謝 靖， 梁華峰， 祁 鳴， 高惠春， 鄭 璽

(1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)科， 新疆 石河子 832008； 2新疆阜康市人民醫(yī)院神經(jīng)科， 新疆 阜康 831500； 3解放軍第四七四醫(yī)院神經(jīng)科， 新疆 烏魯木齊 830000)

在人口老齡化趨勢愈加明顯的今天，腦血管疾病的患病率也呈現(xiàn)上升趨勢，其中， 腦卒中致死已成為我國居民第一死因，且其致殘率和復(fù)發(fā)率一直高居不下[1]。腦組織缺血損傷后機(jī)體自身可代償性啟動(dòng)血管生成反應(yīng)，建立側(cè)支循環(huán)以改善缺血區(qū)周圍的血流供應(yīng)，為修復(fù)神經(jīng)損傷提供良好的微環(huán)境[2-4]，故如何促進(jìn)缺血后腦組織的血管新生已成為腦卒中后期康復(fù)治療的新靶點(diǎn)。隨著中醫(yī)藥科學(xué)的發(fā)展，近年來關(guān)于中藥和針灸等干預(yù)手段治療缺血后血管新生的研究已得到廣泛的關(guān)注，應(yīng)用前景十分廣闊。

人參皂苷RH2(ginsenoside RH2，GS-RH2)是由紅參中提取出的稀有單體皂苷，歸屬于達(dá)瑪烷(dammarane)原人參二醇型皂苷(protopanaxadiol saponins, PDS)，是人參中主要的活性成分之一[5]，其藥理活性范圍非常廣泛。研究顯示， 人參皂苷RH2不僅可通過多種機(jī)制抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6-8]，單獨(dú)使用時(shí)還可有效增強(qiáng)人體的免疫功能。此外，有實(shí)驗(yàn)證明PDS可通過降低大鼠血清總膽固醇并提高血清一氧化氮(nitric oxide, NO)水平來發(fā)揮保護(hù)血管內(nèi)皮和抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[9]。但是， 人參皂苷RH2在缺血性腦損傷中的作用并不明確，本研究擬通過構(gòu)建大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型，研究人參皂苷RH2對缺血性腦損傷后血管新生的作用及相關(guān)作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、材料與試劑

健康雄性SD大鼠58只，體質(zhì)量260～280 g，購自石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號為SYXK(新)2015-0002。飼養(yǎng)、手術(shù)、給藥及取材等環(huán)節(jié)均嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理的有關(guān)規(guī)定。

人參皂苷RH2粉末購自上海順勃生物工程技術(shù)有限公司；抗Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1)、核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2) 和 血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)抗體購于Santa Cruz；丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所。腦立體定向儀購自廣東省深圳瑞沃德生命科技有限公司；激光多普勒血流儀購自Perimed。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1MCAO模型的制備和分組 先將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為2組：假手術(shù)(sham)組18只和手術(shù)組40只。MCAO模型的制備采用改良Longa法[9]：術(shù)前12 h開始禁食，麻醉后將大鼠以仰臥位固定，備皮并沿頸部正中線切開皮膚，鈍性分離相關(guān)肌群后暴露右側(cè)頸總、頸內(nèi)及頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈及頸總動(dòng)脈近心端，后將線拴沿頸內(nèi)動(dòng)脈插入大腦中動(dòng)脈，推進(jìn)約18 mm后固定，縫合皮膚即可。假手術(shù)組僅在頸部正中縱行剖開后縫合。麻醉清醒后以大鼠前爪不能充分伸展或不能正常行走或行走時(shí)出現(xiàn)追尾癥則視為造模成功。最終手術(shù)組造模成功38只，依據(jù)Longa 5級評分標(biāo)準(zhǔn)和體重標(biāo)準(zhǔn)納入36只，并隨機(jī)分為模型(MCAO)組和實(shí)驗(yàn)(GS-RH2)組，每組18只。術(shù)后GS-RH2組灌服人參皂苷RH2(20 mg·kg-1·d-1)，MCAO組和sham組灌服等量的生理鹽水，連續(xù)用藥7 d。

2.2神經(jīng)功能評分 3組動(dòng)物分別于干預(yù)第1、3和7天時(shí)進(jìn)行神經(jīng)功能評分。評分標(biāo)準(zhǔn)如下[10]：無神經(jīng)功能損傷癥狀記為0分；垂直提起時(shí)損傷對側(cè)前爪不能伸直記為1分；行走時(shí)出現(xiàn)追尾癥記為2分；行走時(shí)身體向左側(cè)跌倒記為3分；不能自發(fā)行走或出現(xiàn)意識障礙記為4分。同時(shí)觀察并記錄大鼠的一般生存狀態(tài)。

2.3腦梗死體積的測量 采用TTC法測定腦梗死體積。干預(yù)結(jié)束時(shí)，將各組大鼠麻醉后，斷頭取腦組織，速凍后以前囟為基點(diǎn)做連續(xù)冠狀面切片，切片厚度為2 mm。然后將腦組織切片置于1% TTC溶液中， 37 ℃避光染色30 min。隨后置于4%多聚甲醛溶液中固定17 h。顯微鏡下觀察并計(jì)算腦梗死體積。

2.4微血管密度(microvessel density, MVD)的測定 采用免疫組化染色法測定微血管密度。具體操作方法參照SP試劑盒(購自北京中杉金橋生物有限公司)說明書進(jìn)行。CD34多克隆抗體購自北京中杉金橋生物有限公司，PBS替代 I 抗作為陰性對照(negative control，Neg)。

CD34蛋白表達(dá)于微血管內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇中，MVD計(jì)數(shù)參考Weidner等[11]報(bào)道的方法，經(jīng)CD34陽性染色定位后，由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師隨機(jī)雙盲于低倍鏡下觀察切片，確定血管最多的區(qū)域，然后用高倍鏡計(jì)數(shù)每個(gè)區(qū)域的微血管數(shù)目。每個(gè)切片計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野的微血管數(shù)，取平均值作為該樣本的MVD值。

2.5MDA含量及SOD和GSH-Px活性的檢測 各組大鼠腦組織樣本經(jīng)相應(yīng)處理后，依據(jù)南京建成生物工程研究所提供的試劑盒檢測說明書檢測MDA含量及SOD和GSH-Px的活性。

2.6Western blot檢測蛋白表達(dá)水平 取各組大鼠腦組織加適量裂解液后用勻漿器勻漿， 離心取上清即可得到各組蛋白樣品， 采用BCA試劑盒進(jìn)行定量分析，調(diào)整各組蛋白上樣量至60 μg，并加入4倍體積的上樣緩沖液，98 ℃水浴變性5 min。而后上樣并進(jìn)行8% SDS-PAGE，將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜(約90 min)，加5%脫脂牛奶室溫封閉120 min。加入相應(yīng)的 I 抗，4 ℃孵育過夜，復(fù)溫后加TBST洗滌3次，每次5 min；再加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的 II 抗，室溫孵育90 min，加TBST洗滌3次，每次10 min。于暗室中將HRP-ECL發(fā)光液灑在PVDF膜的蛋白面上激發(fā)熒光，經(jīng)壓片、顯影及定影后對所得的蛋白條帶行灰度分析。以GAPDH為內(nèi)參照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均錄入SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，計(jì)量資料行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料行卡方檢驗(yàn)或校正卡方檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Bonferroni法進(jìn)行均數(shù)組間的兩兩比較，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

結(jié) 果

1 一般狀態(tài)分析

術(shù)后第1天，各手術(shù)組大鼠精神明顯萎靡，反應(yīng)遲鈍，皮毛發(fā)暗，飲食飲水減少。術(shù)后第3～4天，各手術(shù)組大鼠活動(dòng)度依然較差，飲食飲水量少；但與模型組相比， GS-RH2組大鼠精神狀態(tài)有所好轉(zhuǎn)。至第7天，GS-RH2實(shí)驗(yàn)組大鼠精神狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，活動(dòng)自如，但仍比假手術(shù)組差。假手術(shù)組大鼠實(shí)驗(yàn)過程中整體狀態(tài)良好。

神經(jīng)功能評分結(jié)果顯示：模型組各時(shí)間點(diǎn)測得神經(jīng)功能評分均高于假手術(shù)組(P<0.05)，說明模型組大鼠已出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損；相較于模型組，給予GS-RH2干預(yù)3 d及7 d則可顯著降低神經(jīng)功能評分(P<0.05)，見表1。

表1GS-RH2對MCAO大鼠神經(jīng)功能及腦梗死體積的影響

Table 1. The effect of GS-RH2 on the neurological function and infarction volume of MCAO rats(Mean±SD.n=6)

GroupTreatmenttime(d)NeurologicalfunctionscoreInfrarctionvolume(mm3)Sham100300700MCAO12.45±0.42*59.78±3.79*32.03±0.41*56.62±3.50*72.01±0.42*54.34±3.37*GS-RH212.47±0.3958.47±3.6131.51±0.26﹟47.56±3.24﹟71.42±0.24﹟36.24±3.21﹟

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsMCAO group.

TTC法腦梗死體積測定結(jié)果顯示:假手術(shù)組并未出現(xiàn)梗死灶；而術(shù)后模型組及實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)不同程度的腦梗死；給予GS-RH2干預(yù)3 d及7 d所測得腦梗死體積顯著小于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、表1。

Figure 1. The effect of GS-RH2 on the infarction volume of MCAO rats detected by TTC assay.

圖1GS-RH2對MCAO大鼠腦梗死體積的影響

2 微血管密度分析

免疫組化結(jié)果顯示，隨生存時(shí)間的延長，假手術(shù)組MVD值基本無變化。手術(shù)后第1天模型組MVD值與假手術(shù)組無顯著差異，第3天時(shí)顯著上升，但隨生存時(shí)間的延長，MVD值呈現(xiàn)下降的趨勢。GS-RH2組MVD值隨生存時(shí)間的延長呈上升趨勢，且干預(yù)7 d時(shí)所測得MVD值顯著高于模型組(P<0.05)。結(jié)果提示GS-RH2可促進(jìn)MCAO大鼠血管新生，見圖2、表2。

Figure 2. The effect of GS-RH2 on the microvessel density of MCAO rats detected by immunohistochemical staining (×400).

圖2免疫組化法測定GS-RH2對MCAO大鼠微血管密度的影響

表2GS-RH2對MCAO大鼠微血管密度的影響

Table 2. The effect of GS-RH2 on the microvessel density of MCAO rats (Mean±SD.n=6)

GroupTimeafterGS-RH2treatment1d3d7dSham14.52±2.0713.42±1.9813.58±2.01MCAO14.75±2.1420.51±2.34*16.33±2.72GS-RH214.69±2.1123.26±2.6424.73±2.67﹟

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsMCAO group.

3 腦組織氧化應(yīng)激狀態(tài)分析

MDA含量分析結(jié)果顯示，各時(shí)間點(diǎn)模型組的MDA含量均顯著高于假手術(shù)組，且隨生存時(shí)間的延長，模型組MDA含量呈輕度下降的趨勢；給予GS-RH2干預(yù)7 d可顯著降低腦組織中MDA的含量(P<0.05)。SOD及GSH-Px的活性分析結(jié)果顯示，各時(shí)間點(diǎn)模型組的SOD及GSH-Px的活性均顯著低于假手術(shù)組，且隨生存時(shí)間的延長，模型組SOD及GSH-Px的活性呈輕度上升的趨勢；給予GS-RH2干預(yù)7 d可顯著增加腦組織中SOD及GSH-Px的活性。結(jié)果提示GS-RH2可改善MCAO大鼠腦組織的氧化應(yīng)激狀態(tài)，見圖3。

Figure 3. The effect of GS-RH2 on oxidative stress of MCAO rats. Mean±SD.n=6.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsMCAO group.

圖3GS-RH2對MCAO大鼠氧化應(yīng)激水平的影響

4 腦組織Keap1/Nrf2信號通路的活性分析

為進(jìn)一步探討GS-RH2調(diào)節(jié)MCAO大鼠腦組織氧化應(yīng)激水平的作用機(jī)制，我們于實(shí)驗(yàn)結(jié)束即干預(yù)7 d時(shí)，取部分腦組織分析了Keap1/Nrf2信號通路的活性。Western blot 的結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腦組織中有Keap1、Nrf2及HO-1的基礎(chǔ)表達(dá)；損傷7 d時(shí)，模型組大鼠腦組織中Keap1蛋白表達(dá)減少，Nrf2及HO-1的蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；相較于模型組，GS-RH2干預(yù)可使各蛋白表達(dá)的變化趨勢更顯著(P<0.05)。結(jié)果提示GS-RH2可激活Keap1/Nrf2信號通路，見圖4。

討 論

線栓法構(gòu)建的局灶性腦缺血模型是目前研究腦缺血性疾病的公認(rèn)理想模型，本實(shí)驗(yàn)中我們采用SD大鼠建立線栓法MCAO模型，經(jīng)神經(jīng)功能評分及腦梗死體積評定確認(rèn)模型構(gòu)建成功，并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。腦缺血性損傷后，血管新生是改善局部血流供應(yīng)及損傷修復(fù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?；趥鹘y(tǒng)中醫(yī)藥的發(fā)展及其在復(fù)雜疾病診療上的優(yōu)勢，本研究選取人參皂苷RH2這一活性成分，分析了其在MCAO大鼠血管新生中的作用。

Figure 4. The effect of GS-RH2 on Keap1/Nrf2 signaling pathway of MCAO rats. Mean±SD.n=6.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsMCAO group.

圖4GS-RH2對MCAO大鼠Keap1/Nrf2信號通路的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，給予人參皂苷RH2干預(yù)7 d之后，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物神經(jīng)行為癥狀得到明顯改善，腦梗死體積顯著減小，神經(jīng)功能評分顯著降低。結(jié)果表明人參皂苷RH2可顯著改善MCAO大鼠腦缺血所致神經(jīng)損傷。接著我們通過測定微血管密度來評價(jià)人參皂苷RH2對MCAO大鼠血管新生的影響，結(jié)果顯示， 與模型組相比，給予人參皂苷RH2干預(yù)可顯著升高M(jìn)VD值，表明人生皂苷RH2可促進(jìn)MCAO大鼠血管新生。

腦組織代謝旺盛，耗氧量極高，局部缺血易致脂質(zhì)過氧化的發(fā)生，這也是缺血后腦損傷一個(gè)重要原因。早期在研究人參皂苷RH2對血管內(nèi)皮的保護(hù)作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用人參皂苷RH2可降低血清中MDA的含量，同時(shí)提高SOD的活性，具有抗脂質(zhì)過氧化的作用[9]。故而我們進(jìn)一步檢測了該過程中MDA的含量及SOD和GSH-Px的活性，以評價(jià)人參皂苷RH2在調(diào)控MCAO大鼠血管新生的過程中是否涉及到氧化應(yīng)激狀態(tài)的改變。結(jié)果顯示， 相較于模型組，給予人參皂苷RH2干預(yù)7 d可顯著增加腦組織中SOD及GSH-Px的活性，并降低MDA的含量。這一結(jié)果表明人生皂苷RH2可改善MCAO大鼠腦組織的氧化應(yīng)激狀態(tài)。機(jī)體中Nrf2是抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子[12-13]。研究表明，靜息態(tài)下，Nrf2與Keap1結(jié)合而處于失活態(tài)，并可通過泛素-蛋白酶體途徑迅速降解；在接受相關(guān)信號刺激后，Nrf2則從Keap1上解離、轉(zhuǎn)位后進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控一系列抗氧化酶的表達(dá)[12, 14-15]；其中血紅素加氧酶則是與神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用關(guān)系密切的酶系[16-18]。故而我們進(jìn)一步分析了人參皂苷RH2對Keap1、 Nrf2和HO-1表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，相較于模型組，給予人參皂苷RH2可顯著減少大鼠腦組織中Keap1蛋白的表達(dá)，而促進(jìn)Nrf2及HO-1的蛋白表達(dá)， 提示Keap1/Nrf2抗氧化信號通路可能參與了人生皂苷RH2調(diào)控MCAO大鼠血管新生的過程，至于其上下游涉及的其它信號分子及通路還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，人參皂苷RH2可促進(jìn)MCAO大鼠血管新生，其作用機(jī)制可能與激活Keap1/Nrf2信號通路，提高抗氧化酶的活性從而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

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