王紅鋼， 孫偉力， 鐘培育， 吳東棟， 王 軍， 蔡 歡， 王國英， 喬 玲， 張 濤， 李彥章

(1河南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 2河南大學(xué)民生學(xué)院， 河南 開封 475004)

炎癥小體(inflammasome)是機體免疫系統(tǒng)的組成成分,是一種多蛋白復(fù)合體，可識別病原微生物和內(nèi)源性危險信號，即病原相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式等蛋白復(fù)合物，通過激活半胱氨酸天冬氨酸酶-1(caspase-1)，誘導(dǎo)促炎因子白細胞介素-1β和白細胞介素-18成熟和分泌，調(diào)控炎癥反應(yīng)，抵抗病原體感染和應(yīng)激損傷，但其過度活化可導(dǎo)致組織器官炎癥損傷[1-2]。其中NLRP3炎癥小體由NOD樣受體家族成員NLRP3、接頭蛋白ASC和pro-caspase-1組成，是目前研究最多最透徹的炎癥小體。已確認NLRP3炎癥小體在很多疾病的炎癥發(fā)生發(fā)展中起重要作用，因此，NLRP3炎癥小體已成為眾多炎癥疾病治療藥物開發(fā)的探索靶點。

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是哺乳動物體內(nèi)一種重要的氣體信號分子，在脂代謝和心肌細胞損傷等生理病理過程中起重要作用，其在哺乳動物體內(nèi)以半胱氨酸為底物，在胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase，CSE)、胱硫醚β-合酶(cystathionine β-synthase，CBS)和3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3-MST)的催化下產(chǎn)生[3-4]，具有重要的抗炎作用[5]。目前，H2S在炎癥中的作用已被廣泛研究，但其與NLRP3炎癥小體的關(guān)系鮮見報道，本文用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激人肝細胞L02和SMMC-7721建立炎癥模型，用硫氫化鈉(sodium hydrosulfide hydrate，NaHS)釋放外源性H2S施加干預(yù)來研究H2S對NLRP3炎癥小體的影響，以期為研發(fā)NLRP3炎癥小體靶向的抗炎藥物提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

L02細胞和SMMC-7721細胞購自上海紀寧實業(yè)；DMEM和胎牛血清購自Gibco；脫脂奶粉購自北京鼎國生物公司。

2 實驗方法

2.1細胞分組 將細胞分為4組：對照(control)組、LPS組、LPS+NaHS組和NaHS組。對照組用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)18.5 h；LPS組用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)0.5 h后，再用LPS(100 μg/L)刺激18 h；LPS+NaHS組用NaHS(200 μmol/L)刺激0.5 h后，再用LPS刺激18 h；NaHS組用NaHS(200 μmol/L)刺激0.5 h后，再用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h。

2.2MTT法檢測不同濃度LPS對兩種肝細胞細胞活力的影響 將肝細胞以1×107/L的濃度接種于96孔板中，每孔0.2 mL，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，周邊孔不加液體以去除邊緣效應(yīng)，培養(yǎng)24 h后將培養(yǎng)液換為含不同濃度(0、100、200、500和1 000 μg/L)LPS的培養(yǎng)基誘導(dǎo)肝細胞18 h后，每孔加入5 g/L的MTT溶液 20 μL，培養(yǎng)4 h后棄掉培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO振蕩5 min，然后在酶標儀上測定570 nm處的吸光度(A)值，細胞活力(%)=(處理組A值/對照組A值)×100%。重復(fù)上述實驗3次。

2.3Western blot實驗 棄去6孔板中的培養(yǎng)基，用冷的PBS清洗細胞3遍，然后每孔加入200 μL RIPA裂解液，混勻后室溫靜置10 min，然后將細胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中，在冰上振蕩裂解5 min，然后12 000×g、4 ℃離心，將上清轉(zhuǎn)移至另一個新的1.5 mL的離心管中，按照BCA試劑盒說明檢測蛋白濃度。檢測后的蛋白樣品經(jīng)變性處理后用于SDS-PAGE。電泳結(jié)束后將膠放在轉(zhuǎn)膜液中平衡10 min，然后組裝成“三明治”的形式，100 V、轉(zhuǎn)膜45～60 min，完成后取出PVDF膜，用TBS清洗10～15 min。 I 抗(NLRP3和caspase-1)用含有脫脂奶粉的TBST稀釋(1∶1 000)，加至PVDF膜室溫孵育2 h，然后用TBST緩沖液洗PVDF膜3次，每次10 min，再加入HRP標記 II抗(1∶1 000稀釋)室溫孵育2 h，然后用TBST緩沖液洗PVDF膜3次，每次10 min，加入顯色液照相保存結(jié)果。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用t檢驗分析兩組均數(shù)間的差異，采用單因素方差分析檢驗多組均數(shù)間的差異，以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同濃度LPS對細胞活力的影響

為確定建立炎癥模型所用LPS是否對細胞活力有影響，本實驗用不同濃度的LPS分別刺激L02細胞和SMMC-7721細胞18 h后，用MTT法檢測細胞活力。結(jié)果顯示，與對照組(0 μg/L LPS)相比，濃度100～500 μg/L 的LPS對2種肝細胞均無毒性作用，見圖1。

2 不同濃度LPS對胞內(nèi)NLRP3炎癥小體表達的影響

為檢測LPS的促炎效果，本實驗用不同濃度的LPS刺激L02細胞和SMMC-7721細胞18 h后，用Western blot 檢測NLRP3炎癥小體的表達。結(jié)果顯示，與對照組相比，用濃度為100 μg/L的LPS刺激細胞，NLRP3和caspase-1在兩種細胞中的表達均明顯增強(P<0.05)，見圖2、3。綜合以上的實驗結(jié)果，本實驗選擇LPS的濃度為100 μg/L。

Figure 1. MTT assay was used to measure the effect of LPS at different concentrations on the viability of SMMC-7721 cells and L02 cells. Mean±SD.n=3.△P<0.05vs0 μg/L.

圖1不同濃度LPS對SMMC-7721細胞和L02細胞活力的影響

Figure 2. Western blot was used to determine the effect of LPS at different concentrations on the protein expression of NLRP3 and caspase-1 in L02 cells. Mean±SD.n=3.△P<0.05vs0 μg/L.

圖2Westernblot檢測不同濃度LPS對L02細胞NLRP3和caspase-1蛋白水平的影響

Figure 3. Western blot was used to determine the effect of LPS at different concentrations on the protein expression of NLRP3 and caspase-1 in SMMC-7721 cells. Mean±SD.n=3.△P<0.05vs0 μg/L

圖3Westernblot檢測不同濃度LPS對SMMC-7721細胞NLRP3和caspase-1蛋白水平的影響

3 外源性H2S對細胞中NLRP3炎癥小體的影響

本實驗用NaHS作為H2S的釋放劑，Western blot結(jié)果顯示，與對照相比，LPS組的NLRP3和caspase-1表達明顯增高，而LPS+NaHS組中的NLRP3和caspase-1表達比LPS組明顯降低(P<0.05)，見圖4、5。

Figure 4. Western blot was used to determine the effect of exogenous H2S on the expression of NLRP3 inflammasome in SMMC-7721 cells. Mean±SD.n=3.△P<0.05vscontrol group；*P<0.05vsLPS group.

圖4外源性H2S對SMMC-7721細胞中炎癥小體NLRP3蛋白表達的影響

Figure 5. Western blot was used to determine the effect of exogenous H2S on the expression of NLRP3 inflammasome in L02 cells. Mean±SD.n=3.△P< 0.05vscontrol group;*P<0.05vsLPS group.

圖5外源性H2S對L02細胞中炎癥小體NLRP3表達的影響

討 論

LPS是革蘭氏陰性菌表達的內(nèi)毒素，可識別Toll樣受體4，激活炎癥信號通路，上調(diào)NLRP3炎癥小體的表達[6-7]。采用LPS刺激產(chǎn)生炎癥是常見的建立炎癥模型的方法，本文MTT結(jié)果顯示低濃度的LPS可不明顯地升高肝細胞活力，但高劑量的LPS會對細胞活力有顯著抑制作用，綜合Western blot結(jié)果確定后續(xù)實驗所用LPS濃度為100 μg/L。

H2S是哺乳動物體內(nèi)繼一氧化氮和一氧化碳之后被發(fā)現(xiàn)的第3種氣體信號分子，以前一直被認為是有毒氣體，但近年來研究發(fā)現(xiàn)，H2S具有重要的抗炎作用。研究表明，給予外源性H2S可明顯改善缺血引起的心肌炎癥損傷，減少炎癥介質(zhì)的釋放[8-9]，外源性H2S還可抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠原代心肌細胞炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[10]，通過抗炎作用減輕缺血再灌注引起的胃黏膜細胞損傷[11]。雖然近年來有關(guān)H2S的研究很多，但在人肝細胞中，關(guān)于H2S與NLRP3炎癥小體的研究還鮮見報道。近年來研究表明，NLRP3在肝炎過程中發(fā)揮重要作用，用半乳糖神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)野生型小鼠和NLRP3敲除小鼠建立炎癥模型，結(jié)果顯示在NLRP3敲除小鼠中，肝細胞中的IL-6 和TNF-α等炎癥介質(zhì)以及血漿中的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶比野生小鼠顯著減少[12]，持續(xù)的乙型肝炎病毒感染可抑制肝細胞中NLRP3炎癥小體的表達，加重肝臟損傷[13]。本文在L02細胞和SMMC-7721細胞炎癥模型的基礎(chǔ)上研究H2S對胞中NLRP3炎癥小體的影響，結(jié)果顯示給予外源性H2S后，細胞中炎癥小體NLRP3和caspase-1表達均顯著減弱，初步證明外源性H2S可抑制人肝細胞中LPS誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的表達，說明H2S具有作為抗炎藥物的潛在價值，本實驗是一系列研究的起始，H2S是否顯著降低炎癥小體NLRP3活化之后的下游產(chǎn)物水平？H2S是通過何種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制炎癥小體NLRP3表達的？這一系列問題還有待后續(xù)進一步研究，若上述問題被解決，有望為H2S相關(guān)藥物的研發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

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