半胱氨酸為底物,在胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase,CSE)、胱硫醚β-合酶(cystathionine β-synthase,CBS)和3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,3-MST)的催化下產(chǎn)生[3-4],具有重要的抗炎作用[5]。目前,H2S在炎癥中的作用已被廣泛研究,但其與NLRP3炎癥小體的關(guān)系鮮見報道,本文用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激人肝細胞L02和SMMC-7721建立炎癥模型,用硫氫化鈉(sodium hydrosulfide hydrate,NaHS)釋放外源性H2S施加干預(yù)來研究H2S對NLRP3炎癥小體的影響,以期為研發(fā)NLRP3炎癥小體靶向的抗炎藥物提供理論依據(jù)。

        材 料 和 方 法

        1 實驗材料

        L02細胞和SMMC-7721細胞購自上海紀寧實業(yè);DMEM和胎牛血清購自Gibco;脫脂奶粉購自北京鼎國生物公司。

        2 實驗方法

        2.1細胞分組 將細胞分為4組:對照(control)組、LPS組、LPS+NaHS組和NaHS組。對照組用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)18.5 h;LPS組用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)0.5 h后,再用LPS(100 μg/L)刺激18 h;LPS+NaHS組用NaHS(200 μmol/L)刺激0.5 h后,再用LPS刺激18 h;NaHS組用NaHS(200 μmol/L)刺激0.5 h后,再用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h。

        2.2MTT法檢測不同濃度LPS對兩種肝細胞細胞活力的影響 將肝細胞以1×107/L的濃度接種于96孔板中,每孔0.2 mL,每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔,周邊孔不加液體以去除邊緣效應(yīng),培養(yǎng)24 h后將培養(yǎng)液換為含不同濃度(0、100、200、500和1 000 μg/L)LPS的培養(yǎng)基誘導(dǎo)肝細胞18 h后,每孔加入5 g/L的MTT溶液 20 μL,培養(yǎng)4 h后棄掉培養(yǎng)液,每孔加入150 μL DMSO振蕩5 min,然后在酶標儀上測定570 nm處的吸光度(A)值,細胞活力(%)=(處理組A值/對照組A值)×100%。重復(fù)上述實驗3次。

        2.3Western blot實驗 棄去6孔板中的培養(yǎng)基,用冷的PBS清洗細胞3遍,然后每孔加入200 μL RIPA裂解液,混勻后室溫靜置10 min,然后將細胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中,在冰上振蕩裂解5 min,然后12 000×g、4 ℃離心,將上清轉(zhuǎn)移至另一個新的1.5 mL的離心管中,按照BCA試劑盒說明檢測蛋白濃度。檢測后的蛋白樣品經(jīng)變性處理后用于SDS-PAGE。電泳結(jié)束后將膠放在轉(zhuǎn)膜液中平衡10 min,然后組裝成“三明治”的形式,100 V、轉(zhuǎn)膜45~60 min,完成后取出PVDF膜,用TBS清洗10~15 min。 I 抗(NLRP3和caspase-1)用含有脫脂奶粉的TBST稀釋(1∶1 000),加至PVDF膜室溫孵育2 h,然后用TBST緩沖液洗PVDF膜3次,每次10 min,再加入HRP標記 II抗(1∶1 000稀釋)室溫孵育2 h,然后用TBST緩沖液洗PVDF膜3次,每次10 min,加入顯色液照相保存結(jié)果。

        3 統(tǒng)計學(xué)處理

        采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,采用t檢驗分析兩組均數(shù)間的差異,采用單因素方差分析檢驗多組均數(shù)間的差異,以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        結(jié) 果

        1 不同濃度LPS對細胞活力的影響

        為確定建立炎癥模型所用LPS是否對細胞活力有影響,本實驗用不同濃度的LPS分別刺激L02細胞和SMMC-7721細胞18 h后,用MTT法檢測細胞活力。結(jié)果顯示,與對照組(0 μg/L LPS)相比,濃度100~500 μg/L 的LPS對2種肝細胞均無毒性作用,見圖1。

        2 不同濃度LPS對胞內(nèi)NLRP3炎癥小體表達的影響

        為檢測LPS的促炎效果,本實驗用不同濃度的LPS刺激L02細胞和SMMC-7721細胞18 h后,用Western blot 檢測NLRP3炎癥小體的表達。結(jié)果顯示,與對照組相比,用濃度為100 μg/L的LPS刺激細胞,NLRP3和caspase-1在兩種細胞中的表達均明顯增強(P<0.05),見圖2、3。綜合以上的實驗結(jié)果,本實驗選擇LPS的濃度為100 μg/L。

        Figure 1. MTT assay was used to measure the effect of LPS at different concentrations on the viability of SMMC-7721 cells and L02 cells. Mean±SD.n=3.△P<0.05vs0 μg/L.

        圖1不同濃度LPS對SMMC-7721細胞和L02細胞活力的影響

        Figure 2. Western blot was used to determine the effect of LPS at different concentrations on the protein expression of NLRP3 and caspase-1 in L02 cells. Mean±SD.n=3.△P<0.05vs0 μg/L.

        圖2Westernblot檢測不同濃度LPS對L02細胞NLRP3和caspase-1蛋白水平的影響

        Figure 3. Western blot was used to determine the effect of LPS at different concentrations on the protein expression of NLRP3 and caspase-1 in SMMC-7721 cells. Mean±SD.n=3.△P<0.05vs0 μg/L

        圖3Westernblot檢測不同濃度LPS對SMMC-7721細胞NLRP3和caspase-1蛋白水平的影響

        3 外源性H2S對細胞中NLRP3炎癥小體的影響

        本實驗用NaHS作為H2S的釋放劑,Western blot結(jié)果顯示,與對照相比,LPS組的NLRP3和caspase-1表達明顯增高,而LPS+NaHS組中的NLRP3和caspase-1表達比LPS組明顯降低(P<0.05),見圖4、5。

        Figure 4. Western blot was used to determine the effect of exogenous H2S on the expression of NLRP3 inflammasome in SMMC-7721 cells. Mean±SD.n=3.△P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsLPS group.

        圖4外源性H2S對SMMC-7721細胞中炎癥小體NLRP3蛋白表達的影響

        Figure 5. Western blot was used to determine the effect of exogenous H2S on the expression of NLRP3 inflammasome in L02 cells. Mean±SD.n=3.△P< 0.05vscontrol group;*P<0.05vsLPS group.

        圖5外源性H2S對L02細胞中炎癥小體NLRP3表達的影響

        討 論

        LPS是革蘭氏陰性菌表達的內(nèi)毒素,可識別Toll樣受體4,激活炎癥信號通路,上調(diào)NLRP3炎癥小體的表達[6-7]。采用LPS刺激產(chǎn)生炎癥是常見的建立炎癥模型的方法,本文MTT結(jié)果顯示低濃度的LPS可不明顯地升高肝細胞活力,但高劑量的LPS會對細胞活力有顯著抑制作用,綜合Western blot結(jié)果確定后續(xù)實驗所用LPS濃度為100 μg/L。

        H2S是哺乳動物體內(nèi)繼一氧化氮和一氧化碳之后被發(fā)現(xiàn)的第3種氣體信號分子,以前一直被認為是有毒氣體,但近年來研究發(fā)現(xiàn),H2S具有重要的抗炎作用。研究表明,給予外源性H2S可明顯改善缺血引起的心肌炎癥損傷,減少炎癥介質(zhì)的釋放[8-9],外源性H2S還可抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠原代心肌細胞炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[10],通過抗炎作用減輕缺血再灌注引起的胃黏膜細胞損傷[11]。雖然近年來有關(guān)H2S的研究很多,但在人肝細胞中,關(guān)于H2S與NLRP3炎癥小體的研究還鮮見報道。近年來研究表明,NLRP3在肝炎過程中發(fā)揮重要作用,用半乳糖神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)野生型小鼠和NLRP3敲除小鼠建立炎癥模型,結(jié)果顯示在NLRP3敲除小鼠中,肝細胞中的IL-6 和TNF-α等炎癥介質(zhì)以及血漿中的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶比野生小鼠顯著減少[12],持續(xù)的乙型肝炎病毒感染可抑制肝細胞中NLRP3炎癥小體的表達,加重肝臟損傷[13]。本文在L02細胞和SMMC-7721細胞炎癥模型的基礎(chǔ)上研究H2S對胞中NLRP3炎癥小體的影響,結(jié)果顯示給予外源性H2S后,細胞中炎癥小體NLRP3和caspase-1表達均顯著減弱,初步證明外源性H2S可抑制人肝細胞中LPS誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的表達,說明H2S具有作為抗炎藥物的潛在價值,本實驗是一系列研究的起始,H2S是否顯著降低炎癥小體NLRP3活化之后的下游產(chǎn)物水平?H2S是通過何種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制炎癥小體NLRP3表達的?這一系列問題還有待后續(xù)進一步研究,若上述問題被解決,有望為H2S相關(guān)藥物的研發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

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